Summary
En este protocolo, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejido blando para la prueba (neo)terapias adyuvantees.
Abstract
La cirugía es a menudo el primer tratamiento para muchos tumores sólidos. Sin embargo, las recaídas locales ocurren con frecuencia después de la resección primaria del tumor, a pesar de las terapias adyuvante o neoadyuvante. Esto ocurre cuando los márgenes quirúrgicos no son suficientemente libres de tumores, lo que resulta en células cancerosas residuales. Desde una perspectiva biológica e inmunológica, la cirugía no es un evento nulo; el ambiente de cicatrización de heridas es conocido por inducir vías pro y anti-tumorigénicas. Como consecuencia, los modelos preclínicos para el desarrollo de fármacos destinados a prevenir la resección local deben incorporar resección quirúrgica al probar nuevas terapias (neo)adyuvante, para modelar los entornos clínicos en pacientes tratados con cirugía.
Aquí, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta del sarcoma de tejido blando WEHI 164 que permite probar terapias (neo)adyuvante en el entorno de una respuesta de cicatrización de heridas. En este modelo, se extirpa el 50% o 75% del tumor, dejando atrás algunos tejidos cancerosos in situ para modelar la enfermedad residual bruta después de la cirugía en el entorno clínico. Este modelo permite probar terapias en el contexto de la cirugía mientras se considera la respuesta de cicatrización de heridas, que puede afectar la eficacia de (neo)tratamientos adyuvantes. La resección quirúrgica incompleta da como resultado un recrecimiento reproducible del tumor en todos los ratones en ausencia de terapia adyuvante. El tratamiento adyuvante con bloqueo del punto de control reduce el crecimiento del tumor. Por lo tanto, este modelo es adecuado para las terapias de prueba en el contexto de la cirugía de desbulado y su respuesta de cicatrización de heridas asociada y se puede extender a otros tipos de cáncer sólido.
Introduction
La cirugía sigue siendo la principal opción de tratamiento para muchos tumores sólidos1,incluyendo el sarcoma de tejidos blandos2,3. A pesar de las mejoras en las técnicas de cirugía oncológica, y las combinaciones con (neo)terapias adyuvantes, todavía existe un alto riesgo de recaída del cáncer y metástasis después de la resección primaria del tumor4,,5. En el sarcoma de tejidos blandos, las recaídas ocurren particularmente locoregionalmente, en el lugar de la cirugía, lo que resulta en un aumento de la morbilidad y mortalidad. En el entorno clínico, puede ser difícil obtener márgenes lo suficientemente amplios (por ejemplo, debido a restricciones anatómicas), lo que resulta en una resección incompleta y una posterior recurrencia tumoral6. Se sabe que el estrés quirúrgico y el proceso posterior de cicatrización de heridas crean un microambiente tumoral inmunosupresor favorable para la recurrencia tumoral7,,8. Por lo tanto, el descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias para el sarcoma de tejidos blandos, particularmente las inmunoterapias, deberían tener en cuenta idealmente la respuesta quirúrgica de cicatrización de heridas.
La mayoría de los estudios preclínicos para terapias adyuvantes se llevan a cabo inicialmente utilizando modelos de ratón singénero subcutáneo o xenotrasplante, sin incorporar el estrés quirúrgico y la respuesta de cicatrización de heridas9,,10. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de sarcoma de tejido blando de ratón subcutáneo singéneo que incorpora una resección quirúrgica incompleta. WeHI 164 células de fibrosarcoma se inoculan por vía subcutánea, y una vez que se establecen los tumores, extirpamos 50-75% del volumen tumoral (Figura 1A-E). Los tumores rea cultivaron constantemente a partir del tumor restante. Este modelo permite probar terapias adyuvantes teniendo en cuenta el efecto del estrés quirúrgico y la cicatrización de heridas. Modelos quirúrgicos similares de resección incompleta se han utilizado en varios estudios por varios grupos y se ha encontrado que son reproducibles y eficaces11,12,13. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de este protocolo.
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Protocol
Los animales utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia Occidental). Los animales fueron mantenidos bajo condiciones estándar libres de patógenos en el Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo aprobado por el Comité de ética animal del Instituto Harry Perkins de Investigación Médica. En estos experimentos se utilizaron ratones BALB/c de 8-12 semanas de edad. La línea celular de fibrosarcoma WEHI 164 se obtuvo de CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inoculación de células
- Preparación de células y animales
- Asegúrese de que la línea celular se mantiene en el medio recomendado. Por ejemplo, mantenga la línea celular WEHI 164 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio complementado con 2 mM de L-glutamina, 10% suero bovino fetal, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penicilina, y 100 g/mL estreptocincito.
NOTA: Las células de paso al menos 3 y hasta 5 veces después de ser retiradas del almacenamiento criogénico. Para garantizar una viabilidad celular óptima, las células deben dividirse cuando están entre 70-80% confluentes. Las líneas celulares tumorales deben analizarse para detectar micoplasma, ya que la infección puede alterar el crecimiento celular e influir en la respuesta inmunitaria in vivo. - Un día antes de la inoculación, afeite los ratones en el flanco inferior derecho usando pinzas.
NOTA: En este experimento se utilizaron ratones BALB/c hembras, de entre 8-12 semanas de peso normal (16 -22 gramos). - El día de la inoculación, cosecha WEHI 164 células cuando 70-80% confluen por tripsinización.
- Aspirar el medio de cultivo de los matraces de cultivo tisular y luego añadir solución tampón de fosfato estéril (1x PBS), para eliminar los restos de suero bovino fetal (FBS).
- Aspirar el PBS de los matraces de cultivo de tejido. Añadir 3 ml de 0,05% de trippsina (para un matraz T75) y luego girar el matraz de modo que toda la superficie del matraz con células esté cubierta por trippsina.
- Incubar el matraz a 37oC, 5% copiloto de CO2 durante 3 min. Compruebe periódicamente las células, tocando en los lados del matraz para ver si las células se han desalojado.
- Retire los matraces de la incubadora de cultivo celular y añada 5 ml de medios complementados con FBS para neutralizar la tripina.
NOTA: No deje las células en tripina más tiempo del necesario, ya que esto puede dañar las células y conducir a una baja viabilidad celular. - Suspensión de pipeta varias veces para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica.
- Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
- Lave las células tres veces en 1x PBS.
- Resuspendir las células en 50 ml de estéril 1x PBS y lavar las células por la suspensión celular de pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
- Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en 15 ml de 1 PBS estéril. Lave las células pipeteando la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
- Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en exactamente 10 ml de 1 PBS estéril. Lave las células como en el paso 1.1.4.2 y transfiera una pequeña cantidad (aproximadamente 100 l) de suspensión celular a un tubo centrífugo para el recuento. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.
- Determine el número de celda mediante el método de exclusión azul de Trypan mediante un hemocitoómetro o un contador de celdas automatizado. Células resuspendidas en 1 PBS estéril a una concentración de 5 x 106 células/ml. Mantenga la suspensión celular sobre hielo.
NOTA: La viabilidad de las células tumorales debe ser igual o superior al 80 % para garantizar un crecimiento tumoral reproducible.
- Asegúrese de que la línea celular se mantiene en el medio recomendado. Por ejemplo, mantenga la línea celular WEHI 164 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio complementado con 2 mM de L-glutamina, 10% suero bovino fetal, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penicilina, y 100 g/mL estreptocincito.
- Inoculación subcutánea
- Mezcle bien la suspensión celular y llene una jeringa con una aguja de 26 G con 100 ml de suspensión celular (5 x 105 células) en PBS estéril 1x. Repita la mezcla de células antes de cargar la siguiente jeringa.
NOTA: Mantenga las células sobre hielo durante todo el procedimiento para mantener la viabilidad. - Sujete el ratón adecuadamente, asegurando el acceso al flanco inferior derecho. Inocular el ratón por vía subcutánea en el flanco inferior derecho afeitado.
NOTA: Asegúrese de que la inoculación no esté en el peritoneo levantando ligeramente la aguja, que debe ser visible debajo de la piel. Se debe formar un bulto similar a una burbuja debajo de la piel después de la inoculación. - Monitorear ratones según lo requiera la aprobación ética aplicable y realizar resección quirúrgica cuando los tumores hayan crecido a un tamaño de aproximadamente 50 mm2.
- Mezcle bien la suspensión celular y llene una jeringa con una aguja de 26 G con 100 ml de suspensión celular (5 x 105 células) en PBS estéril 1x. Repita la mezcla de células antes de cargar la siguiente jeringa.
2. Resección quirúrgica parcial del tumor
NOTA: Este protocolo requiere DOS investigadores; uno para procedimientos quirúrgicos (SURGEON) y otro para el monitoreo del ratón (ASSISTANT).
- Configuración de la cirugía
- En el día 12 después de la inoculación, cuando los tumores han alcanzado un tamaño de aproximadamente 50 mm2, ratones de dosis con 100 l (0,1 mg/kg) de buprenorfina s.c. en el escrúpulo del cuello, 30 minutos antes de la cirugía.
- Configure el área quirúrgica con una almohadilla de calor cubierta con una capa de banco y configure un cono nasal para la anestesia. Esterilice las herramientas quirúrgicas antes de su uso, y entre cada animal usando un esterilizador de cuentas de calor, permitiendo que las herramientas se enfríen antes de su uso. Tener el siguiente equipo quirúrgico limpio y al alcance de la mano: clorhexidina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos fórceps curvos, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip, recargas de clip(Figura 2A, 2B).
- Caliente la cámara de calentamiento a 37 oC y configure otra almohadilla de calor para la recuperación(Figura 2C). Coloque herramientas esterilizadas en una superficie estéril como almohadillas autoclaves.
- Anestesia
- Coloque el ratón en la cámara de inducción y anfise el ratón con 4% de isoflurano (4% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) hasta que la frecuencia respiratoria se desacelere a aproximadamente 60 respiraciones por minuto (1 por segundo) (esto suele tardar <1 min).
NOTA: No deje el ratón en la cámara durante demasiado tiempo, ya que eso puede conducir a asfixia y muerte. Sólo tiene un ratón bajo anestesia a la vez. - Transfiera el ratón a la almohadilla de calor en la mesa de cirugía, coloque el ratón con su nariz en el cono nasal y mantenga el estado anestésico con 3-4% de isoflurano en oxígeno 100% a un caudal de 0,5 L/min. Monitoree la frecuencia respiratoria para asegurarse de que se mantiene la profundidad de la anestesia.
NOTA: El ASISTENTE debe controlar la respiración del ratón durante toda la cirugía para asegurarse de que se mantiene el nivel correcto de anestesia. Reduzca la concentración anestésica si la respiración se vuelve demasiado lenta o aumente la concentración si la profundidad de la anestesia es demasiado superficial. Si el ratón comienza a jadear, retire el ratón del cono nasal, disminuya la concentración anestésica y espere hasta que la respiración se normalice antes de volver a colocar el cono nasal. - Realice una "prueba de pellizco" y una "prueba de reflejo corneal"14 para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
NOTA: El movimiento de cualquier parte del ratón es una indicación de que el ratón no está completamente anestesiado. El animal debe recibir inmediatamente anestesia adicional aumentando la concentración anestésica. - Cubra los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular.
- Coloque el ratón en la cámara de inducción y anfise el ratón con 4% de isoflurano (4% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) hasta que la frecuencia respiratoria se desacelere a aproximadamente 60 respiraciones por minuto (1 por segundo) (esto suele tardar <1 min).
- Procedimiento quirúrgico (SURGEON)
- Frotar el área quirúrgica 3 veces con clorhexidina alcohólica. Usando fórceps y un par de tijeras, haga una incisión recta de 1 cm a lo largo del lado dorsal, a 3 mm del tumor(Figura 3A, 3B).
NOTA: Estandarizar la incisión a 1 cm en cada ratón (usando una regla) permite una evaluación uniforme de la cicatrización de heridas entre ratones. La localización de la incisión a 3 mm del tumor permite la posterior terapia adyuvante intratumoral sin fugas de la herida. - Con pinzas, retira la facia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo. El tumor subcutáneo normalmente se une al lado de la piel.
- Abra la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas, e "invierta" el tumor de modo que sea visible en el exterior(Figura 3C, 3D).
NOTA: La sección del tumor a desbultar debe estar más cerca de la abertura, para tener suficiente piel para cerrar la herida. Tenga cuidado de no cortar la piel al extirpar el tumor. - Usando un par de tijeras, corta la cápsula tumoral de la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.
- Para una cirugía de desbultado del 50%, corte a través de la mitad del tumor. Usando fórceps curvos, recoge la sección del tumor que se va a extirpar (50%); recoge los restos de la zona desbulada.
- Para el 75% de debulk, realizar un 50% de debulk tumor como en la parte 2.3.5 anterior. Luego corta la mitad del 50% restante del tumor y recoge el 25% del tumor, usando fórceps curvos como se describió anteriormente.
- Frotar el área quirúrgica 3 veces con clorhexidina alcohólica. Usando fórceps y un par de tijeras, haga una incisión recta de 1 cm a lo largo del lado dorsal, a 3 mm del tumor(Figura 3A, 3B).
- Cierre del sitio quirúrgico
- Coloque el tumor restante debajo de la piel, y usando fórceps, tire de los colgajos de la piel juntos y alinee la piel a lo largo de la herida.
- Sujete la piel unida a 5 mm del borde de la herida y utilice clips quirúrgicos para cerrar la herida, comenzando en el lado más cercano a los fórceps. Aplique tantos clips como sea necesario para asegurarse de que no se exponga ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con separaciones de 2 mm entre clips.
NOTA: Si algún clip no está bien aplicado, elimínelo con un removedor de clip y sustitúyalo por clips nuevos.
- Recuperación de ratones (ASSISTANT)
- Permita que los ratones se recuperen poniéndolos en la cámara de calentamiento caliente (37 oC).
- Coloque la jaula del ratón en la almohadilla de calor. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado del anestésico (despierto y caminando) y luego vuelva a colocar a los ratones en la jaula. Deje la jaula en la almohadilla de calor durante otros 10 minutos, hasta que los ratones se hayan vuelto más activos.
- Dale a los ratones alimentos húmedos y suaves. Supervise a los ratones 1 hora después de la cirugía para la recuperación y asegúrese de que los clips permanezcan en su lugar. Asegúrese de que la jaula esté a la mitad de la almohadilla de calor para permitir que los animales autorregular la temperatura sin supervisión.
- Dosis en ratones con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 ml por vía subcutánea en el escrúpulo del cuello), 6-8 horas después de la cirugía (al final del día). Monitoree los ratones a primera hora de la mañana siguiente y dosis de ratones de nuevo con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 l por vía subcutánea en el cuello). Dar más alimentos húmedos según sea necesario.
- Monitoree ratones diariamente durante los próximos siete días. Los clips se pueden quitar después de siete días con el removedor de clip.
- Tratamiento adyuvante o neoadyuvante
- Tratar los ratones perioperatorios con (neo)adyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés.
- Por ejemplo, tratar ratones con una dosis de 100 g de anti-CTLA-4 intraperitonealmente (i.p.) el día 15 después de la inoculación, o con tres dosis de 200 g anti-PD-1 i.p. el día 15, 17 y 19 después de la inoculación.
- Controles experimentales
- Cuando utilice este modelo para evaluar los efectos de la inflamación/ cicatrización de heridas, considere el uso de los siguientes grupos de control: 1) Control sin cirugía (los tratamientos todavía se pueden administrar por vía intratumoal); 2) Control de la cirugía Sham: Se hace una incisión quirúrgica en la piel; el tumor es manipulado y expuesto, pero no se extirpa ningún tejido tumoral; la herida está cerrada con clips.
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Representative Results
El crecimiento del tumor a un tamaño de 50 mm2 es un tamaño ideal para el debulk parcial. La resección quirúrgica incompleta de 50 mm2 tumores da como resultado un recrecimiento reproducible del 100% (n-5) de los tumores en ausencia de inmunoterapia adyuvante (Figura 4A). A continuación utilizamos el modelo para probar inmunoterapias adyuvante utilizando anticuerpos contra moléculas de punto de control Citotóxico T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) y Programmed Death Receptor 1 (PD-1). El tratamiento de ratones con anti-CTLA-4 o anti-PD-1 dio lugar a una tasa de curación del 80% y del 25% (n-4-5 por grupo), respectivamente(Figura 4B, 4C). La respuesta con anti-PD-1 ofrece la oportunidad de probar combinaciones novedosas para mejorar aún más la tasa de respuesta.
Figura 1: Diagrama esquemático de la resección quirúrgica parcial del tumor. (A) Los ratones BALB/c se inoculan con 5 x 105 células WEHI-164 en el flanco inferior derecho. (B) Cuando el tumor alcanza los 50 mm2,la cirugía puede comenzar. (C) El tumor se resecta parcialmente (50 % mostrado). (D) El sitio quirúrgico está cerrado con clips. (E) El tratamiento adyuvante puede administrarse, por vía intravenosa, intraperitoneal (mostrada) o intratumoralmente en la zona de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de la operación de cirugía. (A) Toda una imagen de la cirugía configurada que muestra las herramientas quirúrgicas (enumeradas en el paso 2.1) y la máquina anestésica. (B) Una imagen instantánea de la mesa quirúrgica que muestra todos los materiales al alcance de la mano. (C) Una cámara de calefacción y una almohadilla de calentamiento para la recuperación del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de la técnica parcial de debulk tumor. (A) Un ratón completamente anestesiado con un tumor de 50 mm2 de tamaño antes de la cirugía. (B) Sitio de la incisión a 3 mm del tumor; Incisión de 1 cm. (C-D) Apertura de la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas, e "invirtiendo" el tumor para que sea visible en el exterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Recrecimiento del tumor tras la resección e inmunoterapia incompletas del tumor. (A) Curvas de recrecimiento tumoral de tumores WEHI-164 parcialmente resecados en ausencia de inmunoterapia adyuvante. (B-C) Recrecimiento tumoral después de la cirugía y tratamiento adyuvante con anti-CTLA-4 (B) o anti-PD1 (C). La línea punteada indica el día de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Proporcionamos un protocolo para un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejidos blandos para probar terapias perioperatorias. También estandarizamos la incisión quirúrgica para permitir la evaluación de la cicatrización de heridas entre ratones después del tratamiento.
La colocación de tumores es una parte importante de este protocolo. Hemos optado por un modelo tumoral subcutáneo para permitir un fácil acceso quirúrgico al sitio del tumor y la administración de terapias locales con una carga mínima para los ratones. También es importante asegurarse de que los tumores crezcan en el espacio subcutáneo y no dentro del peritoneo, lo que puede resultar en morbilidad y mortalidad inesperadas.
Al elegir una línea celular tumoral para este protocolo, recomendamos que las células cuando crecen in vivo formen una masa sólida (por ejemplo, modelo WEHI-164), en lugar de una masa semisólida (como el modelo B16) ya que es técnicamente difícil resecar parcialmente. Además, si el tumor comienza a crecer a través de la piel (generalmente se observa en tumores mayores de 100 mm2),no se recomienda el desbulado, ya que la piel puede volverse necrótica y no sanar bien después de la cirugía. Hemos superado este problema desbultando tumores una vez que alcanzan 50 mm2 de tamaño.
Como nuestro modelo se puede utilizar para evaluar el efecto de la cicatrización de heridas en la terapia, proponemos un grupo de control/falso como comparación. El control puede ser tumor inalterado, o cirugía falsa que sólo tendría la incisión de la piel, la exposición del tumor y el cierre de la herida sin debulk tumor parcial. Este grupo de control falso podría utilizarse al discernir el efecto de la inflamación inducida por la cirugía y la cicatrización de heridas del debulk parcial en el resultado del tratamiento.
Para una cirugía de desbultado parcial exitosa, es necesario considerar algunos puntos técnicos. Un aspecto importante es la correcta implantación y crecimiento del tumor. Los tumores deben implantarse en el flanco inferior derecho, lejos de la pata trasera. Los tumores que se implantan demasiado cerca de la pata trasera pueden interferir con su capacidad para caminar y pueden resultar en una fuerza adicional en los clips haciendo que se aflojen. Además, la consistencia en el tamaño del tumor es fundamental para evitar la variabilidad en el porcentaje relativo de desbultar. Elegimos realizar cirugía con tumores que tienen un tamaño de 50 mm2,para hacer la cirugía técnicamente sencilla, aunque prevemos que la resección parcial en tumores más pequeños es factible. Para evitar la incoherencia en el tamaño del tumor, la línea celular utilizada debe ser pasajeada siguiendo las técnicas de cultivo celular estándar apropiadas, y el investigador necesita estar adecuadamente capacitado en la técnica de inoculación tumoral adecuada. Al extender este protocolo a otros modelos de tumores subcutáneos, las características físicas del tumor son de importancia. Por ejemplo, encontramos que las líneas celulares que dan lugar a tumores gelatinosos blandos (por ejemplo, rabdomiosarcoma M3-9-M y B16 melanoma15)son técnicamente difíciles de desbultar.
También hay puntos técnicos que deben ser considerados durante la cirugía. Los ratones necesitan ser anestesiados adecuadamente para evitar el movimiento durante el procedimiento. Aparte del inpost que soportará inadecuadamente los ratones anestesiados, cualquier movimiento de ratones durante el procedimiento puede dificultar la resección quirúrgica, lo que resulta en una variabilidad en el tamaño del tumor extirpado entre ratones. Además, la frecuencia respiratoria del ratón debe controlarse cuidadosamente durante la cirugía, la concentración de isoflurano debe ajustarse para mantener la profundidad adecuada de la anestesia. Por lo tanto, siempre se necesita un asistente durante el procedimiento quirúrgico para controlar la frecuencia respiratoria durante la cirugía, y para asegurar un nivel adecuado de anestesia. El tamaño de la incisión debe ser consistente para evitar la variabilidad en la respuesta de cicatrización de la herida. Encontramos que una incisión de 1-1,5 cm es suficiente para el desbulado tumoral, con una mínima probabilidad de dehiscencia de la herida.
Nuestro modelo de resección parcial imita la enfermedad residual que queda después de la cirugía como se ve en el entorno clínico de muchos tumores sólidos y ofrece ventajas sobre los modelos tradicionales de ratón singéneco teniendo en cuenta el efecto de la cicatrización quirúrgica de heridas. Además, los modelos tradicionales existentes de cirugía han utilizado la resección completa del tumor, que no siempre resulta en la recurrencia del tumor16. Otros investigadores han utilizado con éxito modelos de resección parcial utilizando otras líneas celulares de cáncer11,12,13, subrayando la robustez de este método. Además, se ha demostrado que la resección parcial, pero no la resección completa, dio lugar a la memoria inmune antitumotral protectora cuando se administra la terapia adyuvante12 que se atribuyó a la persistencia de antígenos del tumor residual.
Este modelo está diseñado para estudiar el efecto de la inflamación y la cicatrización de heridas en la terapia. Nuestro enfoque de desbulado se asemeja clínicamente a situaciones clínicas en las que la enfermedad residual grave se deja atrás después de la cirugía (resección R2), en lugar de resección macroscópicamente completa con enfermedad residual microscópica (resección R1). Por ejemplo, la resección quirúrgica en el sarcoma invasivo de tejidos blandos puede dar lugar a márgenes positivos cuando el tumor se encuentra junto a estructuras críticas como nervios, arterias u órganos adyacentes, excluyendo la resección completa con márgenes anchos17. Se han publicado modelos de cirugía para la resección que dan como resultado márgenes positivos microscópicos13; nuestro protocolo se puede utilizar para estudiar el efecto de la respuesta de curación de heridas en la terapia cuando hay una enfermedad residual macroscópica.
Una limitación de nuestro modelo es que no da lugar a recaídas distantes y micrometasisia, que es común después de la cirugía en tumores sólidos como el cáncer de mama o el cáncer de páncreas. Otros modelos de cirugía, como el cáncer de mama murino modelo 4T118,19,20 o modelos murinos demetástasisde cáncer mamario de novo21 son más adecuados para investigar la resección sistémica después de la resección local. Otra limitación es que este protocolo es para modelos subcutáneos y por lo tanto no permite la evaluación de la patología específica del tejido. Para ello, los modelos de ratón tumoral ortotópico son apropiados7,22,23. Sin embargo, los modelos ortotópicos son más desafiantes y generalmente implican un mayor inpost a los ratones, y son más laboriosos y costosos22. Los modelos subcutáneos son adecuados para evaluar los efectos de las terapias (neo-)adyuvantes, ya sea sistémica o localmente, en la recaída local del cáncer, de una manera rentable y relativamente alta con un mínimo inpost a los animales.
La resección parcial incompleta como se describe en este protocolo es útil para probar terapias adyuvantes al tiempo que incorpora la cicatrización quirúrgica de heridas como un factor, una variable que a menudo se pasa por alto.
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Disclosures
Sin revelaciones.
Acknowledgments
¡Este trabajo está respaldado por subvenciones del Calcetín al Sarcoma! Fundación, la Asociación de Sarcoma de Australia y Nueva Zelanda, la Fundación para la Investigación de la Leucemia y el Cáncer Infantil y la Filantropía Perpetua. W.J.L cuenta con el apoyo de una beca Simon Lee y una beca de investigación del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica, y el Consejo del Cáncer WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
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