Summary
I denne protokollen beskriver vi en musemodell av ufullstendig kirurgisk reseksjon av bløtvevssarkom for testing (neo)adjuvant terapi.
Abstract
Kirurgi er ofte den første behandlingen for mange solide svulster. Imidlertid oppstår lokale tilbakefall ofte etter primær tumorreseksjon, til tross for adjuvant eller neo-adjuvant terapi. Dette skjer når kirurgiske marginer er utilstrekkelig tumorfrie, noe som resulterer i gjenværende kreftceller. Fra et biologisk og immunologisk perspektiv er kirurgi ikke en nullhendelse; sårhelingsmiljøet er kjent for å indusere både pro- og anti-tumorigenic veier. Som en konsekvens bør prekliniske modeller for legemiddelutvikling som tar sikte på å forhindre lokal tilbakefall, innlemme kirurgisk reseksjon ved testing av nye (neo)adjuvant terapier, for å modellere de kliniske innstillingene hos pasienter behandlet med kirurgi.
Her beskriver vi en musemodell av ufullstendig kirurgisk reseksjon av WEHI 164 bløtvevssarkom som gjør det mulig å teste (neo)adjuvant terapi i innstillingen av en sårhelingsrespons. I denne modellen fjernes 50% eller 75% av svulsten, og etterlater seg litt kreftvev in situ for å modellere brutto gjenværende sykdom etter operasjonen i klinisk setting. Denne modellen tillater testing terapi i sammenheng med kirurgi samtidig vurderer sårheling respons, som kan påvirke effekten av (neo)adjuvant behandlinger. Den ufullstendige kirurgiske reseksjonen resulterer i reproduserbar gjenvekst av svulsten hos alle mus i fravær av adjuvant terapi. Adjuvant behandling med sjekkpunktblokade resulterer i redusert tumorgjenvekst. Denne modellen er dermed hensiktsmessig for testing terapi i sammenheng med debulking kirurgi og tilhørende sårheling respons og kan utvides til andre typer solid kreft.
Introduction
Kirurgi er fortsatt det viktigste behandlingsalternativet for mange faste svulster1, inkludert bløtvev sarkom2,3. Til tross for forbedringer i kreft kirurgi teknikker, og kombinasjoner med (neo)adjuvant terapi, det er fortsatt en høy risiko for kreft tilbakefall og metastase etter primære tumor reseksjon4,5. I bløtvev sarkom forekommer tilbakefall spesielt locoregionalt, på operasjonsstedet, noe som resulterer i økt sykelighet og dødelighet. I den kliniske innstillingen kan det være vanskelig å oppnå brede nok marginer (f.eks. på grunn av anatomiske begrensninger), noe som resulterer i ufullstendig reseksjon og påfølgende tumorfall6. Kirurgisk stress og den påfølgende prosessen med sårheling er kjent for å skape en immunsuppressiv tumor mikromiljø gunstig for tumor tilbakefall7,8. Derfor bør oppdagelsen og utviklingen av nye behandlinger for bløtvevssarkom, spesielt immunterapier, ideelt sett ta hensyn til den kirurgiske sårhelingsresponsen.
De fleste prekliniske studier for adjuvant terapi utføres i utgangspunktet ved hjelp av subkutane syngeneic eller xenotransplante musmodeller, uten å innlemme kirurgisk stress og sårhelingsrespons9,10. Derfor utviklet vi en syngeneic subkutan mus bløtvev sarkom modell som omfatter ufullstendig kirurgisk reseksjon. WEHI 164 fibrosarcoma celler er inokulert subkutuell, og når svulster er etablert, fjerner vi 50-75% av tumor bulk (Figur 1A-E). Svulster konsekvent re-vokse fra den gjenværende svulsten. Denne modellen gjør det mulig å teste adjuvant terapi mens du vurderer effekten av kirurgisk stress og sårheling. Lignende kirurgiske modeller av ufullstendig reseksjon har blitt brukt i en rekke studier av flere grupper og funnet å være reproduserbare og effektive11,12,13. Her gir vi en detaljert beskrivelse av denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr som brukes i disse eksperimentene ble hentet fra Animal Resource Centre (Perth, Western Australia). Dyr ble opprettholdt under standard patogenfrie forhold ved Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Alle eksperimenter ble utført etter protokollen som godkjent av Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c mus i alderen 8-12 år ble brukt i disse eksperimentene. WEHI 164 fibrosarcoma cellelinjen ble hentet fra CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inokulasjon av celler
- Utarbeidelse av celler og dyr
- Kontroller at cellelinjen vedlikeholdes i det anbefalte mediet. For eksempel opprettholde WEHI 164 cellelinje i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 2 mM L-glutamin, 10% foster storfe serum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin, og 100 μg / mLptot.
MERK: Passasjeceller minst 3 og opptil 5 ganger etter å ha blitt fjernet fra kryogen lagring. For å sikre optimal celleleverbarhet, bør cellene deles når de er mellom 70-80% samløpet. Tumorcellelinjer bør testes for mykoplasma, da infeksjon kan endre celleveksten og påvirke immunresponsen in vivo. - En dag før inokulasjon barberer du mus på nedre høyre flanke ved hjelp av clippers.
MERK: Kvinnelige BALB/c-mus, i alderen 8-12 uker, med normal vekt (16 -22 gram) ble brukt i dette eksperimentet. - På inokulasjonsdagen høster du WEHI 164 celler når 70-80% samløpet ved trypsinisering.
- Aspirer kulturmediet fra vevskulturkolber og tilsett deretter steril fosfatbufret oppløsning (1x PBS), for å fjerne gjenværende spor av fosterhusserum (FBS).
- Aspirer PBS fra vevskulturflaskene. Tilsett 3 ml 0,05% trypsin (for en T75 kolbe) og virvle deretter kolben slik at hele overflaten av kolbe med celler er dekket av trypsin.
- Inkuber kolben ved 37 °C, 5 % CO2-inkubator i 3 min. Kontroller cellene med jevne mellomrom ved å trykke på sidene av kolben for å se om cellene har løsnet.
- Fjern kolber fra cellekulturinkubatoren og tilsett 5 ml medier supplert med FBS for å nøytralisere trypsin.
MERK: Ikke la celler være i trypsin lenger enn nødvendig, da dette kan skade celler og føre til lav celle levedyktighet. - Pipet suspensjon flere ganger for å få en enkelt celle suspensjon. Overfør cellesuspensjon til et konisk sentrifugerør.
- Pelletceller ved å spinne ved 350 x g i 3 min.
- Vask cellene tre ganger i 1x PBS.
- Resuspendceller i 50 ml sterile 1x PBS og vask cellene ved å pipeceller opp og ned. Pelletceller ved å spinne ved 350 x g i 3 min.
- Aspirer de supernatante og resuspendcellene i 15 ml sterile 1x PBS. Vask cellene ved å pipeceller opp og ned. Pelletceller ved å spinne ved 350 x g i 3 min.
- Aspirer de supernatante og resuspendcellene i nøyaktig 10 ml sterile 1x PBS. Vask cellene som i trinn 1.1.4.2 og overfør en liten mengde (ca. 100 μL) cellesuspensjon til et sentrifugerør for telling. Pelletceller ved å spinne ved 350 x g i 3 min.
- Bestem cellenummeret ved hjelp av Trypan blå eksklusjonsmetode ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller. Resuspendceller i sterile 1x PBS ved en konsentrasjon på 5 x 106 celler/ml. Hold cellesuspensjon på is.
MERK: Levedyktigheten til tumorceller bør være lik eller over 80 % for å sikre reproduserbar tumorvekst.
- Kontroller at cellelinjen vedlikeholdes i det anbefalte mediet. For eksempel opprettholde WEHI 164 cellelinje i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 2 mM L-glutamin, 10% foster storfe serum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin, og 100 μg / mLptot.
- Subkutan inokulasjon
- Bland celleoppsuspensjonen grundig og fyll en sprøyte med en 26 G kanyle med 100 μL celleoppheng (5 x 105 celler) i sterile 1x PBS. Gjenta blanding av celler før du legger neste sprøyte.
MERK: Hold cellene på isen gjennom hele prosedyren for å opprettholde levedyktigheten. - Hold musen riktig, slik at du får tilgang til den nedre høyre flanken. Inokuler musen subkutously på barbert nedre høyre flanke.
MERK: Pass på at inokulasjonen ikke er i bukhinnen ved å løfte nålen litt, som skal være synlig under huden. En boblelignende klump skal dannes under huden etter inokulasjon. - Overvåk mus etter behov ved gjeldende etikkgodkjenning og utfør kirurgisk reseksjon når svulstene har vokst til en størrelse på ca. 50 mm2.
- Bland celleoppsuspensjonen grundig og fyll en sprøyte med en 26 G kanyle med 100 μL celleoppheng (5 x 105 celler) i sterile 1x PBS. Gjenta blanding av celler før du legger neste sprøyte.
2. Delvis kirurgisk reseksjon av svulsten
MERK: Denne protokollen krever to forskere; en for kirurgiske prosedyrer (SURGEON), og en annen for museovervåking (ASSISTANT).
- Oppsett av operasjoner
- På dag 12 post inokulasjon, når svulster har nådd en størrelse på ca 50 mm2, dose mus med 100 μL (0,1 mg / kg) av buprenorfin s.c. i scruff i nakken, 30 minutter før kirurgi.
- Sett opp det kirurgiske området med en varmepute dekket med benkfrakk og sett opp en nesekjegle for anestesi. Steriliser kirurgiske verktøy før bruk, og mellom hvert dyr ved hjelp av en varmeperle sterilisator, slik at verktøy kan avkjøles før bruk. Ha følgende kirurgisk utstyr rent og innen rekkevidde: klorhexidin, vattpinne, gasbind, øyegel, to buede tang, saks, kliplikator, klipsfjerner, klipspåfyll (Figur 2A, 2B).
- Varm varmekammeret til 37 °C og sett opp en annen varmepute for gjenvinning (figur 2C). Plasser steriliserte verktøy på en steril overflate som autoklaverte pads.
- Anestesi
- Plasser musen i induksjonskammeret og bedøve musen med 4% isofluran (4% i 100% oksygen med en strømningshastighet på 1 l / min) til pustehastigheten bremser til ca 60 åndedrag per minutt (1 per sekund) (dette tar vanligvis < 1 min).
MERK: Ikke la musen stå i kammeret for lenge, da det kan føre til kvelning og død. Bare ha en mus under anestesi om gangen. - Overfør musen på varmeputen på operasjonsbordet, plasser musen med nesen i nesekjeglen og vedlikehold bedøvelsestilstanden med 3-4% isofluran i 100% oksygen med en strømningshastighet på 0,5 l / min. Overvåk pustehastigheten for å sikre at dybden av anestesi opprettholdes.
MERK: ASSISTENTen må overvåke pusten av musen gjennom hele operasjonen for å sikre at riktig nivå av anestesi opprettholdes. Senk bedøvelseskonsentrasjonen hvis pusten blir for langsom eller øk konsentrasjonen hvis dybden av anestesi er for grunn. Hvis musen begynner å gispe, fjern musen fra nesekjeglen, reduser bedøvelseskonsentrasjonen og vent til pusten normaliserer seg før du legger på nesekjeglen igjen. - Utfør en "klype test" og "hornhinnereflekstest"14 for å sikre at musen er fullt bedøvet før operasjonen påbegynnes.
MERK: Bevegelse av en hvilken som helst del av musen er en indikasjon på at musen ikke er fullstendig bedøvet. Dyret bør umiddelbart gis ekstra bedøvelse ved å øke bedøvelseskonsentrasjonen. - Dekk musens øyne med en liten mengde oftalmisk gel for å unngå øyetørrhet.
- Plasser musen i induksjonskammeret og bedøve musen med 4% isofluran (4% i 100% oksygen med en strømningshastighet på 1 l / min) til pustehastigheten bremser til ca 60 åndedrag per minutt (1 per sekund) (dette tar vanligvis < 1 min).
- Kirurgisk prosedyre (KIRURG)
- Vattpinne det kirurgiske området 3 ganger med alkoholholdig klorhexidin. Ved hjelp av tang og en saks, gjør et 1 cm rett snitt langs dorsalsiden, 3 mm unna svulsten (Figur 3A, 3B).
MERK: Standardisering av snittet til 1 cm i hver mus (ved hjelp av en linjal) gir mulighet for jevn vurdering av sårheling mellom mus. Å finne snittet 3 mm unna svulsten gjør det mulig for påfølgende intratumoral adjuvant terapi uten lekkasje fra såret. - Ved hjelp av pinsett, trekk bort facia og subkutan fettvev mellom svulsten og bukhinnen. Den subkutane svulsten er normalt festet til hudsiden.
- Åpne såret ved å forsiktig holde huden på tumorbærende side ved hjelp av pinsett, og "invertere" svulsten slik at den er synlig utenfor (Figur 3C, 3D).
MERK: Den delen av svulsten som skal debuleres, skal være nærmest åpningen, for å ha nok hud til å lukke såret. Vær forsiktig så du ikke kutter huden når du fjerner svulsten. - Ved hjelp av en saks, kutt bort tumorkapselen fra halvparten for å fjerne, fra bunnen av svulsten nærmest åpningen.
- For 50% debulk kirurgi, kuttet over midten av svulsten. Ved hjelp av buede tang, scoop opp den delen av svulsten som skal fjernes (50%); scoop opp noen rester fra debulked området.
- For 75% debulk, utfør en 50% tumor debulk som i del 2.3.5 ovenfor. Deretter kuttes i halvparten av de resterende 50% av svulsten og øse opp 25% av svulsten, ved hjelp av buede tang som beskrevet ovenfor.
- Vattpinne det kirurgiske området 3 ganger med alkoholholdig klorhexidin. Ved hjelp av tang og en saks, gjør et 1 cm rett snitt langs dorsalsiden, 3 mm unna svulsten (Figur 3A, 3B).
- Lukke operasjonsstedet
- Plasser den gjenværende svulsten tilbake under huden, og bruk tang, trekk hudklaffene sammen og still opp huden langs såret.
- Hold huden sammen 5 mm fra kanten av såret, og bruk kirurgiske klips for å lukke såret, og start på siden nærmest tangene. Påfør så mange klipp som nødvendig for å sikre at ingen underliggende vev eksponeres. Vanligvis påføres tre til fire klipp med 2 mm mellomrom mellom klips.
MERK: Hvis noen klipp ikke er godt brukt, fjern den ved hjelp av en kliper og erstatt med nye klipp.
- Gjenoppretting av mus (ASSISTANT)
- La musene komme seg ved å sette dem inn i det varme (37 °C) varmekammeret.
- Plasser musens bur på varmeplaten. Overvåk musene i varmekammeret til de har gjenopprettet fra bedøvelsen (våken og gå) og sett deretter musene tilbake i buret. La buret stå på varmeputen i ytterligere 10 minutter, til musene har blitt mer aktive.
- Gi musene våt og myk mat. Overvåk musene 1 time etter operasjonen for gjenoppretting og sørg for at klips forblir på plass. Sørg for at buret er halvparten på/halvparten av varmeputen slik at dyr kan regulere temperaturen selv mens de er uten tilsyn.
- Dose mus med 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL subkutan i nakken), 6-8 timer etter operasjonen (på slutten av dagen). Overvåk mus tidlig neste morgen, og doser mus igjen med 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL subkut, i nakken). Gi mer våt mat etter behov.
- Overvåk mus daglig de neste syv dagene. Klips kan fjernes etter sju dager ved hjelp av kliperen.
- Adjuvant eller neoadjuvant behandling
- Behandle mus peri-operative med (neo)adjuvant terapi til enhver tid, avhengig av behandling av interesse.
- For eksempel behandle mus med en dose på 100 μg anti-CTLA-4 intraperitonealt (dvs.) på dag 15 etter inokulasjon, eller med tre doser av 200 μg anti-PD-1 i.p. på dag 15, 17 og 19 etter inokulasjon.
- Eksperimentelle kontroller
- Når du bruker denne modellen til å vurdere effekten av betennelse / sårheling, bør du vurdere å bruke følgende kontrollgrupper: 1) Ingen operasjonskontroll (behandlinger kan fortsatt administreres intratumoralt); 2) Sham kirurgi kontroll: Et kirurgisk snitt er laget i huden; svulsten manipuleres og eksponeres, men ingen tumorvev fjernes; såret er lukket med klips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorvekst til en størrelse på 50 mm2 er en ideell størrelse for delvis debulk. Den ufullstendige kirurgiske reseksjonen av 50 mm2 svulster resulterer i 100% (n = 5) reproduserbar gjenvekst av svulstene i fravær av adjuvant immunterapi (figur 4A). Vi brukte deretter modellen til å teste adjuvant immunterapier ved hjelp av antistoffer mot sjekkpunktmolekyler Cytotoksisk T Lymfocytt assosiert protein 4 (CTLA-4) og programmert dødsreseptor 1 (PD-1). Behandling av mus med anti-CTLA-4 eller anti-PD-1 resulterte i en kurrate på henholdsvis 80 % og 25 % (n=4-5 per gruppe), henholdsvis (figur 4B, 4C). Responsen med anti-PD-1 gir en mulighet til å teste nye kombinasjoner for å forbedre responsraten ytterligere.
Figur 1: Skjematisk diagram av delvis kirurgisk reseksjon av svulsten. (A)BALB/c-mus er vaksinert med 5 x 105 WEHI-164-celler på nedre høyre flanke. (B) Når svulsten når 50 mm2, kan kirurgi starte. (C) Svulsten er delvis resected (50 % vist). (D) Operasjonsstedet er lukket med klips. (E) Adjuvant behandling kan administreres, intravenøst, intraperitonealt (vist) eller intratumoralt i sårområdet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder av operasjonen satt opp. (A)Et helt bilde av operasjonen som vises de kirurgiske verktøyene (oppført i trinn 2.1) og bedøvelsesmaskinen. (B)Et øyeblikksbilde av det kirurgiske bordet som viser alle materialer innen rekkevidde. (C) Et varmekammer og en varmematte for musegjenvinning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative bilder av delvis tumordebulk teknikk. (A) En fullt bedøvet mus med en svulst på 50 mm2 i størrelse før operasjonen. (B) Snittsted 3 mm unna svulsten; 1 cm snitt. - Jeghar ikke noe valg. Åpning av såret ved å forsiktig holde huden på svulstbærende side ved hjelp av pinsett, og "invertere" svulsten slik at den er synlig utenfor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Tumorgjenvekst etter ufullstendig tumorreseksjon og immunterapi. (A) Tumor gjenvekst kurver av delvis resected WEHI-164 svulster i fravær av adjuvant immunterapi. - Jeg harikke noe valg. Tumorgjenvekst etter operasjonen og adjuvant behandling med anti-CTLA-4 (B) eller anti-PD1 (C). Den stiplede linjen indikerer operasjonsdagen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi gir en protokoll for en musemodell av ufullstendig kirurgisk reseksjon av bløtvevssarkom for å teste peri-operative terapier. Vi standardiserte også det kirurgiske snittet for å tillate vurdering av sårheling mellom mus etter behandling.
Tumorplassering er en viktig del av denne protokollen. Vi har valgt en subkutan tumormodell for å gi enkel kirurgisk tilgang til tumorstedet og administrasjon av lokale terapier med minimal byrde på musene. Det er også viktig å sikre at svulstene vokser i det subkutane rommet og ikke innenfor bukhinnen, noe som kan resultere i uventet sykelighet og dødelighet.
Når du velger en tumorcellelinje for denne protokollen, anbefaler vi at cellene når de dyrkes in vivo danner en solid masse (f.eks. WEHI-164-modell), i stedet for en halvs solid masse (for eksempel B16-modellen) da det er teknisk vanskelig å delvis gjeninnstende. I tillegg, hvis svulsten begynner å vokse gjennom huden (vanligvis sett i svulster større enn 100 mm2), anbefales ikke debulking da huden kan bli nekrotisk og ikke helbrede godt etter operasjonen. Vi har overvunnet dette problemet ved å debulere svulster når de når 50 mm2 i størrelse.
Siden vår modell kan brukes til å vurdere effekten av sårheling på terapi, foreslår vi en kontroll/ sham gruppe som en sammenligning. Kontrollen kan være uendret svulst, eller sham kirurgi som bare ville ha huden snitt, eksponering av svulsten, og sår nedleggelse uten delvis tumor debulk. Denne sham kontrollgruppen kan brukes når kresne effekten av kirurgi-indusert betennelse og sårheling fra delvis debulk på behandlingsutfallet.
For vellykket delvis debulking kirurgi, noen tekniske punkter må vurderes. Et viktig aspekt er riktig implantasjon og vekst av svulsten. Svulster må implanteres på nedre høyre flanke, vekk fra bakbenet. Svulster som er implantert for nær bakbenet kan forstyrre deres evne til å gå og kan resultere i ekstra kraft på klippene forårsaker dem til å løsne. I tillegg er konsistens i tumorstørrelse kritisk for å unngå variasjon i den relative prosentandelen av debulking. Vi valgte å utføre kirurgi med svulster som har en størrelse på 50 mm2, for å gjøre kirurgi teknisk grei, selv om vi ser for oss at delvis reseksjon på mindre svulster er mulig. For å forhindre inkonsekvens i tumorstørrelse, må den brukte cellelinjen passeres etter de riktige standard cellekulturteknikkene, og forskeren må være tilstrekkelig trent i riktig tumorinokulasjonsteknikk. Når du utvider denne protokollen til andre subkutane tumormodeller, er de fysiske egenskapene til svulsten av betydning. For eksempel fant vi at cellelinjer som gir opphav til myke, gelatinøse svulster (f.eks. M3-9-M rabdomyosarkom og B16 melanom15) er teknisk utfordrende å debulk.
Det er også tekniske punkter som må vurderes under operasjonen. Mus må bedøves tilstrekkelig for å forhindre bevegelse under prosedyren. Bortsett fra den bedrageri at utilstrekkelig bedøvede mus vil tåle, kan enhver bevegelse av mus under prosedyren gjøre kirurgisk reseksjon vanskelig, noe som resulterer i variasjon i størrelsen på svulsten fjernet mellom mus. I tillegg bør mus respiratorisk hastighet overvåkes nøye under operasjonen Isoflurankonsentrasjon bør justeres for å opprettholde riktig dybde av anestesi. Derfor er en assistent alltid nødvendig under den kirurgiske prosedyren for å overvåke pustehastigheten under operasjonen, og for å sikre et tilstrekkelig nivå av anestesi. Størrelsen på snittet må være konsekvent for å unngå variasjon i sårhelingsresponsen. Vi fant at en 1-1,5 cm snitt er tilstrekkelig for tumor debulking, med en minimal sjanse for sår dehiscence.
Vår modell av delvis reseksjon etterligner gjenværende sykdom etter operasjonen sett i klinisk innstilling av mange faste svulster og gir fordeler fremfor tradisjonelle syngeneic musemodeller ved å ta hensyn til effekten av kirurgisk sårheling. I tillegg har eksisterende tradisjonelle modeller for kirurgi brukt fullstendig tumorreseksjon, noe som ikke alltid resulterer i tumorfall16. Andre forskere har med hell brukt delvis reseksjonsmodeller ved hjelp av andre kreftcellelinjer11,12,13, som understreker robustheten til denne metoden. Videre har det vist seg at delvis reseksjon, men ikke fullstendig reseksjon, resulterte i beskyttende anti-tumor immunminne når adjuvant terapi er gitt12 som ble tilskrevet utholdenhet av antigener fra gjenværende svulst.
Denne modellen er designet for å studere effekten av betennelse og sårheling på terapi. Vår avbuling tilnærming klinisk ligner kliniske situasjoner der brutto gjenværende sykdom er igjen etter operasjonen (R2 reseksjon), snarere enn makroskopisk komplett reseksjon med mikroskopisk gjenværende sykdom (R1 reseksjon). For eksempel kan kirurgisk reseksjon i invasiv bløtvevssarkom resultere i positive marginer når svulsten ligger ved siden av kritiske strukturer som nerver, arterier eller tilstøtende organer, som utelukker fullstendig reseksjon med brede marginer17. Kirurgi modeller for reseksjon som resulterer i mikroskopiske positive marginer har blitt publisert13; vår protokoll kan brukes til å studere effekten av sårhelingsresponsen på terapi når makroskopisk gjenværende sykdom er tilstede.
En begrensning av vår modell er at den ikke gir opphav til fjernt tilbakefall og mikrometastasis, noe som er vanlig etter kirurgi i solide svulster som brystkreft eller bukspyttkjertelkreft. Andre kirurgi modeller, slik som murine brystkreft modell 4T118,,19,,20 eller murine modeller av de novomammary kreft metastase21 er bedre egnet til å undersøke systemisk relapse etter lokal reseksjon. En annen begrensning er at denne protokollen er for subkutane modeller og tillater derfor ikke vurdering av vevsspesifikk patologi. Til dette formål er ortotopiske tumormusmodeller passende7,22,23. Imidlertid er ortotopiske modeller mer utfordrende og involverer vanligvis større impost til mus, og er mer arbeidskrevende og kostbare22. Subkutane modeller er godt egnet til å vurdere effekten av (neo-)adjuvant terapi, enten systemisk eller lokalt, på lokal kreft tilbakefall, på en kostnadseffektiv og relativt høy gjennomstrømning måte med minimal impost til dyrene.
Den ufullstendige delvise reseksjonen som beskrevet i denne protokollen er nyttig for testing av adjuvant terapier mens den omfatter kirurgisk sårheling som en faktor, en variabel som ofte overses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen avsløringer.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av tilskudd fra Sokken til Sarcoma! Foundation, Australian og New Zealand Sarcoma Association, Children's Leukemia & Cancer Research Foundation og Evigvarende filantropi. W.J.L støttes av et Simon Lee Fellowship og et stipendiat fra National Health and Medical Research Council, og Cancer Council WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
