Summary
I denne protokol beskriver vi en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af bløddelssarkom til test (neo)adjuverende behandlinger.
Abstract
Kirurgi er ofte den første behandling for mange solide tumorer. Men, lokale tilbagefald ofte opstår efter primær tumor resektion, trods adjuverende eller neo-adjuverende behandlinger. Dette sker, når kirurgiske margener er utilstrækkeligt tumor-fri, resulterer i resterende kræftceller. Fra et biologisk og immunologisk perspektiv, kirurgi er ikke en null begivenhed; sårhelingsmiljøet er kendt for at fremkalde både pro- og anti-tumorigenic veje. Som følge heraf bør prækliniske modeller for lægemiddeludvikling, der har til formål at forebygge lokalt tilbagefald, omfatte kirurgisk resektion, når der testes nye (neo)adjuverende behandlinger, for at modellere de kliniske indstillinger hos patienter, der behandles med kirurgi.
Her beskriver vi en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af WEHI 164 bløddelssarkom, der gør det muligt at teste (neo)adjuverende behandlinger i forbindelse med et sårhelingsrespons. I denne model, 50% eller 75% af tumoren er fjernet, efterlader nogle kræft væv in situ til model brutto resterende sygdom efter operation i den kliniske indstilling. Denne model gør det muligt at teste behandlinger i forbindelse med kirurgi, samtidig med at man overvejer sårhelingsresponsen, hvilket kan påvirke effekten af (neo)adjuverende behandlinger. Den ufuldstændige kirurgiske resektion resulterer i reproducerbar genvækst af tumoren i alle mus i mangel af adjuverende behandling. Adjuverende behandling med checkpoint blokade resulterer i reduceret tumor genvækst. Denne model er således velegnet til test af behandlinger i forbindelse med debulking kirurgi og dens tilhørende sårheling svar og kan udvides til andre typer af fast kræft.
Introduction
Kirurgi er fortsat den vigtigste behandlingsmulighed for mange solidetumorer 1, herunder blødt væv sarkom2,3. På trods af forbedringer i kræft kirurgi teknikker, og kombinationer med (neo) adjuverende behandlinger, der er stadig en høj risiko for kræft tilbagefald og metastase efter primær tumor resektion4,5. I bløddelssarkom forekommer tilbagefald særligt locoregionalt på operationsstedet, hvilket resulterer i øget sygelighed og dødelighed. I den kliniske indstilling, Det kan være vanskeligt at opnå brede nok margener (f.eks på grund af anatomiske begrænsninger), resulterer i ufuldstændig resektion og efterfølgende tumor tilbagefald6. Kirurgisk stress og den efterfølgende proces med sårheling er kendt for at skabe en immunosuppressiv tumor mikromiljø gunstige for tumor tilbagefald7,8. Derfor bør opdagelsen og udviklingen af nye behandlingsformer for bløddelssarkom, især immunterapier, ideelt set tage den kirurgiske sårhelingsrespons i betragtning.
De fleste prækliniske undersøgelser for adjuverende behandlinger udføres i første omgang ved hjælp af subkutane syngeneic eller xenotransplant musemodeller, uden at indarbejde den kirurgiske stress og sårhelingrespons 9,10. Derfor har vi udviklet en syngeneic subkutane mus blødt væv sarkom model indarbejde ufuldstændig kirurgisk resektion. WEHI 164 fibrosarkom celler er podet subkutane, og når tumorer er etableret, vi fjerner 50-75% af tumor bulk(Figur 1A-E). Tumorer konsekvent igen vokse fra de resterende tumor. Denne model giver mulighed for at teste adjuverende behandlinger, mens man overvejer effekten af kirurgisk stress og sårheling. Lignende kirurgiske modeller af ufuldstændig resektion er blevet anvendt i en række undersøgelser af flere grupper og fundet at være reproducerbare og effektive11,,12,13. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr, der anvendes i disse forsøg blev fremstillet fra Animal Resource Centre (Perth, Western Australia). Dyr blev opretholdt under standard patogen-fri betingelser på Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Alle forsøg blev udført i henhold til protokollen som godkendt af Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c mus på 8-12 uger blev anvendt til disse forsøg. DEN WEHI 164 fibrosarcoma celle linje blev opnået fra CellBank Australien (Westmead, NSW).
1. Inokulering af celler
- Forberedelse af celler og dyr
- Sørg for, at cellelinjen bevares i det anbefalede medie. For eksempel opretholde WEHI 164 celle linje i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 10% føtal kvæg serum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilliic, og 100 μg/mL streptomycin.
BEMÆRK: Passageceller mindst 3 og op til 5 gange efter at være blevet fjernet fra kryogen opbevaring. For at sikre en optimal cellevirtabilitet skal cellerne opdeles, når de er mellem 70-80 % sammenflydende. Tumorcellelinjer bør testes for mycoplasma, da infektion kan ændre cellevæksten og påvirke immunresponset in vivo. - En dag før inokulering skal du barbere mus på den nederste højre flanke ved hjælp af klippere.
BEMÆRK: Der blev anvendt kvindelige BALB/c-mus i alderen 8-12 uger med normal vægt (16 -22 gram) i dette forsøg. - På dagen for inokulering, høst WEHI 164 celler, når 70-80% sammenflydende ved trypsinisering.
- Æstning af kulturmediet fra vævskulturkolberne, og der tilsættes derefter sterilt fosfatbufferopløsning (1x PBS) for at fjerne de resterende spor af føtalt kvægserum (FBS).
- PBS aspirerer fra vævskulturkolberne. Der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin (til en T75-kolbe), og kolben hvirvles derefter rundt, så hele kolbens overflade med celler er dækket af trypsin.
- Kolben inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 inkubator i 3 min. Kontroller cellerne regelmæssigt ved at trykke på kolbens sider for at se, om cellerne er løsnet.
- Kolber fjernes fra cellekulturinkubatoren, og der tilsættes 5 ml medietilskud med FBS for at neutralisere trypsinen.
BEMÆRK: Efterlad ikke celler i trypsin længere end nødvendigt, da dette kan beskadige cellerne og føre til lav celle levedygtighed. - Pipet suspension flere gange for at opnå en enkelt celle suspension. Cellesuspension overføres til et konisk centrifugerør.
- Pellet celler ved at spinde på 350 x g i 3 min.
- Cellerne vaskes tre gange i 1x PBS.
- Resuspenderede celler i 50 ml sterile 1x PBS og vask cellerne ved at pipettere celleophæng op og ned. Pellet celler ved at spinde på 350 x g i 3 min.
- Supernatanten og resuspenderede celler indsuges i 15 ml steril 1x PBS. Vask celler ved pipettering celle suspension op og ned. Pellet celler ved at spinde på 350 x g i 3 min.
- Supernatanten og resuspenderede celler indsuges i nøjagtig 10 ml sterilt 1x PBS. Cellerne vaskes som i trin 1.1.4.2, og der overføres en lille mængde (ca. 100 μL) cellesuspension til et centrifugerør til optælling. Pellet celler ved at spinde på 350 x g i 3 min.
- Bestem cellenummeret ved hjælp af den blå Prøvebakkeudelukkelsesmetode ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Resuspend celler i sterile 1x PBS i en koncentration på 5 x 106 celler/ml. Hold celleophæng på is.
BEMÆRK: Levedygtigheden af tumorceller bør være lig med eller over 80 % for at sikre reproducerbar tumorvækst.
- Sørg for, at cellelinjen bevares i det anbefalede medie. For eksempel opretholde WEHI 164 celle linje i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 2 mM L-glutamin, 10% føtal kvæg serum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilliic, og 100 μg/mL streptomycin.
- Subkutan inokulering
- Cellesuspensionen blandes grundigt, og en sprøjte fyldes med en 26 G nål med 100 μL cellesuspension (5 x 105 celler) i sterile 1x PBS. Gentag blanding af celler, før du lægger den næste sprøjte.
BEMÆRK: Hold cellerne på is under hele proceduren for at opretholde levedygtigheden. - Hold musen korrekt, så der er adgang til den nederste højre flanke. Poder musen subkutanely på den barberede nederste højre flanke.
BEMÆRK: Sørg for, at inokuleringen ikke er i bughinden ved at løfte nålen lidt, som skal være synlig under huden. En boble-lignende klumper bør dannes under huden efter inokulering. - Mus skal monitoreres efter den gældende etiske godkendelse, og der udføres kirurgisk resektion, når tumorerne er vokset til ca. 50 mm2.
- Cellesuspensionen blandes grundigt, og en sprøjte fyldes med en 26 G nål med 100 μL cellesuspension (5 x 105 celler) i sterile 1x PBS. Gentag blanding af celler, før du lægger den næste sprøjte.
2. Delvis kirurgisk resektion af tumoren
BEMÆRK: Denne protokol kræver to forskere; en for kirurgiske procedurer (KIRURG), og en anden til museovervågning (ASSISTANT).
- Kirurgisk opsætning
- På dag 12 post inokulering, når tumorer har nået en størrelse på ca 50 mm2,dosis mus med 100 μL (0,1 mg / kg) af buprenorphin s.c. i scruff af halsen, 30 minutter før operationen.
- Opsæt det kirurgiske område med en varmepude dækket med bænkfrakke og opsæt en næsekegle til anæstesi. Sterilisere kirurgiske værktøjer før brug, og mellem hvert dyr ved hjælp af en varme perle sterilisator, så værktøjerne til at køle før brug. Hav følgende kirurgisk udstyr rent og inden for rækkevidde: chlorhexidin, podepind, gaze, øjengelé, to buede fletninger, saks, klipapplikator, klipfjerner, klipfyldninger (Figur 2A, 2B).
- Varmekammeret opvarmes til 37 °C, og der opsættes endnu en varmepude til genvinding (figur 2C). Placer steriliserede værktøjer på en steril overflade såsom autoklaverede puder.
- Anæstesi
- Placer musen i induktionskammeret og anesthetize musen med 4% isofluran (4% i 100% ilt ved en strømningshastighed på 1 L / min), indtil vejrtrækningen bremser til ca 60 vejrtrækninger i minuttet (1 per sekund) (dette tager normalt <1 min).
BEMÆRK: Lad ikke musen stå i kammeret for længe, da det kan føre til kvælning og død. Kun har én mus under anæstesi ad gangen. - Overfør musen på varmepuden på operationsbordet, placer musen med næsen i næsekeglen, og hold bedøvelsestilstanden med 3-4% isofluran i 100% ilt med en strømningshastighed på 0,5 L/min. Overvåg vejrtrækningshastigheden for at sikre, at anæstesidybden opretholdes.
BEMÆRK: ASSISTENTEN skal overvåge musens vejrtrækning under hele operationen for at sikre, at det korrekte anæstesiniveau opretholdes. Sænk anæstesi koncentrationen, hvis vejrtrækningen bliver for langsom eller øge koncentrationen, hvis dybden af anæstesi er for lavvandet. Hvis musen begynder at gispe, skal du fjerne musen fra næsekeglen, nedsætte bedøvelseskoncentrationen og vente, indtil vejrtrækningen normaliseres, før du placerer den på næsekeglen igen. - Udfør en "knivspids test" og "hornhinde refleks test"14 for at sikre, at musen er fuldt anesthetized før påbegyndelse af kirurgi.
BEMÆRK: Flytning af en hvilken som helst del af musen er et tegn på, at musen ikke er helt anseetiseret. Dyret skal straks gives ekstra bedøvelsesmiddel ved at øge bedøvelseskoncentrationen. - Dæk musens øjne med en lille mængde oftalmisk gel for at undgå tørre øjne.
- Placer musen i induktionskammeret og anesthetize musen med 4% isofluran (4% i 100% ilt ved en strømningshastighed på 1 L / min), indtil vejrtrækningen bremser til ca 60 vejrtrækninger i minuttet (1 per sekund) (dette tager normalt <1 min).
- Kirurgisk indgreb (KIRURG)
- Pode det kirurgiske område 3 gange med alkoholisk chlorhexidin. Ved hjælp af hingst og en saks, lave en 1 cm lige snit langs dorsale side, 3 mm væk fra tumoren(Figur 3A, 3B).
BEMÆRK: Standardisering af snittet til 1 cm i hver mus (ved hjælp af en lineal) giver mulighed for en jævn vurdering af sårheling mellem mus. Lokalisering af snittet 3 mm væk fra tumoren giver mulighed for efterfølgende intratumoral adjuverende behandling uden lækage fra såret. - Ved hjælp af en pincet, trække væk facia og subkutane fedtvæv mellem tumor og bughinde. Den subkutane tumor er normalt knyttet til huden-side.
- Åbn såret ved forsigtigt at holde huden på tumorleje side ved hjælp af pincet, og "invertere" tumoren, så det er synligt udenfor (Figur 3C, 3D).
BEMÆRK: Den del af tumor, der skal debulked bør være tættest på åbningen, at have nok hud til at lukke såret. Pas på ikke at skære huden, når du fjerner tumoren. - Ved hjælp af en saks, skære væk tumor kapsel fra den halve til at fjerne, startende fra bunden af tumoren tættest på åbningen.
- For 50% debulk kirurgi, skåret over midten af tumoren. Ved hjælp af buede blår, øse op den del af tumoren, der skal fjernes (50%); øse op eventuelle rester fra debulked området.
- For 75% debulk, udføre en 50% tumor debulk som i del 2.3.5 ovenfor. Derefter skæres i halvdelen af de resterende 50% af tumor og øse op 25% af tumoren, ved hjælp af buede blår som beskrevet ovenfor.
- Pode det kirurgiske område 3 gange med alkoholisk chlorhexidin. Ved hjælp af hingst og en saks, lave en 1 cm lige snit langs dorsale side, 3 mm væk fra tumoren(Figur 3A, 3B).
- Lukning af operationsstedet
- Placer den resterende tumor tilbage under huden, og ved hjælp af fletninger, trække huden flapper sammen og line up huden langs såret.
- Hold huden sammen 5 mm fra kanten af såret, og bruge kirurgiske clips til at lukke såret, der starter på den side tættest på brysthæve. Påfør så mange klip som nødvendigt for at sikre, at ingen underliggende væv er udsat. Generelt påføres tre til fire klip med 2 mm mellemrum mellem klip.
BEMÆRK: Hvis der ikke er anvendt clips korrekt, skal du fjerne dem ved hjælp af en klipfjerner og erstatte dem med nye klip.
- Genvinding af mus (ASSISTANT)
- Lad musene komme sig ved at sætte dem ind i det varme varme varmekammer (37 °C).
- Placer musens bur på varmepuden. Overvåg musene i varmekammeret, indtil de er kommet sig efter bedøvelsen (vågen og gå) og derefter sætte musene tilbage i buret. Lad buret på varmepuden i yderligere 10 minutter, indtil musene er blevet mere aktive.
- Giv musene våde og bløde fødevarer. Overvåg musene 1 time efter operationen for at få dem i bedring, og sørg for, at clipsene forbliver på plads. Sørg for, at buret er halvt tændt/halvt slukket for varmepuden, så dyrene selv kan regulere temperaturen, mens de er ubemandede.
- Dosis mus med 0,1 mg/kg buprenorphin (100 μL subkutane i scruff af halsen), 6-8 timer efter operationen (i slutningen af dagen). Overvåg mus tidligt den følgende morgen, og doser mus igen med 0,1 mg/kg buprenorphin (100 μL subkutet i nakkens scruff). Giv mere våd mad efter behov.
- Overvåg mus dagligt i de næste syv dage. Klip kan fjernes efter syv dage ved hjælp af klipfjerneren.
- Adjuverende eller neoadjuverende behandling
- Forkæl mus perioperativt med (neo)adjuverende behandling på et givet tidspunkt, afhængigt af behandlingen af renter.
- For eksempel, behandle mus med en dosis på 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) på dag 15 efter inokulering, eller med tre doser af 200 μg anti-PD-1 i.p. på dag 15, 17 og 19 efter inokulering.
- Eksperimentel kontrol
- Når du bruger denne model til at vurdere virkningerne af inflammation/ sårheling, overveje at bruge følgende kontrolgrupper: 1) No-kirurgi kontrol (behandlinger kan stadig administreres intratumorally); 2) Sham kirurgi kontrol: Et kirurgisk snit er lavet i huden; tumoren er manipuleret og eksponeret, men ingen tumorvæv fjernes; såret er lukket med clips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorvækst til en størrelse på 50 mm2 er en ideel størrelse til delvis debulk. Den ufuldstændige kirurgiske resektion af 50 mm2 tumorer resulterer i 100% (n = 5) reproducerbar genvækst af tumorer i mangel af adjuverende immunterapi (Figur 4A). Vi brugte derefter modellen til at teste adjuverende immunterapier ved hjælp af antistoffer mod checkpoint molekyler Cytotoksisk T Lymphocyt Associated Protein 4 (CTLA-4) og Programmeret Death Receptor 1 (PD-1). Behandling af mus med anti-CTLA-4 eller anti-PD-1 resulterede i en hærderate på henholdsvis 80% og 25% (n=4-5 pr. gruppe) (figur 4B, 4C). Reaktionen med anti-PD-1 giver mulighed for at teste nye kombinationer for at forbedre responsraten yderligere.
Figur 1: Skematisk diagram over delvis kirurgisk resektion af tumoren. (A) BALB/c mus podes med 5 x 105 WEHI-164 celler på nederste højre flanke. (B) Når tumoren når 50 mm2, kirurgi kan begynde. (C) Tumoren er delvist resected (50 % vist). (D) Operationsstedet er lukket med clips. (E) Adjuverende behandling kan administreres, intravenøst, intraperitonealt (vist) eller intratumoralt i sårområdet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af den opstaldte operation. (A) Et helt billede af operationen oprettet viser de kirurgiske værktøjer (opført i trin 2.1) og bedøvelsesmiddel maskine. (B) Et øjebliksbillede billede af den kirurgiske tabel, der viser alle materialer inden for rækkevidde. (C) Et varmekammer og en varmepude til musegenvinding. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative billeder af delvis tumor debulk teknik. (A) En fuldt anesthetized mus med en tumor på 50 mm2 i størrelse før operationen. (B) Incision site 3 mm væk fra tumoren; 1 cm snit. (C-D) Åbning af såret ved forsigtigt at holde huden på tumor bærende side ved hjælp af pincet, og "invertere" tumoren, så det er synligt udenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tumor genvækst efter ufuldstændig tumor resektion og immunterapi. (A) Tumor genvækst kurver af delvist resected WEHI-164 tumorer i mangel af adjuverende immunterapi. (B-C) Tumorgenvækst efter operation og adjuverende behandling med anti-CTLA-4 (B) eller anti-PD1 (C). Den stiplede linje angiver dagen for operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi leverer en protokol til en musemodel af ufuldstændig kirurgisk resektion af bløddelssarkom til at teste perioperative behandlinger. Vi har også standardiseret det kirurgiske snit for at muliggøre vurdering af sårheling mellem mus efter behandling.
Tumor placering er en vigtig del af denne protokol. Vi har valgt en subkutan tumor model for at give nem kirurgisk adgang til tumorstedet og administration af lokale behandlinger med minimal byrde på musene. Det er også vigtigt at sikre, at tumorer vokser i det subkutane rum og ikke inden for bughinden, hvilket kan resultere i uventet sygelighed og dødelighed.
Når du vælger en tumorcellelinje til denne protokol, anbefaler vi, at cellerne, når de dyrkes in vivo, danner en fast masse (f.eks. WEHI-164-model), snarere end en halvfast masse (såsom B16-modellen), da det er teknisk vanskeligt delvist at resect. Hertil kommer, hvis tumoren begynder at vokse gennem huden (normalt ses i tumorer større end 100 mm2),debulking anbefales ikke, da huden kan blive nekrotisk og ikke helbrede godt efter operationen. Vi har overvundet dette problem ved debulking tumorer, når de når 50 mm2 i størrelse.
Da vores model kan bruges til at vurdere effekten af sårheling på terapi, foreslår vi en kontrol / fingeret gruppe som en sammenligning. Kontrollen kan være uændret tumor, eller fingeret kirurgi, som kun ville have huden snit, eksponering af tumor, og sårlukning uden delvis tumor debulk. Denne fingeret kontrolgruppe kunne anvendes, når kræsne effekten af kirurgi-induceret inflammation og sårheling fra den delvise debulk på behandlingen resultatet.
For en vellykket delvis debulking kirurgi, nogle tekniske punkter skal overvejes. Et vigtigt aspekt er den korrekte implantation og vækst af tumoren. Tumorer skal implanteres på den nederste højre flanke, væk fra bagbenet. Tumorer, der er implanteret for tæt på bagbenet kan forstyrre deres evne til at gå og kan resultere i ekstra kraft på klippene får dem til at komme løs. Desuden, konsistens i tumor størrelse er kritisk for at undgå variabilitet i den relative procentdel af debulking. Vi valgte at udføre kirurgi med tumorer, der har en størrelse på 50 mm2, for at gøre kirurgi teknisk ligetil, selv om vi forudser, at delvis resektion på mindre tumorer er muligt. For at forhindre uoverensstemmelse i tumor størrelse, den anvendte cellelinje skal passages efter de relevante standard celle kultur teknikker, og forskeren skal være tilstrækkeligt uddannet i den rette tumor inokulering teknik. Når du udvider denne protokol til andre subkutane tumormodeller, de fysiske egenskaber af tumoren er af betydning. For eksempel fandt vi, at cellelinjer, der giver anledning til bløde, gelatinøse tumorer (f.eks M3-9-M rhabdomyosarcoma, og B16 melanom15)er teknisk udfordrende at debulke.
Der er også tekniske punkter, der skal overvejes under operationen. Mus skal være tilstrækkeligt anesthetized at forhindre bevægelse under proceduren. Bortset fra bedrager, at utilstrækkeligt anesthetized mus vil udholde, enhver bevægelse af mus under proceduren kan gøre den kirurgiske resektion vanskelig, hvilket resulterer i variation i størrelsen af tumor fjernet mellem mus. Desuden bør respiratoriske puls for mus overvåges nøje under operation Isoflurane koncentrationen bør justeres for at opretholde den rette dybde af anæstesi. Derfor er en assistent altid nødvendig under den kirurgiske procedure for at overvåge vejrtrækning sats under kirurgi, og for at sikre et tilstrækkeligt niveau af anæstesi. Størrelsen af snittet skal være konsekvent for at undgå variabilitet i sårheling svar. Vi fandt, at en 1-1,5 cm snit er tilstrækkelig til tumor debulking, med en minimal chance for sår dehiscence.
Vores model af delvis resektion efterligner resterende sygdom tilbage efter operationen som set i den kliniske indstilling af mange solide tumorer og tilbyder fordele i forhold til traditionelle syngeneic musemodeller ved at tage hensyn til effekten af kirurgisk sårheling. Desuden har eksisterende traditionelle modeller af kirurgi brugt komplet tumor resektion, som ikke altid resulterer i tumor tilbagefald16. Andre forskere har med succes brugt delvis resektion modeller ved hjælp af andre kræftcellelinjer 11,,12,13, understreger robustheden af denne metode. Endvidere, Det er blevet påvist, at delvis resektion, men ikke fuldstændig resektion, resulterede i beskyttende anti-tumor immun hukommelse, når adjuverende behandling ergivet 12, som blev tilskrevet den vedholdenhed af antigener fra den resterende tumor.
Denne model er designet til at studere effekten af inflammation og sårheling på terapi. Vores debulking tilgang klinisk ligner kliniske situationer, hvor brutto resterende sygdom er efterladt efter operationen (R2 resektion), snarere end makroskopisk komplet resektion med mikroskopisk resektion (R1 resektion). For eksempel, kirurgisk resektion i invasive blødt væv sarkom kan resultere i positive margener, når tumoren er placeret ved siden af kritiske strukturer såsom nerver, arterier eller tilstødende organer, udelukker fuldstændig resektion med brede margener17. Kirurgi modeller for resektion resulterer i mikroskopiske positive margener er blevet offentliggjort13; vores protokol kan bruges til at undersøge effekten af sårhelingsresponsen på behandlingen, når der er makroskopisk resterende sygdom til stede.
En begrænsning af vores model er, at det ikke giver anledning til fjerne tilbagefald og mikrometastase, som er almindelig efter operation i solide tumorer såsom brystkræft eller kræft i bugspytkirtlen. Andre kirurgi modeller, såsom murine brystkræft model 4T118,,19,,20 eller murine modeller af de novomammary kræft metastase21 er bedre egnet til at undersøge systemiske tilbagefald efter lokal resektion. En anden begrænsning er, at denne protokol er for subkutane modeller og dermed ikke tillader vurdering af vævsspecifik patologi. Til dette formål, orthotop tumor musemodeller er passende7,22,23. Men orthotopiske modeller er mere udfordrende og normalt indebærer større bedrager til mus, og er mere besværlige og dyre22. Subkutane modeller er velegnede til at vurdere virkningerne af (neo-)adjuverende behandlinger, enten systemisk eller lokalt, på lokale kræft tilbagefald, i en omkostningseffektiv og relativt høj-throughput måde med minimal bedrag til dyrene.
Den ufuldstændige delvise resektion som skitseret i denne protokol er nyttig til at teste adjuverende behandlinger, samtidig med at kirurgisk sårheling som en faktor, en variabel, som ofte overses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen afsløringer.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra Sock det til Sarcoma! Foundation, den australske og New Zealand Sarcoma Association, Children's Leukæmi & Cancer Research Foundation og Perpetual Philanthropy. W.J.L støttes af et Simon Lee Fellowship og et forskningsstipendium fra National Health and Medical Research Council og Cancer Council WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
