Summary
Detta protokoll introducerar en litografifri mikromönstermetod som är enkel och tillgänglig för dem med en begränsad bioengineering bakgrund. Denna metod använder anpassade laser-cut stenciler till micropattern extracellulära matrisproteiner i en form av intresse för modulerande cell morfoologier. Förfarandet för micropatterning visas med hjälp av inducerad pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter.
Abstract
Mikromönster tekniker har använts i stor utsträckning i cellbiologi för att studera effekterna av att kontrollera cellens form och storlek på cellöden bestämning vid single cell resolution. Nuvarande state-of-the-art encelliga mikromönster tekniker innebär mjuk litografi och mikro-kontakt utskrift, som är en kraftfull teknik, men kräver utbildad teknisk kompetens och vissa anläggning stöd i mikrotillverkning. Dessa begränsningar kräver en mer tillgänglig teknik. Här beskriver vi en enkel alternativ litografifri metod: stencilbaserad encellig mönster. Vi erbjuder steg-för-steg-procedurer inklusive stencildesign, polyakrylamidhydrogeltillverkning, stencilbaserad proteinintegration samt cellplätering och kultur. Denna enkla metod kan användas för att mönstra en matris med så många som 2000 celler. Vi visar mönstring av kardiomyocyter som härrör från enstaka mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) med distinkta cellformer, från en 1:1 kvadrat till en 7:1 vuxen cardiomyocyte-liknande rektangel. Denna stencil-baserade encelliga mönster är litografi-fri, tekniskt robust, bekväm, billig, och viktigast av allt tillgänglig för dem med en begränsad bioteknik bakgrund.
Introduction
Tillkomsten av hiPSCs och den efterföljande utvecklingen av protokoll för deras riktade differentiering till olika celltyper har gjort det möjligt att studera utveckling och sjukdom på molekylär och patientspecifik nivå, särskilt med hjälp av patient-härledda iPSC kardiomyocyter (iPSC-CMs) för att modellera kardiomyopatier1,2. En stor begränsning till att studera utveckling och fysiologi med hjälp av iPSC-systemet och andra in vitro-modeller är dock avsaknaden av en strukturerad mikromiljö. På plats utsätts celler för begränsningarna i den extracellulära matrisen (ECM), liksom angränsande celler. Den särskilda biokemiska sammansättningen och styvheten hos dessa mikromiljöer dikterar den rumsliga fördelningen av celler samt faktorer som finns tillgängliga för att delta i cellvidhäftning. Detta påverkar i sin tur intracellulära signalvägar, genuttryck och cellödsbesehet. Till exempel, micropatterned iPSC-CM i en vuxen-liknande stav form har en betydligt bättre kontraktil förmåga, kalcium flöde, mitokondriell organisation, elektrofysiologi, och tvärgående-tubule bildning3. Således är egenskaperna hos mikromiljön integrerade i regleringen av cellulära funktioner.
Tidigare mikromönstertekniker är starkt beroende av fotolitografi (figur 1A). I denna teknik, ett lager av ljuskänslig polymer, eller fotoresist, snurras på ett platt substrat från lösning för att bilda en tunn film ca 1 μm tjock. Därefter appliceras ultraviolett (UV) ljus på fotoresistensen genom en mask som innehåller önskat mönster. Exponering för ultraviolett (UV) ljus förändrar kemiskt fotoresistensen genom att ändra dess löslighet i dess respektive utvecklarlösning och överför önskat mönster från masken till substratet. Många mikromönster metoder innehåller fotolitografi, eftersom det ger nanometer till mikrometer-nivå kontroll över utformningen av cellen mönster. Men spinning av fotoresistens är mycket känslig för föroreningar, eftersom de minsta dammpartiklar kommer att störa spridningen av lösningen i en tunn film. Fotolitografi måste därför utföras i oförorenade anläggningar, som är kostsamma att underhålla och kräver särskild expertis att utnyttja. Dessutom är de kemikalier som används i fotolitografi ofta giftiga för celler och kan denaturera viktiga biomolekyler. Således utgör fotolitografi betydande hinder för tillverkning av mikromönster för bekväma biologiska tillämpningar.
År 1994 övervann Whitesides och kollegor4 några av de utmaningar som förknippas med fotolitografi genom att bana väg för en samling tekniker som kallas mjuk litografi. I mjuk litografi används en mikrostrukturerad yta gjord med polydimetylsiloxan (PDMS), ett transparent, gummiliknande material, för att generera ett mönster av ECM-proteiner4. Vanliga mjuka litografiska tekniker inkluderar mikrokontakt utskrift och mikrofluidiska mönster. Vid mikrokontaktstryck, för närvarande den mest populära mjuka litografiska metoden, överför en PDMS-stämpel belagd med ECM-proteiner materialet till en yta vid de områden som kontaktas av stämpeln (figur 1B). I mikrofluidiska mönster är mikrostrukturer utformade på en PDMS-yta så att när stämpeln pressas till ett substrat skapas ett nätverk av mikrokanaler, genom vilket vätskor kan levereras till önskade områden (figur 1C)5. Mjuk litografi erbjuder flera fördelar jämfört med fotolitografi. När en huvudrån är mikrofabricerad kan PDMS-stämplarna enkelt replikeras utan ytterligare anställning av renrumsfaciliteter. Dessutom möjliggör frånvaron av organiska lösningsmedel i processen för mjuk litografi för användning av polymera material som polystyren, som vanligtvis används i cellodling. Slutligen är mikromönster med mjuka litografiska metoder inte begränsad till plana ytor. Således ökar mjuk litografi tillgängligheten och funktionaliteten hos mikromönster tillverkning över fotolitografi6. Men mjuk litografi har betydande nackdelar. Till exempel krävs fortfarande ett första etsningssteg, med hjälp av fotolitografi, för att mikrofabritera stämpeln. Dessutom är mikromönster med hjälp av en PDMS-stämpel föremål för variationer i kvaliteten på proteinöverföringen till substratet6. Undvika dessa avvikelser kräver optimering och konsekvens i trycket tillämpas på PDMS stämpel under proteinöverföring, annars deformation och snedvridning av funktionen storlekar pdms formar kan uppstå6. Det finns också en stor oro för att upprepade gånger använda PDMS på grund av liten molekylabsorption7.
För att undvika att använda mjuk fotolitografi och PDMS-frimärken beskriver vi en stencilbaserad litografifri mikromönstermetod med en cell som övervinner många av de hinder som är förknippade med fotolitografi och mjuk litografi. I denna metod används en polyakrylamidhydrogel som substrat för stencilbaserad ECM-proteinbildning, vilket möjliggör selektiv plätering av enskilda hiPSC-CMs. Denna teknik är mycket kompatibel med polymera material som används i klassiska cellodlingsförhållanden. Dessutom, med korrekt rengöring och underhåll, stencilerna är återanvändbara och resistenta mot nedbrytning och proteinabsorption under mikrotillverkningsprocessen. Slutligen är mönstringsprocessen tekniskt robust, billig, anpassningsbar och tillgänglig för dem som inte har några specialiserade bioengineering färdigheter. Denna stencil-baserade mikromönster teknik har i stort sett utnyttjats i våra senaste publikationer modellering olika kardiomyopatier8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av negativa mönster polyimidbaserade stenciler
- Generera ett mönster(bild 2A)i .dxf-format med hjälp av datorstödd designprogramvara (t.ex.
- Generera en cirkel (diameter = 22 mm) för att avgränsa stencilens kant.
- Rita en heldragen form eller det önskade mönstret.
- Inkludera en kiral bokstav (t.ex. R) för att markera stencilernas framsida.
Som ett exempel genereras en matris med fyrkanter och rektanglar för att mönstra iPSC-CMs på encelliga nivåer och cellpar. Designfilerna är tillgängliga (se Tilläggsfiler). Microfabrication upplösningsgränsen är ~10 μm.
- Skicka in designen till ett mikrotillverkningsföretag till laserskuren polyimidfilm och tillverka stenciler (figur 2B,C).
2. Beredning av sulfo-SANPAH alikvoter
PROTOKOLLET ändras från Fischer et al.11.
- Använd en fuktbeständig kartong prov förvaringslåda (t.ex. 100 brunn, 10 x 10 utrymmen för centrifugrör, mått: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Märk det "namn/datum/sulfo-SANPAH 40 μL/rekonstituerat med 1 200 μl PBS".
- Märk 50 mikrocentrifugrör (polypropylen, 1,5 ml) med ett "S" på locket.
- Ta 4 ml vattenfri, extra torr dimetylsulfaoxid (DMSO) och steril filtrera lösningen med hjälp av en membranfilterenhet (porstorlek = 0,22 μm) till ett sterilt koniskt rör på 15 ml.
- Förbered ett flytande kvävebad och täck med locket för att minimera avdunstningen av det flytande kvävet.
- Lös 50 mg sulfo-SANPAH i 2 ml av den filtrerade DMSO.
- Vortex väl att helt lösa upp sulfo-SANPAH i DMSO.
- Fördela 40 μL alikvoter av sulfo-SANPAH-lösningen till sterila 1,5 ml-rör.
- Överför rören till lådan.
- Flash-frysa rören i flytande kväve i 5 min.
- Förvara alikvoterna vid -80 °C.
OBS: Alikvoterna kan användas i upp till 6 månader utan minskad effektivitet. Lagersulfo-SANPAH-koncentrationen är 25 mg/ml eller 50,77 mM.
3. Sterilisering av verktyg
- Autoklav två pincett, 24 glas täcken (22 x 22 mm, nr 1 eller nr 1,5), ett rakblad och tre luddfria absorberande våtservetter.
OBS: För att göra 12 hydrogelkonstruktioner behövs 24 glasöverdrag. Det bör finnas två täcken per konstruktion. Det är lämpligt att förbereda några extra täcken. - Placera två bitar paraffinfilm (4 x 4 tum) i en etanolbeständig plastlåda (t.ex. en 1 000 μL pipettspetslåda) och sterilisera dem i färsk 70% etanol i minst 15 minuter.
4. Beredning av polyakrylamidhydrogelprekursorlösning
Protokollet ändras från Lee et al.12.
- Lös 125 mg aminoetylmetakrylat (AEM) i 36,25 ml avjoniserat vatten i ett 50 ml polypropylencentrifugrör genom att virvla.
- För att förbereda 50 ml 10 kPa polyakristallidprekursorlösning (8–0,15–15 mM), blanda 10 ml 40% akrylamidlösning, 3,75 ml 2% bis akrylamidlösning och 36,25 ml AEM-lösning som bereds i steg 4.1 i ett nytt 50 ml polypropylencentrifugrör.
OBS: Den slutliga koncentrationen av prekursorlösning är 8% akrylamid, 0,15% bis-akrylamid och 15 mM AEM, som mättes ha ~10 kPa styvhet med atomkraftmikroskopi. Enligt vävnadsapplikationer av intresse kan hydrogelns styvhet ändras genom att ändra förhållandet mellan 40% akrylamid till 2% bis-akrylamidlösningen. Till exempel ger 8% akrylamid-0,08% bis-akrylamid lösning 3 kPa hydrogeler; 8% akrylamid–0,48% bis-akrylamidlösning ger 38 kPa hydrogeler; 8% akrylamid–0,48% bis-akrylamidlösning ger 60 kPa hydrogeler. Det är lämpligt att bekräfta styvheten hos hydrogeler gjorda av prekursorlösningarna med förändrade förhållanden.
5. Beredning av fotoinitatorlösning
- För 1 ml 5% fotoinitatorlösning, lös först upp 50 mg 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofenonpulver i 700 μl 100% etanol i ett 1,5 ml polypropylencentrifugrör med lock.
OBS: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofenon är inte lösligt i vatten. Se till att helt lösa upp pulvret i etanol genom att virvla. - Efter att helt ha löst upp 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofenon i etanol genom virvelning, tillsätt 300 μl fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS) för en slutlig volym på 1 ml.
OBS: Den slutliga koncentrationen av 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofenonlösning är 5%. Den omintetgjorda 5% fotoinitatorlösningen är bra i 4 veckor vid 4 °C.
6. Beredning av källaren membran matris proteinlösning
Källarmembranmatris (Tabell över material) är ett temperaturkänsligt material. Se till att arbeta på is med kylda pipetter och rör samt iskall lösningar. Ett nytt lager av källarmembranmatris bör tinas långsamt på is vid 4 °C över natten.
- Förbered 200 μL källarmembranmatrisproteinlösning per hydrogelkonstruktion. För 12 konstruktioner behövs 2,4 ml källarmembranmatrisproteinlösning. Förbered 10 % extra lösning (t.ex. 2,6 ml).
- Optimera utspädningsförhållandet för varje ny sats/parti proteinlösning för källarmembranmatris. För första gången, test utspädningsförhållanden på 1:10, 1:20, 1:40 för att hitta utspädningsförhållandet som ger de bästa egenskaperna för cellmönster.
OBS: Om källaren membran matris proteinlösning är för trögflytande, kommer det att bilda en gel ovanpå stencilen, och det är mer sannolikt att lossna när du tar bort stencilen. Om proteinlösningen är för flytande, kommer den att tränga igenom stencilernas mönsterhål, vilket kommer att resultera i dålig kvalitet. - Späd källarmembranmatrisproteinlagerlösning på is med iskall Dulbeccos modifierade eagle medium/näringsblandning F-12 (DMEM/F12) media eller 1x PBS till det optimerade utspädningsförhållandet ovan. Späd till exempel ut 120 μL av stamlösningen i 2,4 ml DMEM/F12-medium (1:20) och behåll på is för senare användning.
7. Hydrogel tillverkning
- Placera en UV-bänklampa (365 nm, 4 mW/cm2) i en biologisk skyddshuva.
- Placera de steriliserade paraffinfilmerna från steg 3.2 och torka helt under sterila förhållanden. Om paraffinfilmerna inte är helt torra, använd ett vakuumaspirationssystem för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska. Placera sex autoklaverade täcken från steg 3.1 på varje paraffinfilm med hjälp av de autoklaverade pincetten.
- Förbered UV-tvärbindningsbar prekursorlösning för polyarylamid genom att späda ut 5 % fotoinitatorlösning (steg 5.2) med polyakrylamidprekursorlösning (steg 4.2) i ett 50 ml polypropylengengengugrör. För 5 ml UV-tvärbindningsbar polyakristärprekursorlösning, tillsätt 50 μL fotoinitatorlösning till 5 ml polyakrylamidprekursorlösning.
- Filtrera prekursorlösningen från steg 7.3 med en 50 ml-filterenhet med en porstorlek på 0,22 μm för sterilisering.
OBS: Förbered alltid ny prekursorlösning. - Fördela 200 μL polyakrylamidprekursorlösning från steg 7.4 på varje 22 x 22 mm glaslocksglidning i den paraffinfilmade petriskålen och täck försiktigt med ytterligare 22 x 22 mm glasskydd ovanpå till sandwich lösningen däremellan (figur 3A).
OBS: Paraffinfilm används för att undvika spill och för att begränsa prekursorlösningen mellan täcken. - Placera täckglaset som innehåller petriskål från steg 7.5 under UV-bänklampan och fotopolymerisera hydrogelerna med polyakrylamid i 5 min (figur 3B).
OBS: Om ytan inte är vit minskar uv-absorbansen på ytan fotokorsens effektivitet. Täckningen av vitt papper på den icke-vita ytan är viktigt för att minimera UV-intensitet förlust. För att skydda mot UV-strålning, täck lampan med aluminiumfolie och använd UV-skyddsglasögon. - Ta försiktigt bort ett lock glida av från den andra med hjälp av ett rakblad genom hävstångseffekt(Figur 3C).
OBS: Hydrogelen fastnar vanligtvis på det övre täcket. Var extra uppmärksam när du kopplar bort täcket från den mjuka hydrogelen, eftersom det är sannolikt att bryta. - Fyll en engångspolypropylenreservoar med PBS. Överför hydrogel-täcken kompositer i en PBS-innehållande reservoar för att skölja hydrogelerna i PBS i 5 min. Efter sköljning, placera hydrogelkonstruktionen tillbaka på paraffinfilmen i petriskålen.
8. Konjugering av protein
- Förbered en ishink och förkyld PBS.
OBS: För sex hydrogeler behövs 1 200 μl kall PBS. - Ta ut sulfo-SANPAH aliquot (1 injektionsflaska = 6 geler).
OBS: Vid behov kan mängden sulfo-SANPAH som används minskas efter optimering. - Tillsätt 1 200 μl kall PBS i en flaska sulfo-SANPAH aliquot och blanda genom pipettering upp och ner.
- Fördela 200 μL sulfo-SANPAH på paraffinfilmen i petriskålen och täck med hydrogel-täckslipkompositen med hydrogel som kontaktar sulfo-SANPAH (figur 3D).
OBS: Sulfo-SANPAH är mycket känslig för vatten på grund av hydrolys. Ny tina från -80 °C precis före användning. Återanvänd inte eller frys inte batterierna. - Exponera hydrogeln för UV-lampan på 365 nm, 4 mW/cm2 i 5 min för att aktivera sulfo-SANPAH.
OBS: Efter exponering kommer sulfo-SANPAH att ändras från orange till brunt (figur 3E). Om hydrogelen blir brun indikerar det en lyckad aktivering av fenylazidgruppen av sulfo-SANPAH och införlivande av sulfo-SANPAH på hydrogelen. Fortsätt direkt med steg 8.6−8.9 inom högst 10 minuter, eftersom aktiviteten hos sulfo-SANPAH kommer att minska. - Fyll på en engångspolypropylenbehållare med färsk PBS. Efter aktivering av sulfo-SANPAH, överför de aktiverade hydrogelerna och skölj snabbt hydrogelerna i en PBS-reservoar för att avlägsna obunden sulfo-SANPAH.
OBS: En lång tvätt kan resultera i låg proteinkonjugeringseffektivitet. - Efter en snabb sköljning, placera hydrogel-fäst täcken på paraffinfilmen i petriskålarna och badda försiktigt hydrogelerna med sterila luddfria våtservetter.
OBS: Den återstående PBS ovanpå hydrogel kommer att resultera i läckage av källaren membran matris proteinlösning genom stencilen, och torkning för omfattande kommer att leda till bristning av hydrogelen vid avlägsnande av stencilen på grund av för hög anslutning till stencilen. - Placera stencilen ovanpå hydrogelerna och badda med autoklaverfria våtservetter för att säkerställa tät tätning mellan stencilen och hydrogelen (figur 3F).
- Fördela försiktigt 200 μL av den utspädda källarmembranmatrisproteinlösningen framställd från steg 6.3 (figur 3G) ovanpå. Låt lämnas över natten i inkubatorn (37 °C).
OBS: När stencil-hydrogelkontakten är tät och koncentrationen av källarenmembranmatrisproteinlösning är optimal, kommer proteinlösningen för källarmembranmatrisen att bindas och ligga kvar ovanpå stencilen (figur 3H). Inkubationstiden kan minskas vid optimering. Teoretiskt kan det reduceras ner till 30 min–2 h. - Nästa dag, överför hydrogelerna till en 6-brunnsplatta och helt doppa dem i PBS.
OBS: Det rekommenderas att skala av stencilen med PBS nedsänkning över täcket för att förhindra att hydrogelen slits sönder och fastnar i stencilen. - Ta försiktigt bort stencilen med autoklaver pincett utan att riva hydrogelen. Resuspend väl med DMEM, returnera mönstrade hydrogeler till inkubatorn, och lämna dem över natten för att testa för eventuell kontaminering.
- Om mediet förblir klart, är hydrogelerna redo att användas för cellplätering. Optimera cellpläteringsdensiteten och inkubationstiden så att cellernas vidhäftning för respektive tillämpningar kan vidhäfta.
OBS: För encelliga mönster av hiPSC-CMs, utsäde och inkubera över natten. Följande cellnummer rekommenderas för sådd: 30 000, 60 000 och 90 000 celler/brunn. Sådd för många celler leder till mer än en cell per mönster. En cellsil rekommenderas att sila ut icke-enstaka celler före cellsutsådd. - Nästa dag, observera cellbilatur och spridning, och ändra media för att bli av med fristående celler.
9. Rengöring av de använda stencilerna
- För att avlägsna restmatrisproteiner på de använda stencilerna, doppa stencilerna i enzymlösning (Tabell över material) i 10 min vid 37 °C.
OBS: Enzymet bör väljas beroende på vilka matrisproteiner som används. För kollagen-rik matris proteinlösning, använd kollagenas. En 10-15 min ultraljud i enzymlösning rekommenderas också. - Sug upp lösningen och fyll på med 10% blekmedel. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
- Skölj 3x med PBS.
- Förvaras i 70% etanol vid 4 °C tills den används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillverkning av stenciler som innehåller en matris med kvadrater eller rektanglar har påvisats (figur 4A). Efter detta protokoll erhöll vi mönstrade matrisproteinöar (figur 4B och figur 5A) och celler (figur 4C). Koncentrationen av suboptimala matrisproteinlösning ledde till suboptimala mönster (figur 5B). Det är viktigt att använda stencilens framsida. Om stencilens baksida används ökar matrisproteinöarnas storlek på grund av laserskärningens riktning (figur 6A,B). Även om bredden på de rektangulära mönstren inte signifikant förändrades (figur 6C), ökade höjden signifikant vid användning av stencilens baksida, vilket ledde till en minskning av det avsedda bildförhållandet (figur 6D,E). Vi använde stencil-baserade mönster på kisel elastomer substrat (figur 7). De mönstrade kardiomyocyterna på silikon elastomersubstrat visualiserades av immunocytokemi av hjärttroponin T vid låg förstoring (figur 7A) och sarcomeric protein α-aktinin vid hög förstoring (figur 7B). Stencil-baserade mönster kan också tillämpas på mönster två kardiomyocyter sida vid sida på hydrogeler med olika styvhet. Som en demonstration visar vi kardiomyocytmönster på fysiologiskt relevant styvhet (figur 8A) och patologiskt relevant styvhet (figur 8B).
Figur 1: Schematisk av tre guld-standard mikromönster strategier. (a)Fotolitografi. (B)Microcontact-utskrift. (C)Mikrofluidisk mönstring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Arbetsflöde för att utforma stenciler. a) Stencilens datorstödda utformning. b)Ett representativt fotografi av en laserskuren polyimidstencil. CC) En representativ mikroskopisk bild av en stencil. Det gula området representerar polyimidstencilen, medan det ljusblå området representerar en rad laserskurna hål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fotografier av hydrogeltillverkningssteg. (A)Polyakrylamid hydrogel tillverkning genom sandwiching prekursorlösningen i mellan två täcken. (B)UV-foto-crosslinking av polyakrylamid hydrogeler under UV-bänklampan. UV-lampan är täckt med aluminiumfolie för användarskydd. (C)Den foto-crosslinked hydrogel hämtas genom att lossa ett täckslip på ena sidan. (D)Hydrogelkonstruktionen är i kontakt med sulfo-SANPAH-lösning för att modifiera hydrogeln för ECM-proteininkorporering. Före UV-aktivering är sulfo-SANPAH orange. (E)Efter UV-aktivering blir sulfo-SANPAH brun, vilket indikerar att den är aktiverad och inbyggd på hydrogelytan. (F)Efter dabbing hydrogel med sterila luddfria våtservetter för att avlägsna överflödigt vatten, är stencilen placeras på hydrogelen. (G)Källarmembranmatrisproteinlösningen är rörs över stencil-hydrogelkonstruktionerna. H)Om stencil-hydrogelkontakten är ordentligt tät, kommer källaren membran matris proteinlösningen stanna på toppen och kommer inte att sippra igenom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mikromönsterning av källarmembranmatrisproteiner och humaninducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) med olika rektangulära former. (A)Mikroskopiska bilder av stenciler som innehåller laserskurna rektanglar med olika proportioner (1:1, 4:1, 11:1). B)Representativa bilder av immunostainerade matrisproteinöar på hydrogelsubstrat. (C)Representativa bilder av hiPSC-CMs färgas för kärnor (cyan) och hjärt troponin T (magenta). Skala bar = 20 μm för paneler B och C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ECM-proteinkoncentrationen spelar en viktig roll för att skapa lämpliga mönster. (A) Representativ bild av en optimal koncentration med mycket homogen fördelning av källarmembranmatrisproteiner i de enskilda mönstren. ( B)Suboptimala matrisproteinmönster på grund av låg koncentration, vilket orsakade läckage av matrisprotein utanför mönster och låga mängder matrisproteiner inom de mönster som bestäms av vetegroddaragglutininfärgning. Skala bar = 20 μm för panelerna A och B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Stencil bieffekt. (A) Källarmembran matris proteinmönster när framsidan av stencilen användes. (B) Källarmembran matris proteinmönster när baksidan av stencilen användes. Kvantifiering av(C)bredd, (D) höjd, (E) bildförhållande av rektangulära källare membran matris protein öar. Grafen ritas medelvärdet ± SEM. Statistiken beräknas av oparad student T-test. n.s. = inte signifikant. = p < 0,0001. Skala bar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Stencilbaserat mönster på kiselelastereteriersubstrat. (A)En representativ bild av encellsmöntrade kardiomyocyter på kisel elastomersubstrat som färgats av hjärtmarkören, hjärttroponin T (cTnT), vid låg förstoring. Skalan = 300 μm. (B) En representativ encellig kardiomyocyt som färgats av sarcomeric protein α-aktinin vid hög förstoring. Skala bar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Mikromönsterning av hiPSC-CMs på polyakrylamidhydrogeler med olika styvhet. (A)10 kPa,( B) 60 kPa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Problemet observerats | Möjlig orsak | Lösning |
| 1.1 | Mönsterstorleken är större än förväntat | Stencilen är vänd | Inkludera en kiral bokstav/form i stencilens design för att ange stencilernas fram- och baksida |
| 8.1 | Hydrogel frakturer vid peeling stenciler | Hydrogel fastnar på stenciler | Rengöring av stenciler |
| Torka inte hydrogel för mycket innan du sätter stenciler | |||
| 8.13 | Cellbilagan är suboptimal | Nedst nedskurna sulfo-SANPAH | Använd nya sulfo-SANPAH |
| Ineffektiv proteininblandning | Förbered ny ECM-proteinlösning | ||
| Gammal ECM-proteinlösning | |||
| 8.13 | Cellmönster är suboptimalt | Källarmembranmatrisproteinlösning spiller över | Utför immunfiltning med fluoroforekonjugerad antimus IgG-antikropp eller vetegroddaragglutinin för att undersöka fördelningen av källarmembranmatrisproteinlösning på hydrogel |
| 8.13 | Mer än en cell på en plats | Inte i encellig suspension | Använd 40−70 μm cellsil för att få single cell suspension |
| Sådensiteten inte optimal | Optimera sådensiteten från 30 k till 90 k per ml |
Tabell 1: Riktlinjer för felsökning. Frekventa problem, möjliga orsaker och potentiella lösningar diskuteras.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en litografifri stencilbaserad mikromönstermetod som möjliggör effektiv mönstring av vidhäftande celler. I detta protokoll visar vi mönstring av hiPSC-CMs i olika längd-till-bredd nyckeltal av micropatterning källaren membran matris protein öar på polyacrylamide hydrogels med fysiologiskt- eller patologiskt relevanta vävnad stelheter eller kisel-baserade elastomer substrat. Denna metod är relativt enkel och mycket tillgänglig för alla forskare, inklusive de som har liten bakgrund inom fotolitografi och mikrotillverkningstekniker. Den beskrivna metoden kringgår betydande utmaningar i samband med att generera frimärken med hjälp av mjuk litografi och överföra proteiner från frimärksformar till substrat av intresse som är involverade i mikrokontakt tryckteknik. Det här protokollet ger ett arbetsflöde till 1) skapa specialdesignade stenciler med ett område och form av intresse på ett kostnadseffektivt sätt. 2) tillverka en hydrogel substrat med styvhet av intresse; och 3) effektivt konjugera ECM-proteiner på hydrogelsubstratet.
Traditionella mjuka litografimetoder har använts för att mönstra olika former av ECM-proteiner, inklusive trianglar och stjärnor på substrat av olika material såsom kiselbaserade material och glasöverdrag13,,14. I denna studie visar vi bara rektangulära mönster med tanke på fysiologiskt- och patologiskt relevanta formen av kardiomyocyter. Vi tror stencil-baserade mönster av andra komplexa former kan fungera så länge den minsta funktionen i formen inte går utöver upplösningen (~ 10 μm). När det gäller substratmaterial visar vi att stencilbaserade mönster kan tillämpas på hydrogel (figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 och figur 8) eller kiselbaserade elastomersubstrat (figur 7). Den presenterade metoden fungerar inte på substrat med minimal limhet till polyimidmaterial såsom vävnadsodlingsplaster och glasöverdragsglas eftersom den täta tätningen mellan den polyimidbaserade stencilen och dessa substrat inte uppnås. För att möjliggöra tät tätning krävs ytterligare ytmodifiering. Slutligen visar vi att metoden kan användas för att på ett tillförlitligt sätt producera cellparmönster på hydrogeler med olika styvhet (dvs. 10 kPa, 60 kPa) (figur 8).
I protokollet är det mest kritiska steget optimering av ECM-proteinkoncentration (protokollavsnitt 6). Målet med detta steg är att hitta den optimala koncentrationen av ECM-protein som är trögflytande nog för att hämma proteinlösningen för att sippra genom hålen i stencilen, men inte alltför koncentrerad, för att undvika gelering (figur 5). Denna stencilbaserade metod begränsar inte typen av ECM-protein. Även om viskös ECM proteinlösning är mer benägna att stanna på toppen av stencilen, kan ett mindre trögflytande protein också användas. Ett krav är att se till att ytorna på stencilen och PA hydrogel är tillräckligt torra för att bilda ett relativt stabilt hydrofoba gränssnitt. I denna demonstration, källaren membran matris protein användes eftersom det är trögflytande och lämplig för odling hiPSC-CMs. Andra ECM-proteiner kan dock sannolikt användas (t.ex. fibronectin, gelatin, kollagen, laminin).
Förutom optimering av ECM-proteinlösningen för varje given applikation är det viktigt att generera en ordentlig tätning mellan stencilen och hydrogelytan för att få ett exakt mönster med ECM-proteinet. Eftersom överdriven torkning kan leda till rupturing av hydrogel, är det viktigt att inte överdry stencilen. Dessa steg (dvs. placera stencilen på hydrogel samt försiktigt pealing bort det efteråt) kräver viss övning. Om du upprättar ett optimalt hanteringsförfarande för varje givet tillstånd undviks också att hydrogelen fastnar på stencilerna. Med denna optimering, submicron skala laser brännskador som orsakas av brister i laserskärningen kommer inte att väsentligt påverka tekniken när det gäller hydrogel skador.
Ett annat viktigt steg är att använda stencilens framsida när stencilen placeras på hydrogelsubstratet. Vi fann att användning av varje sida har en effekt på substratet, förmodligen på grund av laserskärning (figur 6). En rekommendation när du mönstrar celler i viss storlek eller form för första gången är att generera en optimeringstencil. Stencil-design funktioner inte nödvändigtvis matchar de slutliga mönstrade cellstorlekar. Vi rekommenderar att du skapar en optimeringsstencil som innehåller en övertoning av funktionsstorlekar. Vi har tagit fram en tabell med potentiella problem och möjliga lösningar för felsökning (tabell 1).
Det är inte nödvändigt att använda samma mikrotillverkning företag som nämns i detta manuskript. Nycklarna till exakt generering av stencilen är laserns stråldiameter och stencilfilmens tjocklek, i vårt fall polyimid (50 μm). Vi tror att ett laserlabb utrustat med en lämplig laser kan generera stencilen med några få steg, optimera laserintensitet, justering och andra variabler. Även om vi bara har arbetat med ett företag, det finns många tillgängliga företag som utför precision laserskärning.
En begränsning av den här metoden är upplösning. Medan fotolitografi kan uppnå nanoskala upplösning, stencil-baserade mönsterupplösning är begränsad till upplösningen av laserskärning av polyimidstenciler, som hittills är oftast på skalan av några mikrometer (~ 10 μm). Med tanke på att den genomsnittliga cellstorleken är över 10 μm är upplösningen i allmänhet tillämplig på alla enstaka cellmönster.
Sammanfattningsvis ger denna metod mångsidiga plattformar för att studera cell-ECM interaktioner, undersöka cellstruktur-funktion korrelation, och många andra tillämpningar. Vi tror att detta protokoll kommer att gynna många biomedicinska forskare och underlätta encelliga studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av postdoktorala stipendium från Stanford Child Health Research Institute (CHRI) och National Institute of Health (1F32HL1422205-01) till S.L, Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann och Schroepfer Foundation och Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine till S.M.W , utmärkelser från National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) och tobaksrelaterat sjukdomsforskningsprogram (TRDRP 27IR-0012) till J.C.W, American Heart Association (AHA) Postdoc Fellowship Award (18POST34030106) till H.Y och Hengstberger-stipendiet till TS. Vi tackar Dr Andrew Olsen från Stanford Neuroscience Microscopy Service på stöd av konfokal avbildning av micropatterned hiPSC-CM. Vi tackar H.Y. för första stencil design, tillverkning, single cell micropatterning av iPSC-CM på polyacrylamide hydrogel belagda coverslip, och preliminära confocal imaging av sarkomerstrukturen av encelliga micropatterned iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
