Summary
Denne protokollen introduserer en litografifri mikromønstermetode som er enkel og tilgjengelig for de med begrenset bioingeniørbakgrunn. Denne metoden benytter tilpassede laserkuttede sjablonger til mikromønster ekstracellulære matriseproteiner i en form av interesse for modulerende cellemorfologier. Prosedyren for mikromønster er demonstrert ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle avledet kardiomyocytter.
Abstract
Mikromønsterteknikker har blitt mye brukt i cellebiologi for å studere effekter av å kontrollere celleform og størrelse på celleskjebnebestemmelse ved encelleoppløsning. Dagens toppmoderne mikromønsterteknikker for én celle innebærer myk litografi og mikrokontaktutskrift, som er en kraftig teknologi, men krever opplærte ingeniørferdigheter og visse anleggsstøtte i mikrofabrikasjon. Disse begrensningene krever en mer tilgjengelig teknikk. Her beskriver vi en enkel alternativ litografifri metode: sjablongbasert enkeltcellemønster. Vi tilbyr trinnvise prosedyrer, inkludert sjablongdesign, polyakrylamidhydrogelfabrikasjon, sjablongbasert proteininkorporering og celleplating og kultur. Denne enkle metoden kan brukes til å mønstre en rekke så mange som 2000 celler. Vi demonstrerer mønsteret av kardiomyocytter avledet fra enkelt humant indusert pluripotente stamceller (hiPSC) med forskjellige celleformer, fra en 1:1 kvadrat til et 7:1 voksen kardiomyocyte-lignende rektangel. Denne sjablongbaserte enkeltcellemønsteret er litografifri, teknisk robust, praktisk, billig og viktigst tilgjengelig for de med begrenset bioingeniørbakgrunn.
Introduction
Bruk av hiPSCer og den påfølgende utviklingen av protokoller for deres rettet differensiering i forskjellige celletyper har gjort det mulig å studere utvikling og sykdom på molekylært og pasientspesifikt nivå, spesielt ved hjelp av pasientavledede iPSC kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å modellere kardiomyopatier1,2. En stor begrensning for å studere utvikling og fysiologi ved hjelp av iPSC-systemet og andre in vitro-modeller er imidlertid fraværet av et strukturert mikromiljø. I situ blir celler utsatt for begrensningene i den ekstracellulære matrisen (ECM), samt nærliggende celler. Den spesielle biokjemiske sammensetningen og stivheten i disse mikromiljøene dikterer den romlige fordelingen av celler, samt faktorer som er tilgjengelige for å engasjere seg i cellevedhesjon. Dette påvirker i sin tur intracellulære signalveier, genuttrykk og celleskjebnebestemmelse. For eksempel har mikromønstret iPSC-CM i en voksen-lignende stangform en betydelig bedre kontraktile evne, kalsiumstrøm, mitokondrieorganisasjon, elektrofysiologi og tverrgående tubuleformasjon3. Dermed er mikromiljøets egenskaper integrert i reguleringen av cellulære funksjoner.
Tidligere mikromønsterteknikker var sterkt avhengige av fotolitografi (Figur 1A). I denne teknikken er et lag med fotosensitiv polymer, eller fotoresist, spunnet på et flatt substrat fra løsning for å danne en tynn film ca 1 μm tykk. Deretter påføres ultrafiolett (UV) lys på fotoresist gjennom en maske som inneholder ønsket mønster. Eksponering for ultrafiolett (UV) lys endrer kjemisk fotoresist ved å endre sin løselighet i sin respektive utviklerløsning, overføre ønsket mønster fra masken til substratet. Mange mikromønstermetoder inneholder fotolitografi, da den gir nanometer til mikrometernivåkontroll over utformingen av cellemønstrene. Imidlertid er spinningen av fotoresist svært følsom for urenheter, fordi de minste støvpartiklene vil forstyrre spredningen av løsningen til en tynn film. Fotolitografi må derfor utføres i uforurensede anlegg, som er kostbare å vedlikeholde og kreve spesiell kompetanse å utnytte. I tillegg er kjemikaliene som brukes i fotolitografi ofte giftige for celler og kan denature viktige biomolekyler. Dermed utgjør fotolitografi betydelige hindringer for fabrikasjon av mikromønstre for praktiske biologiske applikasjoner.
I 1994 overvant Whitesides og kolleger4 noen av utfordringene knyttet til fotolitografi ved å banebryte en samling teknikker kalt myk litografi. I myk litografi brukes en mikrostrukturert overflate laget med polydimethylsiloxane (PDMS), et gjennomsiktig, gummilignende materiale, til å generere et mønster av ECM-proteiner4. Vanlige myke littografiske teknikker inkluderer mikrokontaktutskrift og mikrofluidisk mønster. I mikrokontaktutskrift, for tiden den mest populære myke littografiske metoden, overfører et PDMS-stempel belagt med ECM-proteiner materialet til en overflate på områdene som kontaktes av stempelet (Figur 1B). I mikrofluidisk mønster er mikrostrukturer utformet på en PDMS-overflate slik at når stempelet trykkes til et substrat, opprettes et nettverk av mikrokanaler, der væsker kan leveres til ønskede områder, (Figur 1C)5. Myk litografi gir flere fordeler over fotolitografi. Når en master wafer er mikrofabrikkert, pdms frimerker kan lett replikeres uten videre sysselsetting av rene rom fasiliteter. I tillegg tillater fraværet av organiske løsemidler i prosessen med myk litografi for utnyttelse av polymere materialer som polystyren, vanligvis brukt i cellekultur. Til slutt er mikromønster ved hjelp av myke littografiske metoder ikke begrenset til flate overflater. Dermed øker myk litografi tilgjengeligheten og funksjonaliteten til mikromønsterfabrikasjon over fotolittografi6. Imidlertid har myk litografi betydelige ulemper. For eksempel er et innledende etsningstrinn, ved hjelp av fotolitografi, fortsatt nødvendig for å mikrofabrikkere stempelet. I tillegg er mikromønster ved hjelp av et PDMS-stempel gjenstand for variasjoner i kvaliteten på proteinoverføring på substratet6. Unngå disse avvikene krever optimalisering og konsistens i trykket som brukes på PDMS-stempelet under proteinoverføring, ellers kan deformasjon og forvrengning av funksjonsstørrelsene til PDMS-formene forekomme6. Det er også en stor bekymring for gjentatte ganger å bruke PDMS på grunn av liten molekylabsorpsjon7.
For å unngå å bruke myk fotolitografi og PDMS-frimerker, beskriver vi en sjablongbasert, litografifri mikromønstermetode for én celle som overvinner mange av hindringene forbundet med fotolitografi og myk litografi. I denne metoden brukes en polyakrylamidhydrogel som et substrat for sjablongbasert ECM-proteininkorporering, noe som muliggjør selektiv plating av enkelthiPSC-CMs. Denne teknikken er svært kompatibel med polymere materialer som brukes i klassiske cellekulturforhold. Videre, med riktig rengjøring og vedlikehold, er sjablongene gjenbrukbare og motstandsdyktige mot nedbrytning og proteinabsorpsjon under mikrofabrikasjonsprosessen. Til slutt er mønsterprosessen teknisk robust, billig, tilpassbar og tilgjengelig for de uten spesialiserte biotekniske ferdigheter. Denne sjablongbaserte mikromønsterteknikken har blitt bredt benyttet i våre nyere publikasjoner modellering varierte kardiomyopatier8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av negativt mønster polyimidbaserte sjablonger
- Generer et mønster (Figur 2A) i .dxf-format ved hjelp av dataassistert designprogramvare (f.eks. AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Generer en sirkel (diameter = 22 mm) for å avgrense grensen til sjablongen.
- Tegn en heldekkende form eller ønsket mønster.
- Ta med en kiralbokstav (f.eks. r) for å merke forsiden av sjablongene.
MERK: Som et eksempel genereres en rekke firkanter og rektangler til mønster iPSC-CMer på encellede og celleparnivåer. Designfilene er tilgjengelige (se Tilleggsfiler). Mikrofabrikasjonoppløsningsgrensen er ~ 10 μm.
- Send design til et mikrofabrikasjonsselskap til laserskåret polyimidfilm og fabrikat sjablonger (Figur 2B,C).
2. Tilberedning av sulfo-SANPAH aliquots
MERK: Protokollen er endret fra Fischer et al.11.
- Bruk en fuktbestandig oppbevaringsboks for pappprøve (f.eks. 100 brønn, 10 x 10 plasser for sentrifugerør, dimensjoner: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Merk det "navn/dato/sulfo-SANPAH 40 μL/rekonstituert med 1200 μL PBS".
- Merk 50 mikrosentrifugerør (polypropylen, 1,5 ml) med en "S" på lokket.
- Ta 4 ml vannfri, ekstra tørr dimetylsulfoksid (DMSO) og sterilt filter oppløsningen ved hjelp av en membranfilterenhet (porestørrelse = 0,22 μm) i et sterilt 15 ml konisk rør.
- Forbered et flytende nitrogenbad og dekk med lokket for å minimere fordampningen av flytende nitrogen.
- Oppløs 50 mg sulfo-SANPAH i 2 ml av den filtrerte DMSO.
- Vortex godt for å fullstendig oppløse sulfo-SANPAH i DMSO.
- Fordel 40 μL aliquots av sulfo-SANPAH-oppløsningen til sterile 1,5 ml rør.
- Overfør rørene inn i esken.
- Blits rørene i flytende nitrogen i 5 min.
- Oppbevar aliquots ved -80 °C.
MERK: Aliquots kan brukes i opptil 6 måneder uten redusert effektivitet. Lagersulfo-SANPAH konsentrasjonen er 25 mg/ml eller 50,77 mM.
3. Sterilisering av verktøy
- Autoklav to tang, 24 glassdeksellepper (22 x 22 mm, nr. 1 eller 1,5), ett barberblad og tre lofrie absorberende servietter.
MERK: For å lage 12 hydrogelkonstruksjoner er det nødvendig med 24 glassdeksel. Det bør være to coverslips per konstruksjon. Det anbefales å forberede noen ekstra coverslips. - Plasser to stykker parafinfilm (4 x 4 tommer) i en etanolresistent plastboks (f.eks. en 1000 μL pipettespissboks) og steriliser dem i frisk 70% etanol i minst 15 min.
4. Tilberedning av polyakrylamidhydrogelforløperløsning
MERK: Protokollen er endret fra Lee et al.12.
- Oppløs 125 mg aminoetylmetakrylat (AEM) i 36,25 ml deionisert vann i et 50 ml polypropylensensentrifugerør ved å virvlende.
- For å forberede 50 ml 10 kPa polyakrylamidforløperløsning (8–0,15–15 mM), bland 10 ml 40 % akrylamidløsning, 3,75 ml 2 % bis-akrylamidløsning og 36,25 ml AEM-løsningen utarbeidet i trinn 4.1 i et nytt 50 ml polypropylencentrifugerør.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av forløperløsning er 8% akrylamid, 0,15% bis-akrylamid og 15 mM AEM, som ble målt til å ha ~ 10 kPa stivhet ved atomkraftmikroskopi. Ifølge vevsanvendelsene av interesse kan hydrogelens stivhet endres ved å endre forholdet mellom 40 % akrylamid til 2% bis-akrylamidløsningen. For eksempel gir 8% akrylamid-0,08% bis-akrylamidløsning 3 kPa hydrogeler; 8% akrylamid–0,48 % bis-akrylamidoppløsning gir 38 kPa hydrogeler; 8% akrylamid–0,48 % bis-akrylamidoppløsning gir 60 kPa hydrogeler. Det anbefales å bekrefte stivheten av hydrogeler laget av forløperløsningene med endrede forhold.
5. Tilberedning av fotoinitiatoroppløsning
- For 1 ml 5% fotoinitiatoroppløsning, først oppløse 50 mg 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyethoxy)-2-metylpropiophenone pulver i 700 μL av 100% etanol i et 1,5 ml polypropylensentrifugerør med lokk.
MERK: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone er ikke løselig i vann. Pass på å oppløse pulveret fullt ut i etanol ved å virvle. - Etter fullstendig oppløsning av 2-hydroksy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone i etanol ved virvlende, tilsett 300 μL fosfatbufret saltvann (PBS) for et endelig volum på 1 ml.
MERK: Den endelige konsentrasjonen av 2-hydroksy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone løsning er 5%. Den foliede 5% fotoinitiatoroppløsningen er bra i 4 uker ved 4 °C.
6. Utarbeidelse av kjellermembranmatriseproteinløsning
MERK: Kjellermembranmatrise (Materialtabell) er et temperaturfølsomt materiale. Sørg for å jobbe med is med kjølte pipettespisser og rør samt iskalde løsninger. Et nytt lager av kjellermembranmatrise bør tines sakte på is ved 4 °C over natten.
- Forbered 200 μL av kjellermembranmatriseproteinløsning per hydrogelkonstruksjon. For 12 konstruksjoner er det nødvendig med 2,4 ml proteinløsning for kjellermembranen. Forbered 10 % ekstra oppløsning (f.eks. 2,6 ml).
- For hver ny batch / mye kjeller membran matrise protein løsning, optimalisere fortynning forholdet. For første gang, test fortynning prosenter på 1:10, 1:20, 1:40 for å finne fortynning forholdet som gir de beste egenskapene for celle mønster.
MERK: Hvis proteinoppløsningen i kjellerens membranmatriseer er for viskøs, vil den danne en gel på toppen av sjablongen, og det er mer sannsynlig å skrelle av når du fjerner sjablongen. Hvis proteinoppløsningen er for flytende, vil den trenge gjennom mønsterhullene i sjablongene, noe som vil resultere i dårlig kvalitetsmønster. - Fortynn kjellermembranmatriseproteinlagerløsning på is med iskalde Dulbeccos modifiserte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) medier eller 1x PBS til det optimaliserte fortynningsforholdet ovenfor. For eksempel fortynn 120 μL av lageroppløsningen i 2,4 ml DMEM/F12-medier (1:20) og hold på is en senere bruk.
7. Hydrogel fabrikasjon
- Plasser en UV-benklampe (365 nm, 4 mW/cm2) i en biologisk sikkerhetshette.
- Plasser de steriliserte parafinfilmene fra trinn 3.2 og tørk helt under sterile forhold. Hvis parafinfilmene ikke er helt tørre, bruk et vakuumaspirasjonssystem for å fjerne eventuell gjenværende væske. Plasser seks autoklappe coverslips fra trinn 3.1 på hver parafinfilm ved hjelp av autoklavede tang.
- Forbered UV-krysskoblingsmiddel polyakrylamidforløperløsning ved å fortynne 5% fotoinitiatoroppløsning (trinn 5.2) med polyakrylamidforløperløsning (trinn 4.2) i et 50 ml polypropylensensentrifugerør. For 5 ml UV-krysskoblelig polyakrylamidforløperløsning, tilsett 50 μL av 5% fotoinitiatorløsning til 5 ml polyakrylamidforløperløsning.
- Filtrer forløperløsningen fra trinn 7.3 ved hjelp av en 50 ml filterenhet med en 0,22 μm porestørrelse for sterilisering.
MERK: Lag alltid ny forløperløsning. - Dispenser 200 μL polyakrylamidforløperoppløsning fra trinn 7.4 på hver 22 x 22 mm glassdekselslip i parafinen som er filmet Petriskål og dekk forsiktig med en annen 22 x 22 mm glassdekselslip på toppen for å sandwich løsningen i mellom (Figur 3A).
MERK: Parafinfilm brukes til å unngå søl og for å begrense forløperløsningen mellom coverslipsene. - Plasser den dekkskliholdige petriskålen fra trinn 7.5 under UV-benkelampen og fotopolymeriser polyakrylamidhydrogelene i 5 min (Figur 3B).
MERK: Hvis overflaten ikke er hvit, reduserer UV-absorbansen av overflaten fotocrosskoblingseffektiviteten. Dekningen av hvitt papir på den ikke-hvite overflaten er viktig for å minimere UV-intensitetstapet. For å beskytte mot UV-stråling, dekk lampen med aluminiumsfolie og bruk UV-beskyttelsesbriller. - Ta forsiktig av det ene dekselet fra det andre ved hjelp av et barberblad ved å utnytte handling (Figur 3C).
MERK: Hydrogelen holder seg vanligvis til den øverste dekkseddelen. Vær ekstra oppmerksom når du løsner dekkslipen fra den myke hydrogelen, fordi det sannsynligvis vil bryte. - Fyll et engangs polypropylenreservoar med PBS. Overfør hydrogel-coverslip kompositter i en PBS-inneholdende reservoar for å skylle hydrogelene i PBS i 5 min. Etter snking, plasser hydrogelkonstruksjonen tilbake på parafinfilmen i Petri-fatet.
8. Protein konjugering
- Forbered en isbøtte og forkjøle PBS.
MERK: For seks hydrogeler er det nødvendig med 1200 μL kald PBS. - Ta ut sulfo-SANPAH aliquot (1 hetteglass = 6 geler).
MERK: Om nødvendig kan mengden sulfo-SANPAH som brukes reduseres etter optimalisering. - Tilsett 1200 μL kald PBS i et hetteglass med sulfo-SANPAH aliquot og bland ved å pipe opp og ned.
- Dispenser 200 μL sulfo-SANPAH på parafinfilmen i Petriskålen og dekk med hydrogel-coverslip kompositt med hydrogel kontakt sulfo-SANPAH (Figur 3D).
MERK: Sulfo-SANPAH er svært utsatt for vann på grunn av hydrolyser. Nytinfra -80 °C rett før bruk. Ikke gjenbruk eller frys rester på nytt. - Utsett hydrogelen på UV-lampen ved 365 nm, 4 mW/cm2 i 5 min for å aktivere sulfo-SANPAH.
MERK: Etter eksponering vil sulfo-SANPAH skifte fra oransje til brun (figur 3E). Hvis hydrogelen blir brun, indikerer den vellykket aktivering av fenylazidgruppen av sulfo-SANPAH og inkorporering av sulfo-SANPAH på hydrogelen. Fortsett direkte med trinn 8,6−8,9 innen maksimalt 10 min, fordi aktiviteten til sulfo-SANPAH vil avta. - Fyll et engangs reservoar med polypropylen med fersk PBS. Etter sulfo-SANPAH-aktivering, overfør de aktiverte hydrogelene og skyll hydrogelene raskt i et PBS-reservoar for å fjerne ubundet sulfo-SANPAH.
MERK: En lang vask kan føre til lav proteinkonjugeringseffektivitet. - Etter en rask skylling, legg de hydrogel-festet coverslips på parafinfilmen i Petri-rettene og dab forsiktig hydrogelene med sterile lofrie kluter.
MERK: Den gjenværende PBS på toppen av hydrogelen vil resultere i lekkasje av kjelleren membran matrise protein løsning gjennom sjablongen, og tørking for mye vil føre til brudd på hydrogel ved fjerning av sjablongen på grunn av for høy overholdelse av sjablongen. - Plasser sjablongen på toppen av hydrogelene og dab med autoklet lofrie kluter for å sikre tett forsegling mellom sjablongen og hydrogelen (figur 3F).
- Dispenser forsiktig 200 μL av den fortynnede kjellermembranens matriseproteinløsning utarbeidet fra trinn 6.3 (Figur 3G) på toppen. La natten stå i inkubatoren (37 °C).
MERK: Når sjablong-hydrogelkontakten er stram og konsentrasjonen av proteinløsning i kjellerens membranmatriseer er optimal, vil proteinoppløsningen i kjellerens membranmatrisebli sequestered og forbli på toppen av sjablongen (Figur 3H). Inkubasjonstiden kan reduseres ved optimalisering. Teoretisk sett kan det reduseres ned til 30 min-2 t. - Neste dag overfører du hydrogelene til en 6 brønnplate og dypper dem helt i PBS.
MERK: Det anbefales å skrelle av sjablongen med PBS-nedsenking over dekkseddelen for å forhindre rive og stikker av hydrogelen til sjablongen. - Fjern sjablongen forsiktig ved hjelp av autoklet pinsett uten å rive hydrogelen. Resuspend godt med DMEM, returner de mønstrede hydrogelene til inkubatoren, og la dem stå over natten for å teste for eventuell forurensning.
- Hvis mediene forblir klare, er hydrogelene klare til celleplating. Optimaliser celleplatingtettheten og inkubasjonstiden for å tillate vedhesjon av cellene for respektive applikasjoner.
MERK: For enkeltcellemønster av hiPSC-CMs, frø og inkubasjon over natten. Følgende celletall anbefales for seeding: 30.000, 60.000 og 90.000 celler / brønn. Seeding for mange celler fører til mer enn én celle per mønster. En cellesil anbefales å spenne ut ikke-enkeltceller før celleseeding. - Neste dag, observere celle vedlegg og spredning, og endre media for å kvitte seg med frittliggende celler.
9. Rengjøring av de brukte sjablongene
- For å fjerne gjenværende matriseproteiner på de brukte sjablongene, strekner sjablongene i enzymoppløsning (Materialbord) i 10 min ved 37 °C.
MERK: Enzymet bør velges avhengig av matriseproteinene som brukes. For kollagenrik matriseproteinløsning, bruk collagenase. En 10–15 min ultralydbehandling i enzymoppløsning anbefales også. - Aspirer løsningen og fyll på med 10% blekemiddel. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Skyll 3x med PBS.
- Oppbevares i 70 % etanol ved 4 °C til bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikasjon av sjablonger som inneholder en rekke firkanter eller rektangler er demonstrert (figur 4A). Etter denne protokollen fikk vi mønstrede matriseproteinøyer (Figur 4B og figur 5A) og celler (Figur 4C). Suboptimal matriseproteinløsningskonsentrasjon førte til suboptimal mønster (figur 5B). Det er viktig å bruke forsiden av sjablongen. Hvis baksiden av sjablongen brukes, øker størrelsen på matriseproteinøyene på grunn av laserskjæringens retning (figur 6A,B). Selv om bredden på de rektangulære mønstrene ikke endret seg betydelig (figur 6C),økte høyden betydelig ved bruk av baksiden av sjablongen, noe som førte til en reduksjon i det tiltenkte sideforholdet (figur 6D,E). Vi brukte sjablongbasert mønster på silisiumelastomersubstrater (figur 7). De mønstrede kardiomyocytter på silisium elastomer substrater ble visualisert av immunocytokjemi av hjertetroponin T ved lav forstørrelse (Figur 7A) og sarkomiske protein α-actinin ved høy forstørrelse (Figur 7B). Den sjablongbaserte mønsteret kan også brukes på mønster to kardiomyocytter side om side på hydrogeler med forskjellige stivheter. Som en demonstrasjon viser vi kardiomycyttmønsteret på fysiologisk relevant stivhet (figur 8A) og patologisk relevant stivhet (figur 8B).
Figur 1: Skjematisk av tre gullstandard mikromønsterstrategier. (A) Fotolitografi. (B) Mikrokontakt utskrift. (C) Mikrofluidisk mønster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for utforming av sjablonger. (A) Den dataassisterte utformingen av sjablongen. (B) Et representativt fotografi av en laserskåret polyimid sjablong. (C) Et representativt mikroskopisk bilde av en sjablong. Det gule området representerer polyimidssjablongen, mens det lyseblå området representerer en rekke laserkuttede hull. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fotografier av hydrogelfabrikasjonstrinn. (A) Polyakrylamidhydrogelfabrikasjon ved å klem forløperløsningen mellom to dekklepper. (B) UV foto-crosslinking av polyakrylamidhydrogeler under UV-benklampen. UV-lampen er dekket med aluminiumsfolie for brukerbeskyttelse. (C) Den fotokryssede hydrogelen hentes ved å løsne en dekkseddel på den ene siden. (D) Hydrogelkonstruksjonen er i kontakt med sulfo-SANPAH-løsningen for å modifisere hydrogelen for ECM proteininkorporering. Før UV-aktivering er sulfo-SANPAH oransje. (E) Etter UV-aktivering blir sulfo-SANPAH brun, noe som indikerer at den aktiveres og innlemmes på hydrogeloverflaten. (F) Etter dabbing hydrogel med sterile lo-fri kluter for å fjerne overflødig vann, sjablongen er plassert på hydrogel. (G) Proteinoppløsning for kjellermembranmatriseer er pipetted over sjablonghydrogelkonstruksjonene. (H) Hvis sjablong-hydrogelkontakten er vellykket stram, vil kjellerenmembranmatriseproteinløsningen holde seg på toppen og vil ikke sive gjennom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikromønster av matriseproteiner i kjelleren membran og humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) med forskjellige rektangulære former. (A) Mikroskopiske bilder av sjablonger som inneholder laserkuttede rektangler med forskjellige sideforhold (1:1, 4:1, 11:1). (B) Representative bilder av immunflekket matriseproteinøyer på hydrogelsubstrater. (C) Representative bilder av hiPSC-CMs farget for kjerner (cyan) og hjertetroponin T (magenta). Skala bar = 20 μm for panelb og C. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 5: ECM-proteinkonsentrasjonen spiller en viktig rolle i å generere riktige mønstre. (A) Representativt bilde av en optimal konsentrasjon med svært homogen fordeling av kjellermembranmatriseproteiner i enkeltmønstrene. (B) Suboptimalmatriseproteinmønstre på grunn av lav konsentrasjon, noe som forårsaket lekkasje av matriseprotein utenfor mønstrene og lave mengder matriseproteiner i mønstrene som bestemmes av hvetekimagglutininfarging. Skala bar = 20 μm for paneler A og B. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sjablongbivirkning. (A) Proteinmønstre for kjellermembranmatriser da forsiden av sjablongen ble brukt. (B) Proteinmønstre for kjellermembranmatriser da baksiden av sjablongen ble brukt. Kvantifisering av (C) bredde, (D) høyde, (E) sideforhold av rektangulære kjeller membran matrise protein øyer. Grafen er plottet gjennomsnitt ± SEM. Statistikk beregnes av unpaired student T test. = ikke signifikant. = p < 0,0001. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Sjablongbasert mønster på silisiumelastomersubstrat. (A) Et representativt bilde av encellede kardiomyocytter på silisiumelastomersubstrater farget av hjertemarkøren, hjertetroponin T (cTnT), ved lav forstørrelse. Skala bar = 300 μm. (B) En representativ encellede kardiomyocyte farget av sarkomiske protein α-actinin ved høy forstørrelse. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Mikromønster av hiPSC-CMs på polyakrylamidhydrogeler med forskjellige stivheter. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Trinn | Problem observert | Mulig grunn | Løsning |
| 1.1 | Mønsterstørrelsen er større enn forventet | Sjablongen vendes | Ta med en kiral bokstav/figur i sjablongdesignen for å indikere sjablongenes fremre og bakside |
| 8.1 | Hydrogel frakturer ved peeling sjablonger | Hydrogel holder seg til sjablonger | Rengjøring av sjablonger |
| Ikke tørk hydrogelen for mye før du sjablonger | |||
| 8.13 | Cellevedlegg er suboptimalt | Degradert sulfo-SANPAH | Bruk ny sulfo-SANPAH |
| Ineffektiv proteininkorporering | Forbered ny ECM-proteinløsning | ||
| Gammel ECM proteinløsning | |||
| 8.13 | Cellemønster er suboptimal | Kjellermembranmatriseproteinløsning søler over | Utfør immunfarging ved hjelp av fluorofanfor-konjugert antimus IgG antistoff eller hvetekimagglutinin for å undersøke fordelingen av matriseproteinløsning for kjellermembranpå hydrogel |
| 8.13 | Mer enn én celle på ett spor | Ikke i encellede suspensjon | Bruk 40-70 μm cellesil til å få encellede suspensjon |
| Seeding tetthet ikke optimal | Optimaliser seeding tetthet en fra 30 k til 90 k per ml |
Tabell 1: Retningslinjer for feilsøking. Hyppige problemer, mulige årsaker og potensielle løsninger diskuteres.
Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en litografifri sjablongbasert mikromønstermetode som muliggjør effektiv mønster av tilhengerceller. I denne protokollen viser vi mønster av hiPSC-CMs i forskjellige lengde-til-bredde-forhold ved mikromønster i kjellermembranmatriseproteinøyer på polyakrylamidhydrogeler med fysiologisk- eller patologisk relevante vevsstivheter eller silisiumbaserte elastomersubstrater. Denne metoden er relativt enkel og svært tilgjengelig for alle forskere, inkludert de som har liten bakgrunn i fotolittografi og mikrofabrikasjonsteknikker. Den beskrevne metoden omgår betydelige utfordringer forbundet med å generere frimerker ved hjelp av myk litografi og overføre proteiner fra stempelformer til underlag av interesse som er involvert i mikrokontaktutskriftsteknikken. Denne protokollen gir en arbeidsflyt til 1) opprette spesialdesignede sjablonger med et område og form av interesse på en kostnadseffektiv måte; 2) fabrikkere et hydrogelsubstrat med stivhet av interesse; og 3) effektivt konjugere ECM proteiner på hydrogel substratet.
Tradisjonelle myke litografimetoder har blitt brukt til å mønstre ulike former for ECM-proteiner, inkludert trekanter og stjerner på underlag av forskjellige materialer som silisiumbaserte materialer og glasscoverslips13,14. I denne studien viser vi bare rektangulære mønstre gitt fysiologisk- og patologisk relevant form av kardiomyocytter. Vi tror sjablongbasert mønster av andre komplekse former kan fungere så lenge den minste funksjonen i figuren ikke går utover oppløsningen (~ 10 μm). Når det gjelder substratmaterialer, viser vi at sjablongbasert mønster kan brukes på hydrogel (Figur 2, Figur 3, Figur 4, Figur 5, Figur 6 og figur 8) eller silisiumbasert elastomersubstrat (figur 7). Den presenterte metoden virker ikke på substrater med minimal limtil polyimid-materialer som vevkulturplast og glassdekklepper fordi den stramme forseglingen mellom den polyimidbaserte sjablongen og disse substratene ikke oppnås. For å muliggjøre tett forsegling er det nødvendig med ytterligere overflatejustering. Til slutt viser vi at metoden kan brukes til å produsere celleparmønstre på hydrogeler med forskjellige stivheter (dvs. 10 kPa, 60 kPa) (figur 8).
I protokollen er det mest kritiske trinnet optimalisering av ECM proteinkonsentrasjon (protokoll seksjon 6). Målet med dette trinnet er å finne den optimale konsentrasjonen av ECM-protein som er viskøs nok til å hemme proteinoppløsningen for å sive gjennom sjablongens hull, men ikke for konsentrert, for å unngå gelasjon (figur 5). Denne sjablongbaserte metoden begrenser ikke typen ECM-protein. Selv om viskøs ECM proteinløsning er mer sannsynlig å holde seg på toppen av sjablongen, kan et mindre viskøs protein også brukes. Et krav er å sørge for at overflatene på sjablongen og PA hydrogel er tørre nok til å danne et relativt stabilt hydrofobe grensesnitt. I denne demonstrasjonen ble kjellermembranmatriseprotein brukt fordi det er viskøs og egnet for å kule hiPSC-CMs. Andre ECM-proteiner kan imidlertid sannsynligvis brukes (f.eks. fibronectin, gelatin, kollagen, laminin).
I tillegg til optimalisering av ECM proteinløsning for hver gitt applikasjon, er det avgjørende å generere en riktig forsegling mellom sjablongen og hydrogeloverflaten for å oppnå et nøyaktig mønster med ECM-proteinet. Fordi overdreven tørking kan føre til rupturing av hydrogel, er det viktig å ikke overtørke sjablongen. Disse trinnene (dvs. å plassere sjablongen på hydrogelen samt forsiktig pealing den av etterpå) krever litt praksis. Etablering av en optimal håndteringsprosedyre for hver gitt tilstand vil også unngå å ha hydrogelpinnen til sjablongene. Med denne optimaliseringen vil submikronskala laserforbrenninger forårsaket av feil i laserskjæringen ikke vesentlig påvirke teknikken med hensyn til hydrogelskade.
Et annet viktig skritt er å bruke fronten av sjablongen når du plasserer sjablongen på hydrogelsubstratet. Vi fant at bruk av hver side har en effekt på underlaget, antagelig på grunn av laserskjæring (Figur 6). En anbefaling når du mønstrer celler i bestemt størrelse eller form for første gang, er å generere en optimaliseringssjablong. Sjablong-designfunksjoner samsvarer ikke nødvendigvis med de endelige mønstrede cellestørrelsene. Vi anbefaler at du genererer en optimaliseringssjablong som inneholder en gradering av funksjonsstørrelser. Vi utarbeidet en tabell med potensielle problemer og mulige løsninger for å hjelpe til med feilsøking (Tabell 1).
Det er ikke nødvendig å bruke det samme mikrofabrikasjonsselskapet nevnt i dette manuskriptet. Nøklene til nøyaktig generering av sjablongen er strålediameteren til laseren og tykkelsen på sjablongfilmen, i vårt tilfelle polyimid (50 μm). Vi tror en laser lab utstyrt med en passende laser kan generere sjablongen med noen få trinn, optimalisere laser intensitet, justering, og andre variabler. Selv om vi bare har jobbet med ett selskap, er det mange tilgjengelige selskaper som utfører presisjon laserskjæring.
En begrensning av denne metoden er oppløsning. Mens fotolitografi kan oppnå nanoskalaoppløsning, er sjablongbasert mønsteroppløsning begrenset til oppløsningen av laserskjæringen av polyimidsjablonger, som til dags dato vanligvis er på skalaen av noen få mikron (~ 10 μm). Likevel, gitt at den gjennomsnittlige cellestørrelsen er over 10 μm, er oppløsningen vanligvis gjeldende for en enkelt cellemønster.
Oppsummert gir denne metoden allsidige plattformer for å studere celle-ECM-interaksjoner, undersøke cellestrukturfunksjonkorrelasjon og mange andre applikasjoner. Vi tror denne protokollen vil være til nytte for mange biomedisinske forskere og legge til rette for enkeltcellestudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av postdoktorstipend fra Stanford Child Health Research Institute (CHRI) og National Institute of Health (1F32HL142205-01) til S.L, NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Etablert Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann og Schroepfer Foundation, og Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Institutt for medisin til S.M.W , priser fra National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) og Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) til J.C.W, American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) til H.Y, og Hengstberger fellesskap til T.S. Vi takker Dr. Andrew Olsen fra Stanford Neuroscience Microscopy Service på støtte fra konfokal avbildning av mikromønstret hiPSC-CM. Vi takker H.Y. for første sjablongdesign, fabrikasjon, mikromønster av iPSC-CM på polyakrylamidhydrogelbelagt coverslip, og foreløpig konfokal avbildning av sarkofamerstrukturen til encellede mikromønstrede iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
