Summary
ショウジョウバエは、がん治療の潜在的な用途を有する薬剤のスクリーニングに適した広く使用されている実験モデルです。ここでは、ヘテロクロマチン形成を促進する低分子化合物をスクリーニングする方法としてショウジョウバエ可変眼色表現型を用いるものについて述べている。
Abstract
ショウジョウバエは、がん治療に有用な化合物をスクリーニングするために使用できる優れたモデル生物です。ここで説明する方法は、ショウジョウバエを用いてヘテロクロマチン促進化合物を同定するインビボ法で費用対効果が高い方法である。ショウジョウバエのDX1株は、ヘテロクロマチン形成の程度を反映した多様な眼色表現型を有し、ヘテロクロマチン促進薬スクリーン用のツールを提供する。このスクリーニング方法では、目の変化を眼の一部を占める赤色素沈着の表面積に基づいて定量化し、1から5のスケールで採点される。スクリーニング方法は簡単で敏感であり、インビボでの化合物のテストを可能にする。この方法を用いた薬物スクリーニングは、がん治療薬に有益な効果を有するヘテロクロマチン促進薬を同定するための迅速かつ安価な方法を提供する。ヘテロクロマチンの形成を促進する化合物を同定することは、がんの発生のエピジェネティックなメカニズムの発見にもつながる可能性があります。
Introduction
ヘテロクロマチンは、遺伝子発現において中心的な役割を果たす凝縮されたDNAの形態であり、細胞分裂中の染色体分離を調節し、かつゲノム不安定性1から保護する際に行われる。ヘテロクロマチンは遺伝子抑制調節因子であると考えられ、細胞の有糸分裂の間に染色体の完全性を保護するために2,,3.これは、系統コミットメント4、5の間にヒストンH3リジン9(H3K9me)のジメチル化および三メチル化に5関連付けられている。また、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)のクロムドメインタンパク質の動員は、遺伝子発現6のヘテロクロマチンおよびエピジェネティックな抑制と関連しているとも考えられる。これらのタンパク質はヘテロクロマチン形成の必須成分およびマーカーです。
ゲノム不安定性により細胞は発癌を促進する遺伝的変化を得ることができるため、ヘテロクロマチンは癌の発症においてより認識されるようになり、癌治療77,88の標的となり得る。現在, ヘテロクロマチンの形成を支援するために確立されている薬はありません。.ここでは、ヘテロクロマチンの形成を促進する低分子化合物をスクリーニングするための簡単かつ迅速かつ効率的な方法を提示する。スクリーニングは、低分子薬物のライブラリーでショウジョウバエを治療することによって行われる。この方法は、ヘテロクロマチンレベルの影響を受けるDX1ショウジョウバエ株の多様な眼色表現型を利用します。DX1ハエは、ヘテロクロマチ化に依存して多様な発現/抑うつを有する7つのP[lac-w]トランス遺伝子のタンデム配列を含み、したがって、眼色の変化の程度はヘテロクロマチンレベルを反映する。具体的には、ヘテロクロマチンの増加は、可変眼色(白目)の上昇割合によって検出され得る。逆に、ヘテロクロマチンの減少は、P[lac-w]トランスジーン発現(赤目)9、10、11、1210,11,12の上昇割合によって検出されるであろう。9
したがって、このショウジョウバエトランスジーンシステムは、その発現が存在するヘテロクロマチンの量と直接相関しているため、多様な眼色表現型を生成する。ヘテロクロマチンの形成を促進すると疑われる化合物の発見に際して、ウェスタンブロットなどの他の方法を用いてこの疑いを確認してもよい。これらのヘテロクロマチン促進物質は、将来の患者における臨床試験のためにさらに開発され得る。
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Protocol
1. 薬物ライブラリーの準備
- 適切な溶媒を使用して適切な溶媒を使用してスクリーニングされる薬物ライブラリーを特定し、調製する(例えば、DMSOで10mM)。
注:薬物ライブラリーの具体例は、国立がん研究所(NCI)発達治療プログラム(DTP)の腫瘍学セットIIIです。このセットの化合物は、100%DMSOで10mMで20μLで20μLとして26ウェルPPUボトムプレートに2個の96ウェルPPU底板に提供され、-20°Cで保存されます。NCIプレートマップ、および各薬剤の基本的な化学データは、次のウェブサイトで見つけることができます:
NCIプレート番号 4740
NCIプレート番号 4741
2. ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬のスクリーニング
-
ショウジョウバエ繁殖戦略(図1A)
- 1日目:クロス3 w1118/Y;DX1 / CyOオスハエと3つ以上の処女w1118女性は、標準的なショウジョウバエ食品メディア(ブルーミントンのレシピ)の9 mLと25ミリメートルx 95ミリメートル食品バイアルでハエ。各薬剤に3つの複製バイアルと画面用のコントロールを1つ設定します。
注意:DX1ハエは、優しくジェームズ・バーヒラー(ミズーリ大学)9、13,13によって提供されました。 - 2日目と3日目:ハエが室温(22°C)で2日間卵を産むことを許可します。
- 4日目:親ハエを麻酔し、親ハエを「フライ遺体安置所」(70%アルコールを含むボトル)で親ハエを処分するために、CO2ガスの短いバーストを使用してください。
- 1日目:クロス3 w1118/Y;DX1 / CyOオスハエと3つ以上の処女w1118女性は、標準的なショウジョウバエ食品メディア(ブルーミントンのレシピ)の9 mLと25ミリメートルx 95ミリメートル食品バイアルでハエ。各薬剤に3つの複製バイアルと画面用のコントロールを1つ設定します。
- スクリーニングのためにショウジョウバエに薬物を供給する。
- 元のストック(96ウェルPP U底板で100%DMSOで10mMで20μL)から各薬剤化合物を水中33%DMSOで10μMの最終濃度に希釈します。コントロールとして、薬物なしで水中の33%DMSOを使用してください。
注:いくつかの薬物は、水に不溶性であり、DMSOに溶解した。100%DMSOはハエに有毒です。33%は許容可能です。 - 4日目:ピペット60μLの10μMの薬物溶液またはフライフードの上にコントロール。この時点で、親ハエが取り除かれ、ハエの卵が存在し、食べ物の最初のインスターの幼虫が這っていることを確認してください。
- 6日目:同じ10μMの薬物溶液の60μLを食品バイアルに繰り返します。
注:ハエ食品に薬物が添加されたので、上面食品は10μM近くの濃度を含んでおり、底部の食品は完全に浸透することができませんでした。すべてのハエは食べ物の上に卵を産み、上面の食べ物を食べます。
- 元のストック(96ウェルPP U底板で100%DMSOで10mMで20μL)から各薬剤化合物を水中33%DMSOで10μMの最終濃度に希釈します。コントロールとして、薬物なしで水中の33%DMSOを使用してください。
- 目の色の変化を観察し、スコアを付けます。
- F1ハエが出現した2日後(約14日目)、ハエを調べます。CO2の短いバーストを使用してF1ハエを麻酔し、バイアルからフィルターペーパーの下からCO2を通して多孔質解剖パッドにハエを取り除きます。
- 解剖顕微鏡の下でこのパッド上のハエを検査します。フライ全体を調べて、すべてのw1118/ Yを識別します。彼らはCyO支配的な巻き翼表現型を欠いていることでDX1/+ヘテロ接合オス。
- w1118/Y のそれぞれの目の色をスコア。DX1/+ヘテロ接合オスは1から5のスケールでハエを飛ぶ(図1B)。白目の色の割合は、次のように評価されました。
1. <5% 赤散乱目全表面積
2. 6% - 25% 赤い斑点目の全表面積
3. 26% - 50% 赤い斑点目の全表面積
4. 51% - 75% 赤い斑点目の全表面積
5. >75%赤斑目全表面積
注:または、100%メタノールでフライヘッドを均質化し、分光計を使用してOD 450 nmで眼色素沈着を測定します。PEVはDX1男性でより多くの発音されるので、男性のみを選択してください。各バイアルで10人以上の男性を獲得。 - 各バイアルから得点されたすべての男性の平均色指数を計算します。各化合物に対して三つ子を行う(図1C)。
注:目の色は年齢によって変化するので、これは時間に敏感なステップです。目の色は、同じ年齢で計算する必要があります – 2日。通常、10個のハエを各バイアルで採点する必要があります。 - 化合物が実際にヘテロクロマチン形成を促進することを確認するために、ウェスタンブロッティングなどの異なる技術を使用して検証する(図1G)。
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Representative Results
このプロトコルは、ショウジョウバエにおけるヘテロクロマチン形成を促進する化合物のスクリーニングに成功し、これは医薬品開発のための効率的かつ低コストのインビボシステムである(図1)。我々は、ショウジョウバエメラノガスターのDX1株を用いて、97のFDA認可腫瘍学薬で構成される低分子薬物ライブラリー、腫瘍学セットIIIをスクリーニングした(図1B)。重要な薬物の結果は棒グラフで表された(図1C,D)。スクリーニングアッセイによると、ライブラリー内でE7としてコード化されたメトトレキサート(4-アミノプテロイルグルタミン酸)はDX1株で最も変動を引き起こし、メトトレキセートが将来の癌標的療法にとって最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性を示唆している(図1E,F)。ヘテロクロマチン形成を促進する化合物を実際に試験していることをさらに確認するために、ウェスタンブロットデータは、ヘテロクロマチン形成関連タンパク質H3K9me3がアップレギュレートされていることを示している(図1G)、さらにメトトレキセートが最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性があることを確認する。
図1:ショウジョウバエにおける薬物スクリーニングの図。(A)ショウジョウバエスクリーン方法論。ショウジョウバエモデルを用いたヘテロクロマチン促進化合物スクリーニングのスキームの概要を示す。3 w1118/Y;DX1 /CyO男性と3バージンw1118は室温で交差しています。その後、4日目に成体ハエを取り除き、4日目と6日目にそれぞれフライフードの上部に33%DMSO溶液に溶解した10μMの薬物60μLを加えます。33%DMSO溶液をコントロールとして使用した。F1の男性の発色の目の色(白と赤)の比率が観察された。(B)眼色表現型分析とスコア。多様な表現型を示す眼色の代表的な画像。可変性の目の色の割合は次のように評価されました: 1, 1-5% 全表面積の赤い斑点;2、6-25%の全表面積の赤い斑点。3、26-50%の全表面積の赤い斑点。4、51-75%の全表面積の赤い斑点。5、>全表面積の75%の赤い斑点。(スケールバー= 200 μm)(C)各薬剤は、3つの独立実験±s.d.からの平均値としてアッセイした(標準偏差)。赤いバーにはコントロールが表示されます。(D)薬物E7及び制御で行われたスケールの結果。E7と対照群の間の違いは、P値が学生のt-Testによって<0.05(*)であった場合にE有意であると考えられた。(F)E7および対照治療群におけるフライアイの代表的な画像。F(スケールバー、200 μm)(G)ウェスタンブロットは、示された濃度でメトトレキサート処理を行わずに3番目のインスター幼虫全タンパク質を用いてH3K9me3、H3、またはα-チューブリンに特異的な抗体を用いて行った。3933この図はロヨラら14から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヘテロクロマチンは、遺伝子発現を調節する上で中心的な役割を果たすDNAの凝縮形態である。癌でますます認知されつつあり、がん,治療15、16、17、18,16,17の潜在的な標的として役立つ可能性があります。18低分子化合物は、人間の体内での製造、保存、代謝の利点により、医薬品開発に一般的に使用されています。ヘテロクロマチン促進小分子化合物を同定するために、効率的な方法を設計し、ヘテロクロマチン依存的にハエの目の色に影響を与えることを証明されているDX1ショウジョウバエ株を使用して提示した(図1)。
当社のスクリーニングプロトコルは、医薬品開発のためのシンプルで安価で簡単にインビボシステムです。しかし、スクリーニング戦略の1つの制限は、有効な薬物濃度を決定することである。メスのフルーツフライは、半固体フライフードの表面に彼女の卵を産みます。薬物治療のために、我々は、所定の濃度を含むはずの食品の表面に薬物溶液をピペトする。しかし、異なる薬物は食物の底に拡散する上で異なる効率を有することができるので、薬物濃度は、表面の下または食品の底に向かって一貫しているとは保証されない。10μM濃度では、私たちがスクリーニングした図書館の薬物で治療された幼虫では致死性はほとんど認められなかった。しかし、薬物のほとんどは100μM濃度で幼虫に重度の致死を引き起こし、薬物濃度もスクリーンにとって重要な要因と考えることができることを示唆している。
ここで、ここで使用されるようなタンデム反復は、心枢近ヘテロクロマチンに見られるものとは若干異なるメカニズムによってPEVを引き起こす可能性があることに気づく。胚および幼虫の発達中にPEVに影響を与える薬物(ここで説明するテスト)は、体細胞におけるヘテロクロマチンの維持に影響を与える薬物のみを同定し、ヘテロクロマチンの初期形成に影響を与える薬物を同定しない。これは、ブラストデアルム(核サイクル10-14)中に発生する可能性が最も高い。それにもかかわらず、これは迅速な開始画面のための有用なアッセイである可能性があります。
このプロトコルは、このトランスジーンクラスター(DX1)のヘテロクロマチン形成に対する感受性のために信頼性が高く、費用対効果が高く、眼に存在する赤色素沈着の量によって反映される。さらに、ショウジョウバエの寿命が短いと、ゼブラフィッシュやヒト細胞などの他のモデル生物よりもこのプロトコルの効率が高くなります。ゼブラフィッシュにはヘテロクロマチンレベルと同じくらい敏感なレポーター遺伝子系が存在する可能性がありますが、その寿命はショウジョウバエよりもはるかに長く、結果を得るのに時間がかかります。さらに,このプロトコルは特にヘテロクロマチンレベルを決定するエピジェネティック調節からのフェノティピック変化を用いることを中心にして、ヒト細胞を使用することは不可能であろう。したがって、このプロトコルは、どの小さな薬物分子が癌治療における腫瘍遺伝子を抑制する候補として役立つ可能性があるかを決定するための効率的なin vivo方法を提供する。ショウジョウバエの薬物スクリーニング方法は、いくつかのインビトロスクリーニング方法と比較して化合物を同定するための遅いアプローチですが、比較的敏感であり、生体内で化合物をテストすることができます。比較的安価で、行いやすく、高スループットである細胞スクリーニング法と組み合わせて、ショウジョウバエスクリーニング法を補足方法としてヒットを確認することもできる。
要約すると、がん治療のためのヘテロクロマチンをさらに研究し標的とする化合物を同定することに関心を持ち、これが起こっているメカニズムはまだ完全には理解されていないが、単純な画面を同定するために実施した。ヘテロクロマチン促進薬.薬物がヘテロクロマチン形成を促進することができる低濃度を発見することは、現代の化学療法治療と比較してより少ない副作用をもたらす可能性のあるよりユニークな治療法を提供することができます.
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
我々は、J.バーヒラー、E.バッハ、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターに様々なショウジョウバエ株に感謝します。国立がん研究所(NCI)腫瘍学のための開発治療プログラムは、低分子薬物ライブラリーを設定します。エイミー・チャン、テシク・ユー、ジェシカ・シン・バンガ、レイチェル・メザ、アレックス・チャベスを含むUCSDの学部生。この出版物で報告された研究は、米国胸部学会からJ.L.への研究助成金とNIHからの資金によって支えられた:R01GM131044からW.X.Lへの資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
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