Summary
Drosophila är en allmänt använd experimentell modell som lämpar sig för screening av läkemedel med potentiella tillämpningar för cancerbehandling. Här beskriver vi användningen av Drosophila brokiga ögonfärg fenotyper som en metod för screening små molekyler föreningar som främjar heterokromatin bildning.
Abstract
Drosophila är en utmärkt modell organism som kan användas för att skärmen föreningar som kan vara användbara för cancerbehandling. Den metod som beskrivs här är en kostnadseffektiv in vivo-metod för att identifiera heterokromatin-främja föreningar med hjälp av Drosophila. Den Drosophila's DX1 stam, med en brokig ögonfärg fenotyp som återspeglar omfattningen av heterokromatin bildning, vilket ger ett verktyg för en heterochromatin-främja drogskärm. I denna screeningmetod kvantifieras ögonvariationen baserat på ytan av röda pigmentering som upptar delar av ögat och poängsätts på en skala från 1 till 5. Screeningmetoden är enkel och känslig och möjliggör testning av föreningar in vivo. Läkemedelsscreening med denna metod ger ett snabbt och billigt sätt att identifiera heterokromatin-främjande läkemedel som kan ha positiva effekter i cancer therapeutics. Identifiera föreningar som främjar bildandet av heterokromatin kan också leda till upptäckten av epigenetiska mekanismer för cancerutveckling.
Introduction
Heterokromatin är en kondenserad form av DNA som spelar en central roll i genuttryck, i regleringen av kromosomssegregering under celldelning, och för att skydda mot genominstabilitet1. Heterokromatin har ansetts vara en genförtryck regulator och för att skydda kromosom integritet under cell mitosis2,3. Det är förknippat med di- och tri-metylering av histon H3 lysin 9 (H3K9me) under härstamning åtagande4,5. Dessutom anses rekrytering av heterokromatinprotein 1 (HP1) kromodomänproteiner också vara förknippade med heterokromatin och epigenetiskt förtryck av genuttryck6. Dessa proteiner är viktiga komponenter och markörer för heterokromatinbildning.
Eftersom genomisk instabilitet gör det möjligt för celler att förvärva genetiska förändringar som främjar cancerframkallande ämnen, heterokromatin blir mer erkänd i cancerutveckling och kan vara inriktade på cancerbehandling7,8. För närvarande finns det inga läkemedel som är väl etablerade för att hjälpa heterokromatinbildning. Här presenterar vi en enkel och snabb men effektiv metod för screening av små molekylföreningar som främjar heterokromatinbildning. Screeningen görs genom att behandla Drosophila med ett bibliotek av små molekyler droger. Denna metod drar nytta av en brokig ögonfärg fenotyp i DX1Drosophila stam som påverkas av heterochromatin nivåer. DX1 flugor innehåller en tandem array av sju P [lac-w] transgenes, som har det brokiga uttrycket/depressionen beroende på heterochromatinisering, därför återspeglar variationen av variegation i ögonfärgen heterokromatinnivån. Specifikt kan ökande heterokromatin detekteras av den ökande andelen brokiga ögonfärg (vitt öga). Tvärtom skulle minskande heterokromatin upptäckas av den ökande andelen av P [lac-w] transgenuttryck (röda ögon)9,10,11,12.
Därför drar vi nytta av detta Drosophila transgensystem som producerar en brokig ögonfärg fenotyp eftersom dess uttryck är direkt korrelerade till mängden heterokromatin närvarande. Vid upptäckt av föreningar som misstänks främja heterokromatin bildning, kan vi bekräfta denna misstanke med andra metoder såsom västra blot. Dessa heterokromatin-främja ämnen kan vidareutvecklas för kliniska prövningar på patienter i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av läkemedelsbibliotek
- Identifiera och förbereda ett läkemedelsbibliotek som ska screenas med hjälp av lämpligt lösningsmedel vid önskad koncentration (t.ex. 10 mM i DMSO).
OBS: Ett specifikt exempel för ett läkemedelsbibliotek är Onkologi Set III från National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Föreningar i denna uppsättning tillhandahålls som 20 μL vid 10 mM i 100% DMSO i två 96-brunnPP U-botten plattor och lagras vid -20 °C. NCI Plate kartor, och de grundläggande kemiska data för varje läkemedel kunde hittas på följande webbplatser:
NCI-skyltnummer 4740
NCI-skyltnummer 4741
2. Skärm för heterochromatin-främjande droger med Drosophila
-
Drosophila Avelsstrategi(figur 1A)
- Dag 1: Korsa tre w1118/Y; DX1/CyO-flugor och tre eller fler jungfruflugor med1118 kvinnliga flugor i en 25 mm x 95 mm matinjektionsflaskor med 9 ml standardmatmedia i Drosophila (Bloomington recept). Ställ in tre replikatflaskor för varje läkemedel och en kontroll för skärmen.
OBS: DX1 flugor var vänligt tillhandahålls av James Birchler (University of Missouri)9,13. - Dag 2 och dag 3: Låt flugorna lägga ägg i 2 dagar i rumstemperatur (22 °C).
- Dag 4: Använd en kort explosion av CO2-gas för att söva föräldraflugorna och göra sig av med förälderns flugor i ett "flugbårhus" (en flaska som innehåller 70% alkohol).
- Dag 1: Korsa tre w1118/Y; DX1/CyO-flugor och tre eller fler jungfruflugor med1118 kvinnliga flugor i en 25 mm x 95 mm matinjektionsflaskor med 9 ml standardmatmedia i Drosophila (Bloomington recept). Ställ in tre replikatflaskor för varje läkemedel och en kontroll för skärmen.
- Mata läkemedel till Drosophila för screening.
- Späd varje läkemedelsförening från originalbeståndet (20 μL vid 10 mM i 100% DMSO i 96-brunnPP U-bottenplattor) till en 10 μM slutlig koncentration med 33% DMSO i vatten. Använd 33% DMSO i vatten utan något läkemedel som kontroll.
OBS: Vissa läkemedel är dåligt lösliga i vatten och upplöstes i DMSO. 100% DMSO är giftigt för flugor. 33% är acceptabelt. - Dag 4: Pipett 60 μL av en 10 μM läkemedelslösning eller kontroll på toppen av flugmat. Vid denna punkt, se till att föräldern flyger har tagits bort och det finns flyga ägg och krypa första-instar larver på maten.
- Dag 6: Upprepa pipetting 60 μL av samma 10 μM läkemedelslösning till injektionsflaskan.
OBS: Eftersom läkemedel tillsattes på flugmaten innehåller den övre ytmaten nästan 10 μM-koncentration och bottenmaten kunde inte penetreras helt. Alla flugor lägger ägg på mattoppen och äter den övre ytan mat.
- Späd varje läkemedelsförening från originalbeståndet (20 μL vid 10 mM i 100% DMSO i 96-brunnPP U-bottenplattor) till en 10 μM slutlig koncentration med 33% DMSO i vatten. Använd 33% DMSO i vatten utan något läkemedel som kontroll.
- Observera och poäng ögonfärgförändringar.
- Två dagar efter F1 flugor na dyker upp (ungefär på dag 14), undersöka flugorna. Använd en kort explosion av CO2 för att söva F1-flugorna och ta bort flugorna från flaskan på en porös dissekeringsplatta med CO2 som smuttar igenom underifrån ett filterpapper.
- Inspektera flugorna på denna pad under ett dissekeringsmikroskop. Undersök hela flugan och identifiera alla w1118/Y; DX1/+ heterozygous hanar vid deras saknar CyOen som är dominant lockig påskyndar phenotype.
- Betyg ögonfärgen på var och en av de w1118/Y; DX1/+ heterozygous hane flyger på en skala från 1 till 5(bild 1B). Andelen vita ögonfärg bedömdes på följande sätt:
1. <5% röd spridd ögon total yta
2. 6% - 25% röda fläckar ögat sen yta
3. 26% - 50% röda fläckar ögat sen yta
4. 51% - 75% röda fläckar ögat sen yta
5. >75% röda fläckar ögat sen yta
OBS: Alternativt homogenisera flughuvuden i 100% metanol och använd en spektrometer för att mäta ögonpigmentering vid OD 450 nm. Välj bara män eftersom PEV är mer pronouced i DX1 män. Betyg mer än 10 män i varje injektionsflaskan. - Beräkna det genomsnittliga färgindexet för alla hanar från varje injektionsflaskan. Utför triplikator för varje förening(figur 1C).
EFTERSOM ögonfärgen varierar med åldern är detta ett tidskänsligt steg. Ögonfärgen ska beräknas vid samma ålder – 2 dagar gammal. Vanligtvis >10 flugor bör poängsättas i varje injektionsflaskan. - För att bekräfta att föreningarna verkligen främjar heterokromatinbildning, använd en annan teknik såsom västra blotting för att validera (figur 1G).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll användes framgångsrikt för att screena föreningar som främjar heterokromatinbildning i Drosophila, som är ett effektivt och billigt in vivo-system för läkemedelsutveckling (figur 1). Vi screenade en liten molekyl läkemedelsbibliotek, Onkologi Set III, som består av 97 FDA auktoriserade onkologi läkemedel, med hjälp av DX1 stam av Drosophila melanogaster (Figur 1B). Resultaten för ett betydande läkemedel var representerade i en stapel graf(figur 1C,D). Enligt screeninganalysen orsakade metotrexat (4-aminopteroylglutamsyra), som kodas som E7 i biblioteket, den mest variegation i DX1 stammen, vilket tyder på att metotrexat kan vara den mest lovande heterochromatin-främja läkemedel för framtida cancer riktad terapi (Figur 1E,F). För att ytterligare bekräfta att detta verkligen testar föreningar som främjar heterokromatinbildning, västra blot data visar att heterochromatin bildning associerade protein H3K9me3 är upregulated(figur 1G),ytterligare kontrollera att metotrexat kan vara den mest lovande heterochromatin-främja läkemedel.
Figur 1: En illustration av drogscreeningen i Drosophila. (A) Drosophila-skärmmetodik. En översikt över systemet för heterochromatin-främja föreningar screening med hjälp av Drosophila modellen. Tre w1118/Y; DX1/CyO-hanar och tre jungfruliga w1118 korsas i rumstemperatur. Ta sedan bort de vuxna flugorna dag fyra och tillsätt 60 μL av 10 μM-läkemedlet upplöst i 33% DMSO-lösning till toppen av flugmaten vid dag fyra respektive dag sex. 33% DMSO-lösning användes som en kontroll. Ögonfärgen (vit till röd) förhållandet mellan F1 manliga generationen observerades. (B) Ögonfärg fenotyp analys och poäng. Representativa bilder av ögonfärg som visar brokig fenotyp. Andelen variegation ögonfärg bedömdes som följande: 1, 1-5% röda fläckar i total yta; 2, 6-25% röda fläckar i total yta; 3, 26-50% röda fläckar i total yta; 4, 51-75% röda fläckar i total yta; och 5, >75% röda fläckar i total yta. (Skalstång = 200 μm) (C)Varje läkemedel har analyserats som medelvärden från tre oberoende experiment ± s.d. (standardavvikelse). Den röda stapeln visar kontrollen. (D)Resultat av skalan som utförs i läkemedel E7 och kontroll. Skillnader mellan E7 och kontrollgrupper ansågs vara betydande om P-värden var <0,05 (*) av Students t-Test. (E) Den molekylära strukturen hos en kemisk förening som kallas E7 som används i exemplet läkemedelsbibliotek. (F)Representativa bilder av flugögonen i E7 och kontrollbehandlingsgruppen. (Skalstång, 200 μm) (G)Den västra blot utfördes med antikroppar som är specifika för H3K9me3,H3eller α-Tubulin med hjälp av det totala proteinet med 3rd instar utan eller med metotrexatbehandling vid de angivna koncentrationerna. Denna siffra har ändrats från Loyola et al14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterokromatin är en kondenserad form av DNA som spelar en central roll i regleringen av genuttryck. Det blir allt mer erkänt i cancer och kan fungera som ett potentiellt mål för cancerbehandling15,16,17,18. Små molekyler föreningar används ofta i läkemedelsutveckling på grund av fördelar inom tillverkning, konservering, och metabolism i mänskliga kroppar. För att identifiera heterokromatinfrämjande småmolekylföreningar utformades och presenterades en effektiv metod med hjälp av DX1Drosophila-stammen, som har visat sig påverka flugornas ögonfärg på ett heterokromatinberoende sätt (figur 1).
Vårt screeningprotokoll är ett enkelt, billigt och lättatt följa in vivo-system för läkemedelsutveckling. En begränsning av screeningstrategin är dock att fastställa en effektiv läkemedelskoncentration. Den kvinnliga fruktflugan lägger sina ägg på ytan av den halvfasta flugmaten. För läkemedelsbehandling, vi pipet läkemedelslösningen till ytan av maten, som är tänkt att innehålla en förutbestämd koncentration. Men eftersom olika läkemedel kan ha olika effektivitetsvinster i spridning till botten av maten, är läkemedelskoncentrationen inte garanterat konsekvent under ytan eller mot botten av maten. Vid 10 μM koncentration observerades dödlighet sällan hos larver som behandlades med någon av läkemedlen i biblioteket vi screenade. De flesta av läkemedlen orsakade dock svår dödlighet i larverna vid 100 μM-koncentration, vilket tyder på att läkemedelskoncentration också kan betraktas som en viktig faktor för skärmen.
Här märker vi att tandem upprepar som de som används här kan utlösa PEV av en mekanism som skiljer sig i vissa avseenden från den som ses i pericentric heterokromatin. Ett läkemedel som påverkar PEV under utvecklingen av embryonala och larv (det test som beskrivs här) identifierar endast läkemedel som påverkar upprätthållandet av heterokromatin i somatiska celler och inte kommer att identifiera läkemedel som påverkar den första bildandet av heterokromatin, som sannolikt inträffar under blastoderm (kärnvapencykler 10-14). Ändå kan detta vara en användbar analys för en snabb startskärm.
Detta protokoll är tillförlitligt och kostnadseffektivt på grund av känsligheten hos detta transgenkluster(DX1)till heterochromatinbildning, reflekterad av mängden röd pigmentering som finns i ögat. Dessutom gör den korta livslängden för Drosophila detta protokoll effektivare än andra modellorganismer som zebrafisk eller mänskliga celler. Även om det sannolikt kan finnas en reporter gensystem som finns i zebrafisk som är lika känslig för heterochromatin nivåer, är deras livslängd mycket längre än Drosophila och skulle ta längre tid att få resultat. Dessutom skulle det inte vara möjligt att använda mänskliga celler, eftersom detta protokoll specifikt fokuserar på att använda fenotypiska förändringar från epigenetisk reglering för att fastställa heterokromatinnivåer. Således ger detta protokoll en effektiv in vivo-metod för att avgöra vilken liten läkemedelsmolekyl som potentiellt skulle kunna fungera som en kandidat för att undertrycka onkogener i cancerterapi. Medan Drosophila drog screening metod är en långsam metod för att identifiera föreningar jämfört med vissa in vitro screening metoder, Det är relativt känslig och tillåter oss att testa föreningar in vivo. I kombination med cellscreeningmetoden, som är relativt billig, lätt att utföra och är hög genomströmning, kan Drosophila-screeningmetoden också användas för att bekräfta träffar som en kompletterande metod.
Sammanfattningsvis, med ett intresse av att identifiera föreningar för ytterligare forskning och inriktning heterochromatin för cancerbehandling, även om den mekanism där detta sker ännu inte är helt klarlagt, utfördes en enkel skärm för att identifiera heterokromatorinfrämjande läkemedel. Upptäcka en låg koncentration där ett läkemedel kan främja heterokromatin bildning kan erbjuda mer unika behandlingar som kan resultera i färre biverkningar jämfört med moderna kemoterapi behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar J. Birchler, E. Bach och Bloomington Drosophila Stock Center för olika Drosophila stammar; National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program för onkologi Set små molekyl läkemedelsbibliotek; UCSD grundutbildning studenter inklusive Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, och Alex Chavez. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av ett forskningsanslag från American Thoracic Society till J.L. och finansiering från NIH: R01GM131044 till W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
