Summary
Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.
Abstract
Amyloidfibrillen sind mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Huntington, Parkinson oder Alzheimer verbunden. Diese Amyloidfibrillen können endogene metastabile Proteine sowie Komponenten des Proteostase-Netzwerks (PN) sequestrieren und dadurch die Proteinfehlfaltung in der Zelle verschlimmern. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Werkzeugen zur Verfügung, um den Aggregationsprozess von Amyloidproteinen innerhalb eines Tieres zu bewerten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (FLIM), das die Überwachung und Quantifizierung der Amyloidfibrille in bestimmten Zellen, wie Neuronen, auf nichtinvasive Weise und mit dem Fortschreiten des Alterns und bei PN. FLIM ist unabhängig von den Expressionsniveaus des Fluorophors und ermöglicht eine Analyse des Aggregationsprozesses ohne weitere Färbung oder Bleichen. Fluorophore werden abgeschreckt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe von Amyloidstrukturen befinden, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer führt. Die Abschreckung korreliert direkt mit der Aggregation des Amyloidproteins. FLIM ist eine vielseitige Technik, die angewendet werden kann, um den Fibrillenprozess verschiedener Amyloidproteine, Umweltreize oder genetische Hintergründe in vivo auf nicht-invasive Weise zu vergleichen.
Introduction
Proteinaggregation tritt sowohl im Alter als auch bei Krankheiten auf. Die Wege, die zur Bildung und Ablagerung von großen Amyloiden oder amorphen Einschlüssen führen, sind schwer zu folgen und ihre Kinetik ist ähnlich schwierig zu entwirren. Proteine können sich aufgrund intrinsischer Mutationen in ihren Codierungssequenzen falsch falten, wie im Falle genetischer Krankheiten. Proteine verrenken sich auch, weil das Proteostase-Netzwerk (PN), das sie löslich und richtig gefaltet hält, beeinträchtigt wird, wie es während des Alterns geschieht. Das PN umfasst molekulare Chaperones und Abbaumaschinen und ist verantwortlich für die Biogenese, Faltung, den Handel und den Abbau von Proteinen1.
C. elegans hat sich als Modell zur Untersuchung von Alterung und Krankheit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, isogenen Natur und Leichtigkeit der genetischen Manipulation herauskristallisiert. Mehrere transgene C. elegans-Stämme, die menschliche krankheitserregende Proteine in empfindlichen Geweben ausdrücken, wurden geschaffen. Wichtig ist, dass viele der Stämme, die aggregationsanfällige Proteine enthalten, das Kennzeichen von Amyloid-Störungen, der Bildung großer Einschlüsse, rekapitulieren. Dank des transparenten Körpers von C. elegans können diese Aggregate in vivo, nicht-invasiv und zerstörungsfrei visualisiert werden2. Die Erzeugung von Proteinen von Interesse (POI) in der Fusion mit einem Fluorophor ermöglicht es, seine Standorte, den Menschenhandel, das Interaktionsnetzwerk und das allgemeine Schicksal zu untersuchen.
Wir präsentieren ein Protokoll zur Überwachung der Aggregation von krankheitserregenden Proteinen im lebenden und alternden C. elegans mittels Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM). FLIM ist eine leistungsstarke Technik, die auf der Lebensdauer eines Fluorophors und nicht auf seinen Emissionsspektren basiert. Die Lebensdauer (tau, b) ist definiert als die durchschnittliche Zeit, die ein Photon benötigt, um von seinem angeregten Zustand zurück in seinen Bodenzustand zu zerfallen. Die Lebensdauer eines bestimmten Moleküls wird mit der Zeit-Domänen-Technik der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) berechnet. In TCSPC-FLIM wird die fluoreszierende Zerfallsfunktion durch Das Aufregen des Fluorophors mit kurzen, hochfrequenten Laserpulsen und die Messung der Ankunftszeiten des emittierten Photons an einen Detektor in Bezug auf die Impulse erreicht. Beim Scannen eines Samples wird für jedes Pixel ein dreidimensionales Datenarray erstellt: Das Array x,y enthält Informationen über die Verteilung der Photonen in ihren xy-Raumkoordinaten und ihre zeitliche Zerfallskurve. Eine bestimmte Probe wird daher zu einer Karte der Lebensdauer, die Informationen über die Struktur, Bindung und Umgebung des Proteins3,4enthält. Jedes fluoreszierende Protein besitzt eine intrinsische und genau definierte Lebensdauer, in der Regel von wenigen Nanosekunden (ns), abhängig von seinen physiochemischen Eigenschaften. Wichtig ist, dass die Lebensdauer eines Fluorophors unabhängig von seiner Konzentration, fluoreszierenden Intensität und der bildgebenden Methodik ist. Innerhalb eines biologischen Systems kann es jedoch durch Umweltfaktoren wie pH, Temperatur, Ionenkonzentrationen, Sauerstoffsättigung und seine Interaktionspartner beeinflusst werden. Lebenszeiten reagieren auch empfindlich auf interne strukturelle Veränderungen und Orientierung. Die Verschmelzung eines Fluorophors mit einem POI führt zu einer Änderung seiner Lebensdauer und folglich zu Informationen über das Verhalten des geschmolzenen Proteins. Wenn ein Fluorophor in einer eng gebundenen Umgebung umgeben oder gekapselt ist, wie z. B. die antiparallelen Beta-Platten einer Amyloidstruktur, verliert es Energie nicht-strahlungend, ein Prozess, der als Abschrecken5bekannt ist. Das Abschrecken des Fluorophors führt zu einer Verkürzung seiner scheinbaren Lebensdauer. Wenn es löslich ist, bleibt die Lebensdauer eines Proteins näher an seinem ursprünglichen, höheren Wert. Im Gegensatz dazu, wenn ein Protein beginnt zu aggregieren, wird seine Lebensdauer unweigerlich auf einen niedrigeren Wert6,7verschieben. Daher wird es möglich, die Aggregationsneigung jedes Amyloid-bildenden Proteins in verschiedenen Altersstufen in lebenden C. eleganszu überwachen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Aggregation eines Fusionsproteins, das verschiedene Polyglutamin (CAG, Q) Dehnungen (Q40, Q44 und Q85) umfasst. Wir veranschaulichen, wie die Technik gleichermaßen auf verschiedene Fluorophore angewendet werden kann, wie Z. B. Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) und monomeres rotes Fluoreszenzprotein (mRFP); und in allen Geweben von C. elegans, einschließlich der Neuronen, Muskeln, und der Darm. Darüber hinaus ist FLIM im Zusammenhang mit der Proteostase ein sehr nützliches Werkzeug, um Veränderungen bei der Erschöpfung molekularer Chaperonen zu beobachten. Das Abklopfen eines der wichtigsten molekularen Chaperone, das Hitzeschockprotein 1 (hsp-1), über RNA-Interferenz erzeugt eine vorzeitige Fehlfaltung von Proteinen. Die Erhöhung der Aggregationslast als Folge von Alterung, Krankheit oder mangelhaften Chaperonen wird dann als Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer gemessen.
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Protocol
1. Synchronisation von C. elegans
- Synchronisieren Sie C. elegans entweder über alkalische Hypochloritlösung oder über einfache Eiablage für 4 h bei 20 °C8.
- Nematoden bei 20 °C anbauen und pflegen auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit OP50 E. coli nach Standardverfahrengesätsind 9 . Altern Sie die Nematoden bis zum gewünschten Entwicklungsstadium oder Tag.
HINWEIS: In diesem Protokoll werden junge Erwachsene am 4. Tag und alte Nematoden am 8. Tag des Lebens abgebildet.
2. RNAi-vermittelter Knockdown von Chaperon-Maschinen über Fütterung
HINWEIS: Führen Sie den Knockdown des Hitzeschockproteins 1 (hsp-1) Chaperon durch Zuführen des entsprechenden RNAi-Vektors an die Nematoden10durch. Das hsp-1 RNAi Plasmid wurde aus der Ahringer Bibliothek (Klon-ID: F26D10.3) bezogen.
- Wachsen Sie das HT115 (DE3) E. coli, das das hsp-1 RNAi-Plasmid für 6 h exzessiumdrückt, bis über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium, das 50 g/ml Ampicillin enthält.
- Bereiten Sie frische NGM-Agarplatten vor, die Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) und Ampicillin (25 g/ml) und Samen mit den hsp-1 RNAi-Bakterien enthalten. Lassen Sie die Teller trocknen und bei Raumtemperatur für 1-3 Tage induzieren.
- Setzen Sie synchronisierte Eier auf eine siRNA-Platte und lassen Sie es schlüpfen, oder legen Sie gravid Nematoden und lassen Sie Eier für 4 h bei 20 °C vor dem Entfernen legen. Wachsen Sie die Nematoden bis zum gewünschten Alter oder Stadium.
HINWEIS: Die zweite Generation von Nematoden könnte einen stärkeren Phänotyp des Knockdowns darstellen. Das siRNA-Protokoll und die hier beschriebenen Bedingungen sind allgemein und an hsp1angepasst. RNA-Interferenzen über siRNA eines bestimmten Klons/Gens müssen vom Endbenutzer aufgebaut und optimiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle siRNA die gleiche Effizienz haben, und es wird daher empfohlen, die Wirksamkeit des Knockdowns durch Quantifizierung entweder durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) oder Western Blot zu testen.
3. Herstellung von Mikroskopie-Dias
- Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agarose in ddH2O mit einer Konzentration von 3% (w/v) schmelzen und leicht abkühlen lassen.
- Schneiden Sie die Spitze einer 1 ml Pipettenspitze und nehmen Sie etwa 200 l geschmolzene Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite legen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Trocknen lassen und die obere Glasrutsche vorsichtig entfernen. Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden.
HINWEIS: Jede Folie wird verwendet, um zwischen 5-10 Nematoden abzubilden. Dias können vorbereitet und für einige Stunden in einer humifizierten Box gelagert werden, um das Austrocknen der Agrose zu verhindern.
4. Montage von Nematoden auf Mikroskopie-Dias
HINWEIS: FLIM erfordert, dass die Nematoden immobilisiert werden. Führen Sie diesen Schritt aus, sobald die Bildgebung (z. B. Mikroskope, Laser, Detektoren) einsatzbereit ist.
- Mit einem Platindrahtpicker nematodes des gewünschten Alters auf eine frische, ungesaittete Platte legen und kriechen lassen, um die überschüssigen OP50-Bakterien aus ihrem Körper zu entfernen.
- Bereiten Sie die Anästhesie (Natriumazid oder Levamisol) vor, um das Nematode zu immobilisieren. 500 mM NaN3 bei 4 °C im Dunkeln halten und in frischem ddH2O auf eine Endkonzentration von 250 mM verdünnen. Bei Verwendung von Levamisol eine 20 mM Lagermenge auf 2 mM Arbeitslösung in ddH2O verdünnen.
VORSICHT: Natriumazid (NaN3) ist hochgiftig. Verwenden Sie Handschuhe und Schutzbrillen und arbeiten Sie unter einer belüfteten Kapuze. - Unter einem Stereomikroskop einen 10 L Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad legen und 5-10 Nematoden sanft hineintragen. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen. Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen.
- Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie Messungen innerhalb von 1 h nach der Montage vor.
HINWEIS: Beide Anästhetika werden schließlich C. eleganstöten. Die Nematoden müssen während der Bildgebung völlig unbeweglich sein, da die Karte der Lebensdauer von jedem Pixel aufgezeichnet wird. Jede Bewegung der xy-Parameter verhindert das Ablesen der Lebensdauer im gleichen angeregten Pixel.
5. Erfassung von FLIM-Daten
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Lebensdauer des Fluorophors über die Time-Domain-TCSPC-Methode erfasst. FLIM erfordert, dass ein Lichtimpuls vom Laser mit einer eingestellten und konstanten Wiederholungsrate erzeugt wird. Die Wiederholungsrate variiert je nach Lasertyp und muss dem Benutzer bekannt sein. Lebensdauermessungen werden durch Detektoren und elektronische Geräte erreicht, die neben einem herkömmlichen Mikroskop installiert werden. In diesem Protokoll werden Messungen an drei verschiedenen laserscannenden Konfokalmikroskopen mit Detektoren und Software durchgeführt, die von zwei verschiedenen Unternehmen (Tabelle der Materialien) zur Erfassung von mRFP-, CFP- und YFP-Lebensdauern bereitgestellt werden. Überprüfen Sie, ob die richtigen Emissions-/Erregungsfilter vorhanden sind, und minimieren Sie vor dem Start Hintergrund- oder Monitor-Hintergrundbeleuchtung. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, stellen Sie die Photostabilität des gewählten Fluorophors fest. Wenn das Fluorophor innerhalb kurzer Zeit innerhalb des Nematodengewebes bleicht, ist es nicht für FLIM-Messungen in C. elegansgeeignet.
- Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Die FLIM-Software ermöglicht auch die Steuerung des konfokalen Mikroskops. Suchen Sie die Registerkarte/Taste, damit die Ausgänge des Detektors aktiviert werden können, und drücken Sie Outputs aktivieren.
- Erwerben Sie die Instrument Response Function (IRF), die die Timing-Präzision des Instrumental-Setups beschreibt.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte vorzugsweise vor der Montage der Nematoden durchgeführt werden.- Entfernen Sie, falls verfügbar, die Anregungs-/Emissionsfilter.
- Legen Sie einen leeren Deckelüberstrich über das Objektiv und finden Sie seine Oberfläche. Zeichnen Sie das Streusignal auf, das vom Deckschein für mindestens 30 s erhalten wurde.
HINWEIS: Bei Lebensdauern von mehreren Nanosekunden kann die Erfassungssoftware die IRF-Verschiebung automatisch abschätzen. Der Erwerb eines IRF wird immer empfohlen.
- Platzieren Sie die Rutsche mit den montierten C. elegans auf der Bühne. Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus und lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia.
- Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63-fache Vergrößerungslinse um und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium (z. B. Öl) an. Ersetzen Sie die Folie auf der Bühne, und lokalisieren Sie die Nematoden.
- Suchen Sie den Pinhole Manager in der Erfassungssoftware und öffnen Sie ihn zum Maximum. Beginnen Sie mit dem Scannen der Probe, wählen Sie einen Bereich aus, der von Interesse ist (z. B. Kopf, Oberkörper), und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene.
- Überwachen Sie die Laserpulsrate und die drei anderen Werte, die auf der Schnittstelle der Software vorhanden sind: Der Constant Fraction Discriminator (CFD), die Time-to-Amplitude (TAC) und der Analogue-to-Digital Converter (ADC).
HINWEIS: Der Laser sollte ein maximales Tor von 1 x 108 einzelphotonenanzahl haben. Diese Zahl stellt die maximale Anzahl von Photonen dar, die vom Laser geliefert werden. Der CFD liefert Informationen über den Empfang des einzelnen Photonenpulses in Bezug auf den Laserpuls durch den Detektor. Dieser Wert sollte ungefähr 1 x 105betragen. Die TAC unterscheidet zwischen dem Zeitpunkt, zu dem ein Photon erkannt wurde, und dem nächsten Laserpuls. Schließlich wandelt der ADC die TAC-Spannung in ein speicherfähiges Speichersignal11um. CFD, TAC und ADC sollten alle ähnliche Werte aufweisen, um sicherzustellen, dass die vom Fluorophor emittierten Photonen nicht verloren gehen. Die korrekte Auswertung dieser Parameter stellt sicher, dass genügend Photonen gesammelt werden, um eine genaue Lebensdauerkarte zu erstellen. - Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an: Der ADC-Wert sollte zwischen 1 x 104 und 1 x 105liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln.
HINWEIS: Im Allgemeinen sollte die Anzahl der aufgezeichneten Photonen pro Sekunde 1 % der Wiederholungsrate des Lasers nicht überschreiten. - Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen.
- Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest. Erwerben Sie z. B. eine lebenslange Zerfallskurve für 2 min oder bis ein einzelnes Pixel eine Photonenanzahl von 2.000 Einzelereignissen erreicht. Drücken Sie Start, um mit der Erfassung zu beginnen.
HINWEIS: Verschiedene Fluorophore erfordern unterschiedliche Anregungs- und Emissionslaser und Filter. Je nach Helligkeit der Probe kann auch die Laserleistung eingestellt werden, was die Lebensdauer nicht beeinträchtigt. Diese Protokolle verwenden die folgenden Anregungs-/Emissionseinstellungen: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Für CFP-Messungen mit ex800/em440 nm wurde ein gepulster zweiphotonen Laser eingesetzt. Die Zeit und die Anzahl der Photonen, die für die Erfassung einer FLIM-Karte erforderlich sind, müssen für jedes Setup und jeden experimentellen Zweck empirisch festgelegt werden.
6. Analyse von FLIM-Daten mit FLIMfit-Software
HINWEIS: Führen Sie datenanalysen mit dem fliMfit-Softwaretool durch, das am Imperial College London12 entwickelt wurde (siehe Abbildung 1).
- Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien über Datei | FLIM-Daten laden. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.
- Segmentieren Sie bei Bedarf eine einzelne Nematode aus jedem FLIM-Bild über Segmentierung | Segmentierungs-Manager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK.
HINWEIS: Die Segmentierung muss für alle Bilder erfolgen. - Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C. elegans angezeigt wird(Abbildung 1, Pfeile 1). Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt(Abbildung 1, Pfeil 2).
HINWEIS: Der Zerfall kann linear oder logarithmisch angezeigt werden. - Legen Sie die richtigen Parameter fest, um die Lebensdauer über den Algorithmus der Software zu extrapolieren, wie in den Schritten 6.5-6.8 beschrieben.
- Auf der Registerkarte Daten (Abbildung 1, Pfeil 3):
- Legen Sie einen beliebigen integrierten Mindestwert fest, um alle Pixel auszuschließen, die zu dim sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Je nach C. elegans Probe variiert dieser Wert zwischen 40-300. Geben Sie verschiedene Werte ein, bis eine zufriedenstellende Vorschau erreicht ist.
- Wählen Sie eine Zeit-Min- und eine Zeitmax-Zahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken. Alle Ereignisse, die vor und nach diesem Schwellenwert angezeigt werden, werden ausgeschlossen.
HINWEIS: Für die Analyse von mRFP wurden beispielsweise die Ereignisse vor 800 ps und nach 4.000 ps ausgeschlossen. Diese Werte hängen von der Lebensdauer des Fluorophors ab und müssen vom Endbenutzer bestimmt werden. - Ändern Sie nicht die voreingestellten Counts/Photon von 1.
- Geben Sie die Wiederholungsratein MHz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird.
HINWEIS: Für das aktuelle Protokoll wurden verschiedene Laser mit unterschiedlichen Wiederholungsraten eingesetzt. Die beiden Photonenlaser, die für die Erfassung von CFP-Lebensdauern verwendet werden, besitzen eine Wiederholungsrate von 80 MHz, für YFP wiederholt sich der Laser bei 40 MHz, und für mRFP beträgt der Wert 78,01 MHz. Diese Werte wurden gemäß der analysierten Stichprobe in FLIMfit eingegeben. - Geben Sie einen Gate Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.
HINWEIS: Für Lebensdauermessungen in C. eleganswird dieser Wert auf eine beliebige große Zahl (z. B. 1 x 108) festgelegt.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll (z. B. eine pixelweise Anpassung). Siehe Abbildung 1, Pfeil 4.
HINWEIS: Ein Pixel-weises Fitting erzeugt einen Zerfall, der auf jedes einzelne Pixel abgestimmt ist. Eine bildweise Anpassung erzeugt eine globale Anpassung jedes einzelnen Bildes und zeigt einen einzelnen Lebensdauerwert pro Bild an. Ein globales Fitting erzeugt eine einzige Anpassung über den gesamten Datensatz. Für alle Bilder wird ein einziger Lebensdauerwert bereitgestellt. - Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Nr. Exp-Auswahl, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist.
HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurde diese Funktion verwendet, um die Lebensdauer des biexponentiellen CFP-Fluorophors zu berechnen. - Hochladen des IRF über das IRF-Menü: IRF | IRF laden. Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF | Schätzen Sie IRF Shift. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.
- Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie Datensatz anpassen (Abbildung 1, Pfeil 5). Der Algorithmus erzeugt eine Anpassung für die Zerfallskurve und legt einen Lebensdauerwert für jedes Bild fest.
HINWEIS: Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben ist, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind. - Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter (Abbildung 1, Pfeil 6), die sich in den oberen rechten Menüs der Softwareoberfläche befindet, und wählen Sie Statistik: w_mean (gewichteter Mittelwert) und überprüfen Sie, ob der chi2-Wert so nah wie möglich an 1 liegt.
HINWEIS: Ein Chi2 in der Nähe von einem gewährleistet die Genauigkeit der Passung. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als tau_1offenbart. - Exportieren von Informationen von Interesse: Datei | Export Intensitätsbilder/Ergebnistabelle/Bilder/Histogrammeexportieren. Speichern Sie die Dateneinstellungen, die zum Berechnen der Lebensdauer verwendet werden: Datei | Dateneinstellungen speichern.
HINWEIS: Die verwendeten Parameter werden für die zukünftige Analyse der ausgewählten Stichproben gespeichert.
7. Grafische Darstellungen von FLIM-Daten
HINWEIS: Die aus verschiedenen Proben gesammelten Lebensdauern können auf verschiedene Weise visuell dargestellt werden. Wählen Sie diese Option aus, um die Lebensdauerwerte entweder in Nanosekunden oder Inskopikosekunden anzuzeigen.
- Zeigen Sie die Qualität der Passung und die Genauigkeit der Kurve an, indem Sie die Zerfallskurve direkt aus FLIMfit exportieren.
- Stellen Sie die Verteilung der Photonen dar, indem Sie die Häufigkeit der Photonenanzahl im Vergleich zum Lebensdauerwert in einem Histogramm darstellen.
- Zum statistischen Vergleich schließlich platzieren Sie beim Vergleich von zwei oder mehr Stichproben Lebensdauerwerte plus Standardabweichung des Mittelwerts in einem Streudiagrammstrichdiagramm. Führen Sie alle gewünschten statistischen Analysen durch.
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Representative Results
Das Protokoll zeigt, wie die Bildung von aggregierten Arten in lebenden C. elegansgenau überwacht werden kann, sowohl während seiner natürlichen Alterung als auch bei Stress. Wir wählten vier verschiedene Stämme von transgenen Nematoden aus, die Polyglutaminproteine von 40Q, 44Q oder 85Q Wiederholungen exdrücken. Diese Proteine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und zu verschiedenen Fluorophoren verschmolzen. Die C. elegans-Stämme exprimieren entweder Q40-mRFP in den Körperwandmuskeln (mQ40-RFP), Q40-CFP im Nervensystem (nQ40-CFP) und entweder Q44-YFP oder Q85-YFP im Darm (iQ44-YFP und iQ85-YFP)13. Um zu veranschaulichen, wie das Altern die Aggregation fördert, haben wir die Lebensdauer dieser PolyQ-Stämme in jungen Nematoden, am 4. Tag des Lebens, und alten Nematoden, an Tag 8 gesammelt. Um die Auswirkungen eines Mangels im PN zu zeigen, haben wir einen Knockdown von hsp-1 in den mQ40-RFP und den nQ40-Stämmen durchgeführt.
Nachdem die Lebensdauerwerte über die FLIMfit-Software extrapoliert wurden, zeigten die erhaltenen Daten eine deutliche Verringerung der Lebensdauer eines der PolyQ-Konstrukte, wenn sie entweder aufgrund von Glutaminlast, Alterung oder Stress aggregiert wurden. FLIM unterscheidet zwischen der löslichen Proteinfraktion und der aggregierten Art und ihrem Übergang, indem sie eine Verschiebung ihres Lebens aufzeichnete.
An Tag 4 zeigte mQ40-RFP eine durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer von 1,69 ns (Abbildung 2). Nach dem Altern entstanden mehr aggregierte Arten, die in den Lebensbildern als niedrige Lebensschwerpunkte auftauchten und das Histogramm auf reduzierte Lebensdauern verlagerten(Abbildung 2A). Durch die Darstellung der mittleren Fluoreszenzlebensdauer jedes erworbenen Bildes über das Alter der Nematoden wurde eine signifikante Verringerung der Fluoreszenzlebensdauer und damit die Akkumulation aggregierter Arten sichtbar (Abbildung 2B). Die Proteinfaltkapazität des PN sank nach Tag 4 des Lebens in C. elegans14 und aggregationsanfällige Proteine verfielen weiter, um sich zu Amyloid- und amorphen Aggregaten zu häufen. Neben dem PN spielten die intrinsischen Aggregationsneigungen eines bestimmten Proteins eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Aggregatbildung. Dies wurde durch einen Vergleich des Verhaltens von iQ44-YFP und iQ85-YFP analysiert. Die längere Q-Stretch des iQ85 war anfälliger für Aggregation und zeigte eine Fluoreszenz-Lebensdauerverschiebung im Histogramm bereits an Tag 4 des Lebens (Abbildung 3A). Tatsächlich wurde an Tag 4 die Foci-Bildung für iQ85 beobachtet, während sie in iQ44 noch fehlte. Nach dem Altern zeigte iQ44 aber auch eine Brennpunktebildung und damit eine reduzierte Fluoreszenzlebensdauer. Da iQ85 bereits im frühen Erwachsenenalter Aggregate auswies, war das Fortschreiten der Aggregation nach alterungsbedingt erdender Fortschritt weniger ausgeprägt, aber signifikant (Abbildung 3B). Schließlich haben wir weder die Foci-Bildung noch die verminderte Fluoreszenzlebensdauer im nQ40-CFP-Stamm festgestellt (Abbildung 4A). Für diesen Stamm gab es nur subtile, nicht signifikante Veränderungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer nach alterungsbedingter Alterung (Abbildung 4B), möglicherweise aufgrund der weniger anfälligen Neuronen aus noch unbekannten Gründen.
Das Abklopfen von hsp-1 stellt eine Herausforderung für den PN von mQ40 und nQ40 dar, der Nematoden ausdrückt. Die RNAi-vermittelte Erschöpfung von hsp-1 führte zu einer signifikanten Zunahme der Aggregation (Abbildung 5 und Abbildung 6). Q40, ausgedrückt in Körperwandmuskeln, neigte dazu, eine kleine Anzahl von großen Brennpunkten zu bilden, die von nicht aggregiertem Material umgeben waren. Dies führte zu zwei unterscheidbaren Spitzen in den Histogrammen (ca. 1,7 ns und 1,4 ns, siehe Abbildung 5A). Die im Alter und RNAi behandelten Nematoden zeigten einen starken Anstieg der niedrigen Lebensdauer Spitze letztlich verringert die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer (Abbildung 5B). Im Vergleich zu diesem biphasischen Verhalten von Q40 in den Muskeln zeigte das neuronale Q40 ein vielfältigeres Aggregationsverhalten. Wir konnten die Brennpunktebildung nicht direkt mit der Aggregation korrelieren, wie in der Muskelexpressionsdehnung (Abbildung 6A). Da FLIM die Möglichkeit bietet, den Grad der Aggregation zu beurteilen, ergaben die Histogramme, dass es keinen deutlichen Peak, sondern eine weit verbreitete Verteilung von Fluoreszenzlebensdauern gab, was auf eine komplexe Zusammensetzung verschiedener Oligomere und Aggregate höherer Ordnung hindeutet. Dennoch könnte der Gesamtgrad der Aggregation durch Plotten der mittleren Fluoreszenzlebensdauer(Abbildung 6B)bewertet werden, was zeigt, dass hsp-1 Knockdown zu einem Anstieg der Aggregation geführt hat.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Lebensdauer der Fluorophore, frei von einem Fusionspartner und außerhalb eines biologischen Systems, höher war. Da die Lebensdauer in erster Linie von ihrer Umgebung beeinflusst wird, war eine leichte Verkürzung der Lebensdauer von YFP und RFP bereits im Gewebe von C. elegans spürbar. Daher ist es wichtig, die Lebensdauer des löslichen POI innerhalb des Nematoden als geeignete Kontrolle zu erhalten. Anschließend kann ein Vergleich zwischen der löslichen Fraktion mit einer höheren Lebensdauer und einer aggregierten Fraktion mit einer niedrigeren Lebensdauer angestellt werden. Hierkorrelierte die Abnahme der Lebensdauer mit der Bildung sichtbarer Brennpunkte innerhalb der Muskel- und Darmzellen. Dennoch zeigte ein Bruchteil der Brennpunkte keine Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3,weiße Pfeile). Diese Funktion zeigt, wie nur ein Teil des Fusionskonstrukts an einem bestimmten raumzeitlichen Punkt aggregiert werden kann, sowie das Vorhandensein und die Verfügbarkeit von ungebundenem Protein. Ein komplexeres Szenario ergab sich aus der Untersuchung des neuronalen Q40-CFP-Stamms. CFP besitzt intrinsisch zwei unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern. Während CFP ein ideales Fluorophor für Förster Resonanzenergieübertragung (FRET)15 Messungen ist, in Verbindung mit YFP, ist es nicht ratsam, es zu verwenden, um die Bildung von Aggregaten in C. eleganszu überwachen.
Abbildung 1: Screenshot der FLIMFit-Softwareschnittstelle. Screenshot der Software zur Berechnung der Fluoreszenzlebensdauer. Das Fenster zeigt die Schnittstelle, nachdem Einstellungen wie im Text beschrieben definiert wurden und die Berechnung der Lebensdauer durchgeführt wurde. Nummerierte Pfeile beziehen sich auf bestimmte Schritte innerhalb des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Fluoreszenzlebensdauer des muskulösen Q40-RFP nahm mit dem Alter ab. (A) Repräsentative Karten von C. elegans, die muskulöses Q40-RFP am 4. oder 8. Tag des Lebens ausdrücken, das von FLIMfit generiert wird. Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzintensität und ein zusammengeführtes Bild von beidem werden bereitgestellt. Skalenbalken = 25 m. Histogramme zeigen eine Verteilung der gemessenen Lebensdauern für alle analysierten Nematoden, die in 100 Kategorien unterteilt sind. (B) Balkendiagramme, die die gewichtete mittlere Fluoreszenzlebensdauer aller analysierten Tiere am 4. bzw. 8. Tag des Lebens zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszenzlebensdauern von Darm Q44-YFP und Darm Q85-YFP mit dem Alter abgenommen. (A) Repräsentative Karten von C. elegans, die Darm Q44-YFP oder Darm Q85-YFP am 4. oder 8. Tag des Lebens, der von FLIMfit erzeugt wird, zum Ausdruck bringen. Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzintensität und ein zusammengeführtes Bild von beidem werden bereitgestellt. Skalenbalken = 25 m. Histogramme zeigen eine Verteilung der gemessenen Lebensdauern für alle analysierten Nematoden, die in 100 Kategorien unterteilt sind. (B) Balkendiagramme, die die gewichtete mittlere Fluoreszenzlebensdauer aller analysierten Tiere am 4. bzw. 8. Tag des Lebens zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Fluoreszenzlebensdauer n.V. der neuronalen Q40-CFP hat sich mit dem Alter nicht verändert. (A) Repräsentative Karten von C. elegans, die neuronale Q40-CFP am 4. oder 8. Tag des lebens zeigen, die von FLIMfit generiert werden. Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzintensität und ein zusammengeführtes Bild von beidem werden bereitgestellt (die zweite Lebensdauer, 2, ist in allen Proben angegeben). Skalenbalken = 25 m. Histogramme zeigen eine Verteilung der gemessenen Lebensdauern für alle analysierten Nematoden, die in 100 Kategorien unterteilt sind. (B) Balkendiagramme, die die gewichtete mittlere Fluoreszenzlebensdauer aller analysierten Tiere am 4. bzw. 8. Tag des Lebens zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Fluoreszenzlebensdauer von muskulösen Q40-RFP verringert e.V. bei Knockdown von hsp-1. (A) Repräsentative Karten von C. elegans, die muskulöses Q40-RFP am 4. oder 8. Tag des Lebens ausdrücken, das von FLIMfit generiert wird. Es wird eine Verschmelzung der Fluoreszenzlebensdauer- und Intensitätskarte angezeigt. Für beide Zeitpunkte werden Nematoden gezeigt, die auf Bakterien wuchsen, die einen leeren Vektor (Kontrolle) ausdrückten, oder Bakterien, die das hsp-1 RNAi-Konstrukt exzessitherexziderten. Skalenbalken = 25 m. Histogramme zeigen eine Verteilung der gemessenen Lebensdauern für alle analysierten Nematoden, die in 100 Kategorien unterteilt sind. (B) Balkendiagramme, die die gewichtete durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer aller analysierten Tiere am 4. oder 8. Tag des Lebens zeigen, mit Kontrolle bzw. hsp-1 RNAi. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Fluoreszenzlebensdauern der neuronalen Q40-CFP verringerten sich nach Demknach von hsp-1. (A) Repräsentative Karten von C. elegans, die neuronale Q40-CFP am 4. Tag des Lebens, der von FLIMfit erzeugt wird, ausdrücken. Es wird eine Verschmelzung der Fluoreszenzlebensdauer- und Intensitätskarte angezeigt. Die gezeigten Nematoden wurden auf Bakterien angebaut, die einen leeren Vektor (Kontrolle) oder Bakterien ausdrückten, die das hsp-1 RNAi-Konstrukt exdrückten. Skalenbalken = 25 m. Histogramme zeigen eine Verteilung der gemessenen Lebensdauern für alle analysierten Nematoden, die in 100 Kategorien unterteilt sind. (B) Balkendiagramme, die die gewichtete mittlere Fluoreszenzlebensdauer aller analysierten Tiere am 4. Tag mit Kontrolle RNAi oder dem hsp-1 RNAi zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine mikroskopiebasierte Technik zur Identifizierung aggregierter Arten im C. elegans-Modellsystem. FLIM kann das Vorhandensein sowohl aggregierter als auch löslicher Arten, die zu einem Fluorophor verschmolzen sind, durch Messung ihrer Fluoreszenz-Lebensdauer-Zerfalle genau charakterisieren. Wenn ein Fusionsprotein beginnt, seine aufgezeichnete durchschnittliche Lebensdauer zu aggregieren, verschiebt sich es von einem höheren auf einen niedrigeren Wert16. Die Neigung zur Aggregation lässt sich dann durch den Rückgang der Lebensdauer ableiten: Je niedriger die Lebensdauer, desto höher ist das Vorhandensein von aggregierten Proteinarten im System. Dadurch wird es möglich, die Auswirkungen von Alterung, Krankheit oder Beeinträchtigung von PN auf die Aggregationsneigung eines Proteins zu verfolgen.
Um die Vielseitigkeit der Technik hervorzuheben, zeigten unsere Ergebnisse deutlich, dass FLIM die Veränderungen in der Struktur der verschiedenen PolyQ-Konstrukte identifizieren konnte, unabhängig vom Gewebe oder Fluorophor. Wichtig ist, dass FLIM bereits erfolgreich bei der Charakterisierung anderer aggregationsanfälliger Proteine innerhalb von17 C. eleganseingesetzt wurde, wie z.B. Darüber hinaus wird es möglich, jeden Stressfaktor auf C. elegans anzuwenden und die Entfaltung und Aggregation eines beliebigen POI zu verfolgen. Osmotischer, Metallionen-, Redox- oder chemischer Stress können alle toxische Ungleichgewichte fördern, die bei C. elegans mit FLIM erfolgreich überwacht werden können. Das Gegenteil könnte auch möglich sein: eine Verzögerung der Aggregation oder sogar Disaggregation aufgrund des Vorhandenseins von nützlichen Verbindungen oder die Steigerung des PN, kann zu einer Rettung des Proteins und einer daraus resultierenden Erhöhung der Lebensdauer führen.
FLIM wurde häufig eingesetzt, um Veränderungen in der Lebensdauer jeder Substanz in einer Breitenpalette von Disziplinen von der Chemie über die Krebsbiologie18 bis hin zur medizinischen Diagnostik zu überwachen, aber einige Einschränkungen bleiben bestehen. Ein Hauptproblem ist die Photostabilität von Fluorophoren. Da FLIM die Aufnahme einer großen Anzahl von Photonen erfordert, reduziert photobleaching die Anzahl der gesammelten Photonen und kann die resultierende Zerfallskurve ändern. Darüber hinaus ist insbesondere innerhalb des Nematodensystems, wenn die Intensität des Fluorophors selbst nicht hoch genug ist, um genügend Photonen zu sammeln, eine höhere Anregung erforderlich, was zu einer schnelleren Photobleaching und einer unzuverlässigen Zerfallskurve führt. Schließlich erfordert die Technik ausgeklügelte und kostspielige Geräte als Add-ons zu bereits bestehenden Mikroskopiesystemen, wobei ein kritisches Element die Empfindlichkeit der Detektoren19ist.
Umgekehrt besteht einer der Hauptvorteile bei der Berechnung der Lebensdauer eines Fluorophors und seines Fusionsproteins darin, dass es Informationen über verschiedene Fraktionen desselben Fluorophor-Protein-Komplexes in verschiedenen Zuständen von Wechselwirkungen innerhalb seiner Umgebung liefert, unabhängig von seiner weitgehend unbekannten Konzentration. FLIM kann auch verwendet werden, um die Lebensdauer in jeder Phase, Gas, Flüssigkeit oder fest und in jedem Medium oder Organismus zu messen, das normalerweise abgebildet werden kann, von Zellen zu Organismen und Organellen bis hin zu immobilisierten, gereinigten Proteinen20. Mikroskopie-Techniken basieren in der Regel auf der stationären Bildgebung eines fluoreszierend getaggten Proteins. Im Gegensatz zu stationären Techniken kann FLIM Änderungen in Bindung, Zusammensetzung und Konformation eines biologischen Substrats auflösen. Zur Untersuchung von aggregationsanfälligen Proteinen kann das Vorhandensein großer fluoreszierender Einschlüsse oder Brennpunkte leicht abgebildet werden, aber diese stellen nur eine statische, intensitätsbasierte Momentaufnahme3dar. Bei aggregierten Arten können die visualisierten Brennpunkte auch irreführend sein, da eine hohe Fluorophorkonzentration nicht notwendigerweise zu einer starken Amyloidbildung führt. Über FLIM ist es stattdessen möglich, lösliches von unlöslichem Material zu unterscheiden. Schließlich wird es für jede Untersuchung vorteilhaft, sowohl die intensitätsbasierten Messungen als auch die parallele Lebensdauermessung zu erhalten. In der Komplementarität dieser Mikroskopietechniken liegt ihre Stärke.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Der Muskel-Q40-mRFP-Stamm des CGC, der vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Das neuronale-Q40-CFP war ein freundliches Geschenk des Morimoto Lab. Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 bis JK, NeuroCure PhD Fellowship des NeuroCure Cluster of Excellence to MLP), EMBO (Kurzzeitstipendium an MLP) und das Unternehmen der Biologen (Reisestipendien an CG und MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Advanced Light Microscopy Imaging Facility am Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, für die Bereitstellung der Einrichtung, um die YFP-Konstrukte abzubilden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Ahringer Library hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | Antibiotic |
| B&H DCS-120 SPC-150 | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| B&H SPC830-SPC Image | Becker & Hickl GmbH | FLIM Aquisition software | |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| C. elegans iQ44-YFP | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OG412 | |
| C. elegans iQ85-YFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans mQ40-RFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| C. elegans nQ40-CFP | Kind gift from Morimoto Lab | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | Leica Camera AG | Mounting Stereomicroscope | |
| Leica TCS SP5 | Leica Camera AG | Confocal Microscope | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM Aquisition software | |
| Sodium Azide | Carl Roth GmbH + Co. KG | K305.1 | Anesthetic |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| Universal Agarose | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope | |
| Zeiss LSM510-Meta NLO | Carl Zeiss AG | Confocal Microscope |
References
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