Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Summary

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Abstract

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans l’éradication du virus de la variole (VARV), l’agent causatif de la variole, de la nature. Depuis sa première utilisation comme vaccin, vaCV a été développé comme vecteur de vaccins thérapeutiques et de virus oncolytique. Ces applications tirent parti du génome facilement manipulé de VACV et de la large gamme d’hôtes comme plate-forme exceptionnelle pour générer des virus recombinés avec une variété d’applications thérapeutiques. Plusieurs méthodes ont été développées pour générer des VACV recombinés, y compris des méthodes de sélection de marqueurs et une sélection dominante transitoire. Ici, nous présentons un raffinement d’une méthode de sélection de gamme d’hôtes couplée à l’identification visuelle des virus recombinants. Notre méthode tire parti de la pression sélective générée par la protéine antivirale hôte kinase R (PKR) couplée à un gène de fusion fluorescent exprimant mCherry-tagged E3L, l’un des deux antagonistes VACV PKR. La cassette, y compris le gène d’intérêt et la fusion mCherry-E3L, est flanquée de séquences dérivées du génome du VACV. Entre le gène d’intérêt et mCherry-E3L est une région plus petite qui est identique aux premiers nucléotides de 150 pouces du bras 3′, pour favoriser la recombinaison et la perte homologues du gène mCherry-E3L après sélection. Nous démontrons que cette méthode permet une génération efficace et transparente de vruvure dans une variété de types de cellules sans nécessiter la sélection de médicaments ou un dépistage approfondi des virus mutants.

Introduction

Le virus vaccinia (VACV) a joué un rôle déterminant dans la première éradication réussie d’un agent pathogène humain, le virus de la variole (VARV), de la nature. Depuis l’extermination du virus de la variole, les virus du vaxovirus, y compris le VVC, continuent d’être des virus thérapeutiques utiles pour la médecine humaine et animale. Par exemple, un vaccin contre le virus de la rage à base de VGRI a été très efficace pour prévenir la transmission de la rage sylvatique en Europe¹ et aux États-Unis². Plus récemment, les poxvirus recombinés exprimant une variété de molécules antitumorales (p. ex., anticorps à chaîne unique ou érythropoïétine humaine) ont connu un succès encourageant en tant qu’agents oncolytiques^3,4,5. VACV est particulièrement attrayant en tant que vecteur parce qu’il est facilement favorable à la manipulation génétique, possède une large gamme d’hôtes, et il est stable dans une variété de conditions, permettant un transport facile et la viabilité du vaccin dans le domaine^6,7. Bien que de multiples techniques aient été mises au point pour générer des VACV recombinés pour les expériences en laboratoire et la génération de vaccins, les stratégies actuelles visant à générer ces virus ont des limites notables.

Grâce à l’utilité du VVC, de multiples stratégies pour générer des virus recombinants ont été développées. La première stratégie utilise une recombinaison homologue pour introduire une cassette comprenant le transgène et un gène marqueur sélectionnable comme un gène de résistance aux antibiotiques. La cassette est flanquée de deux nucléotides (nt) ou de bras plus gros qui dirigent le gène vers un site spécifique du génome viral, qui est ensuite intégré de façon stable par des événements double crossover^8,,9,10. Cette stratégie est rapide et efficace; cependant, il en résulte du matériel génétique supplémentaire sous la forme du gène marqueur qui peut produire des effets inattendus. En outre, il existe une limite supérieure pratique au nombre de transgènes qui peuvent être introduits limités par le nombre de marqueurs sélectionnables uniques disponibles. Les stratégies transitoires de sélection dominante (TDS) ont abordé cette question en facilitant la génération de virus recombinants « sans cicatrices^{» 11}. Grâce à cette stratégie, un plasmide contenant un gène VACV mutant et un gène marqueur sélectionnable sont intégrés dans le génome viral, mais sans ADN VACV flanquant supplémentaire. Cette approche se traduit par l’intégration transitoire de l’ensemble du plasmide et la duplication du gène VACV à la suite de l’intégration par un seul événement de croisement. Cet intermédiaire est stable tant qu’il est maintenu sous pression de sélection, ce qui permet l’enrichissement de cette construction. Lorsque la sélection est supprimée, la duplication VACV permet un deuxième événement de croisement qui entraîne l’élimination du plasmide et la formation subséquente du type sauvage (wt) ou du virus recombinant dans un rapport approximatif de 50:50. Alors que le TDS génère des virus recombinés sans nécessiter l’introduction stable de l’ADN étranger, plusieurs clones de virus doivent être examinés pour la mutation prévue par l’analyse de séquençage, une étape potentiellement longue et coûteuse.

Ici, nous présentons une approche pour générer des poxvirus recombinés combinant les meilleurs aspects de chacune de ces approches, similaire à une approche qui a été décrite pour la réplication incompetent vaccinia modifié Ankara^12,13,14. Cette stratégie combine la sélection visuelle et de la gamme d’hôtes pour générer rapidement des virus recombinants par des événements multisegments doubles, et par la suite éliminer le gène marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Cette approche permet la génération rapide de mutants négociés par une recombinaison homologue, avec la nature « sans cicatrice » des approches TDS, tout en n’exigeant pas une étape de dépistage ultérieure pour distinguer les virus sauvages de type et mutant. Notre méthode utilise également la sélection de la gamme hôte à la place de la sélection d’antibiotiques, éliminant le risque de changements phénotypiques induits chimiquement dans la lignée cellulaire. Pour cette approche, nous avons choisi d’utiliser la protéine antivirale hôte kinase R (PKR) comme agent sélectif pour générer recombinant VACV. PKR est exprimé comme un monomère inactif dans la plupart des types de cellules¹⁵. Sur la liaison arnorisation à double brin (dsRNA) dans les domaines de liaison N-terminal dsRNA, PKR dimerizes et est autophosphorylated¹⁶. Cette forme active de phosphorylates PKR l’alpha sous-unité du facteur d’initiation eucaryotique 2 (eIF2), inhibant finalement la livraison de l’initiateur méthionyl-tRNA au ribosome, empêchant ainsi la traduction intracellulaire et inhibant largement la réplication de nombreuses familles^{virales 17,18}.

En réponse à l’activité antivirale large et puissante de PKR, de nombreux virus ont développé au moins une stratégie pour prévenir l’activation de la PKR. La plupart des poxvirus expriment deux antagonistes PKR, codés par les gènes E3L et K3L dans VACV, qui contrarier PKR par deux mécanismes distincts¹⁹. E3 empêche l’homodimerisation PKR en liant l’ARN à double brin^20,21, tandis que K3 agit comme un inhibiteur pseudo-ubstrate en liant directement à PKR activé et inhibant ainsi l’interaction avec son substrat eIF2²². Fait important, ces deux antagonistes de PKR n’inhibent pas nécessairement PKR de toutes les espèces. Par exemple, l’homolog K3 du virus de la variole du mouton a fortement inhibé le PKR des moutons, tandis que l’homolog de la variole du mouton E3 n’a pas montré d’inhibition considérable de PKR^23,24. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’utilisation de la pression sélective à médiation PKR combinée à la sélection de fluorescence pour générer un recombinant VACV supprimé pour E3L et K3L (VC-R4), qui ne peut pas reproduire dans les cellules compétentes PKR dérivées de diverses espèces. Ce virus recombinant fournit un excellent arrière-plan pour la génération rapide de virus recombinants exprimant des gènes sous contrôle du promoteur indigène E3L.

Protocol

1. Générer le vecteur de recombinaison Amorce de conception pour générer la cassette de sélection. Concevez chaque amplicon individuel avec des séquences qui se chevauchent avec les amplicons voisins et le vecteur pour faciliter l’assemblage enzymatique isothermal des molécules d’ADN, également appelé assemblage Gibson, en utilisant l’un des outils de conception d’apprêt en ligne plusieurs.REMARQUE : Ce protocole peut également être complété à l’aide de méthodes traditionnelles de …

Representative Results

Nous avons utilisé la procédure diagrammed dans la figure 1 pour générer un VACV manquant à la fois PKR antagonistes E3L et K3L, en remplaçant E3L par EGFP dans un virus déjà supprimé pour K3L (vP872). La figure 2 montre des plaques fluorescentes rouges dans les cellules RK13 compétentes de PKR indicatifs de l’expression virale de mCherry-E3L, ainsi que l’EGFP exprimées dans les cellules RK13-E3L-K3L confirmant la perte de l’E3L et l’effondrem…

Discussion

Ici, nous présentons une variation d’une stratégie transitoire de sélection des marqueurs ³² pour générer des virus vaccinia recombinants sans retenir l’ADN étranger dans le virus recombinant final. Notre stratégie utilise une pression sélective négociée par la protéine antivirale hôte PKR plutôt que d’autres formes de pression sélective comme les antibiotiques. L’utilisation de gènes antiviraux hôtes élimine la possibilité de changements phénotypiques induits chimiqueme…

Materials

2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates