Rask, sømløs generering av rekombinante poxvirus ved hjelp av vertsområde og visuelt utvalg
Summary
Dette er en metode for å generere “arrløse” rekombinant vaccinia virus ved hjelp av vertsområde valg og visuell identifikasjon av rekombinant virus.
Abstract
Vaccinia virus (VACV) var medvirkende til å utrydde variola virus (VARV), årsaksmiddel av kopper, fra naturen. Siden første gangs bruk som vaksine har VACV blitt utviklet som vektor for terapeutiske vaksiner og som et onkolytisk virus. Disse programmene drar nytte av VACVs lett manipulerte genom og brede vertsområde som en enestående plattform for å generere rekombinantvirus med en rekke terapeutiske applikasjoner. Flere metoder er utviklet for å generere rekombinant VACV, inkludert markørvalgmetoder og forbigående dominerende utvalg. Her presenterer vi en forbedring av en vertsområdevalgmetode kombinert med visuell identifisering av rekombinantvirus. Vår metode utnytter selektivt trykk generert av verten antiviral protein kinase R (PKR) kombinert med en fluorescerende fusjon gen uttrykker mCherry-merket E3L, en av to VACV PKR antagonister. Kassetten, inkludert genet av interesse og mCherry-E3L fusjon er flankert av sekvenser avledet fra VACV genom. Mellom genet av interesse og mCherry-E3L er en mindre region som er identisk med de første ~ 150 nukleotider av 3 ‘arm, for å fremme homolog rekombinasjon og tap av mCherry-E3L genet etter valg. Vi viser at denne metoden tillater effektiv, sømløs generering av rVACV i en rekke celletyper uten å kreve legemiddelvalg eller omfattende screening for muterte virus.
Introduction
Vaccinia virus (VACV) var medvirkende for den første vellykkede utryddelse av et humant patogen, variola virus (VARV), fra naturen. Helt siden utryddelsen av variolavirus har poxvirus inkludert VACV fortsatt å være nyttige terapeutiske virus for både menneskelig og animalsk medisin. For eksempel har en VACV-basert rabiesvirusvaksine vært svært effektiv i å forhindre overføring av sylvatiske rabies i Europa1 og USA2. Mer nylig, rekombinant poxviruses uttrykker en rekke anti-tumor molekyler (f.eks en-kjede antistoffer eller menneskelig erytropoietin) har sett oppmuntrende suksess som onkolytiske midler3,4,5. VACV er spesielt attraktiv som vektor fordi det er lett mottagelig for genetisk manipulasjon, har et bredt vertsområde, og det er stabilt under en rekke forhold, slik at enkel transport og vaksine levedyktighet i feltet6,7. Mens flere teknikker er utviklet for å generere rekombinant VACV for laboratorieeksperimenter og vaksinegenerering, har dagens strategier for å generere disse virusene bemerkelsesverdige begrensninger.
På grunn av nytten av VACV, flere strategier for å generere rekombinant virus har blitt utviklet. Den første strategien benytter homolog rekombinasjon for å introdusere en kassett, inkludert transgene og et valgbart markørgen som et antibiotikaresistensgen. Kassetten er flankert av to ~ 500 nukleotider (nt) eller større armer som dirigerer genet til et bestemt sted i det virale genomet, som deretter stabilt integrert av doble crossover hendelser8,9,10. Denne strategien er rask og effektiv; Det resulterer imidlertid i ekstra genetisk materiale i form av markørgenet som kan gi uventede effekter. Videre er det en praktisk øvre grense for antall transgener som kan innføres begrenset av antall unike valgbare markører tilgjengelig. Forbigående dominerende utvalg (TDS) strategier har adressert dette problemet ved å legge til rette for generering av “knappe” rekombinant virus11. Ved hjelp av denne strategien er en plasmid som inneholder et mutert VACV-gen og et valgbart markørgen integrert i det virale genomet, men uten ytterligere flankering av VACV DNA. Denne tilnærmingen resulterer i forbigående integrering av hele plasmid og duplisering av VACV genet som følge av integrering av en enkelt crossover hendelse. Dette mellomspillet er stabilt så lenge det opprettholdes under utvalgstrykk, noe som tillater berikelse av denne konstruksjonen. Når valget fjernes, muliggjør VACV duplisering en andre crossover-hendelse som resulterer i fjerning av plasmid og påfølgende dannelse av enten vill type (wt) eller rekombinant virus i et omtrentlig 50:50-forhold. Mens TDS genererer rekombinant virus uten å kreve stabil innføring av utenlandsk DNA, flere viruskloner må screenes for den forventede mutasjonen ved sekvensering analyse, en potensielt tidkrevende og kostbart skritt.
Her presenterer vi en tilnærming til å generere rekombinant poxvirus som kombinerer de beste aspektene ved hver av disse tilnærmingene, lik en tilnærming som er beskrevet for replikering inkompetentmodifisert vaccinia Ankara12,13,14. Denne strategien kombinerer visuelt og vertsutvalgsvalg for raskt å generere rekombinantvirus ved doble crossover-hendelser, og deretter eliminere det valgbare markørgenet ved homolog rekombinasjon. Denne tilnærmingen tillater den raske generasjonen mutanter mediert av homolog rekombinasjon, med den “knappe” naturen til TDS tilnærminger, samtidig som det ikke krever et påfølgende screeningtrinn for å skille vill type og mutant virus. Vår metode bruker også vertsområdevalg i stedet for antibiotikavalg, og eliminerer risikoen for kjemisk induserte fenotypiske endringer i cellelinjen. For denne tilnærmingen har vi valgt å bruke verten antiviral protein kinase R (PKR) som selektiv middel for å generere rekombinant VACV. PKR uttrykkes som en inaktiv monomer i de fleste celletyper15. Ved binding av dobbeltstrandede RNA (dsRNA) ved N-terminal dsRNA-bindende domener, dimmer PKR og er autofosforylert16. Denne aktive formen for PKR fosforlater alfa-underenheten av eukaryyotisk initieringsfaktor 2 (eIF2), til slutt hemme levering av initiator methionyl-tRNA til ribosom, og dermed hindre intracellulær oversettelse og bredt hemme replikering av mange virus familier17,18.
Som svar på den brede og potente antivirale aktiviteten til PKR, har mange virus utviklet seg minst én strategi for å forhindre PKR-aktivering. De fleste poxviruses uttrykke to PKR antagonister, kodet av E3L og K3L gener i VACV, som antagoniserer PKR gjennom to forskjellige mekanismer19. E3 forhindrer PKR homodimerization ved å binde dobbeltstrandede RNA20,21, mens K3 fungerer som pseudosubsstrathemmer ved å binde direkte til aktivert PKR og dermed hemme interaksjon med substratet eIF2α22. Viktigere, disse to PKR antagonister ikke nødvendigvis hemme PKR fra alle arter. For eksempel, K3 homolog fra sheeppox viruset sterkt hemmet PKR fra sauer, mens sheeppox E3 homolog viste ikke betydelig PKR hemming23,24. I denne studien presenterer vi en metode for å bruke PKR-mediert selektivt trykk kombinert med fluorescensvalg for å generere en VACV rekombinant slettet for E3L og K3L (VC-R4), som ikke kan replikere i PKR kompetente celler avledet fra ulike arter. Dette rekombinantviruset gir en utmerket bakgrunn for rask generering av rekombinantvirus som uttrykker gener under kontroll av den innfødte E3L-arrangøren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en variant av en forbigående markør valgstrategi 32 for å generere rekombinant vaccinia virus uten å beholde utenlandsk DNA i det endelige rekombinantviruset. Vår strategi bruker selektivt trykk mediert av verten antiviralprotein PKR i stedet for andre former for selektivt trykk som antibiotika. Bruken av vertsantivirale gener eliminerer muligheten for kjemisk induserte fenotypic endringer i cellene, eller økt risiko for mutasjon på grunn av utvalgnarkotika. Videre, i mot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health (AI114851) til SR.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
