Summary
نموذج تلقيح القدمين هو أداة قيمة لتميز الاستجابات العصبية الفيروسية في الجسم الحي. على وجه الخصوص، فإنه يوفر تقييما واضحا للحركيات الفيروسية والعمليات المناعية المرتبطة بها التي بدأت في الجهاز العصبي المحيطي.
Abstract
يصف هذا البروتوكول نموذج تلقيح الاقدام المستخدم لدراسة بدء وتطوير الاستجابات العصبية خلال عدوى فيروس الفاتس في الفئران. كما alphaherpesviruses هي الغزاة الرئيسيين للجهاز العصبي المحيطي (PNS)، وهذا النموذج هو مناسبة لتوصيف الحركية من تكرار الفيروسية، وانتشاره من PNS إلى CNS، والاستجابات العصبية المرتبطة. يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لجزيئات الفيروسات بلانتشار من موقع العدوى الأساسي في البشرة في منصة القدم إلى الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تُعمّق البشرة والغدد العرقية والأدمة. تنتشر العدوى عبر العصب الوركي إلى جذر الظهر (DRG) وفي نهاية المطاف من خلال الحبل الشوكي إلى الدماغ. هنا ، يتم تلقيح لوحة قدم الماوس مع فيروس pseudorabies (PRV) ، وهو فيروس ألفابروكس وثيق الصلة بفيروس الهربس البسيط (HSV) وفيروس varicella-zoster (VZV). هذا النموذج يدل على أن عدوى PRV يؤدي إلى التهاب حاد, تتميز بتسلل العدلات في مهبط القدم وDG. يتم الكشف عن تركيزات عالية من السيتوكينات الالتهابية في وقت لاحق في الأنسجة المتجانسة بواسطة ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود ارتباط قوي بين جين PRV والتعبير البروتيني (عبر qPCR و IF تلطيخ) في DRG وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات. لذلك، يوفر نموذج التلقيح في الاقدام فهما أفضل للعمليات الكامنة تحت alphaherpes التي يسببها فيروس اعتلال الأعصاب، وقد يؤدي إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للنموذج توجيه البحوث على الاعتلالات العصبية الطرفية، مثل التصلب المتعدد والأضرار الناجمة عن الفيروسية المرتبطة بها إلى PNS. وفي نهاية المطاف، يمكن أن تكون أداة فعالة من حيث التكلفة في مجال تطوير العقاقير.
Introduction
تصف هذه الدراسة نموذج تلقيح الاقدام للتحقيق في تكرار وانتشار الفيروسات من PNS إلى CNS والاستجابات العصبية المرتبطة بها. وقد استخدم نموذج التطعيم في الاقدام بشكل مكثف لدراسة عدوى فيروس ألفا هيب في الخلايا العصبية1,2,3. والهدف الرئيسي لهذا النموذج هو السماح للفيروسات العصبية قطع مسافة قصوى من خلال الـ PNS قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي. هنا، يستخدم هذا النموذج للحصول على رؤى جديدة في تطوير اعتلال عصبي معين (حكة عصبية) في الفئران المصابة بفيروسات الإيدز (PRV).
PRV هو فيروس ألفاهرب مرتبط بالعديد من مسببات الأمراض المعروفة (أي الهربس البسيط النوع 1 و 2 [HSV1 و HSV2] وفيروسات الزوجة فاريتشيلا [VZV])، التي تسبب القروح الباردة، والآفات التناسلية، وجدري الماء، على التوالي4. هذه الفيروسات هي جميع pantropic وقادرة على إصابة العديد من أنواع الخلايا المختلفة دون إظهار تقارب لنوع أنسجة محددة. ومع ذلك ، فإنها تظهر جميعها عصبية مميزة من خلال غزو PNS (وأحيانا ، CNS) من الأنواع المضيفة. المضيف الطبيعي هو الخنزير ، ولكن PRV يمكن أن تصيب معظم الثدييات. في هذه المضيفين غير الطبيعية، PRV يصيب PNS ويحفز pruritus حاد يسمى "جنون حكة"، تليها الموت peracute5،6. دور استجابة المناعة العصبية في النتيجة السريرية والأمراض من العدوى PRV كان غير مفهومة بشكل جيد.
يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لـ PRV ببدء العدوى في خلايا البشرة في لوحة القدم. ثم، تنتشر العدوى في الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تعم البشرة والغدد العرقية والأدمة. العدوى ينتشر عن طريق جزيئات الفيروس تتحرك عبر العصب الوركي إلى DRG في غضون 60 ساعة تقريبا. تنتشر العدوى عبر الحبل الشوكي، وتصل في نهاية المطاف إلى الـ hindbrain عندما تصبح الحيوانات محتضرة (82 ساعة بعد العدوى). خلال هذه النافذة الزمنية، يمكن جمع عينات الأنسجة ومعالجتها وتحليلها من أجل تكرار الفيروسات وعلامات الاستجابة المناعية. على سبيل المثال، يمكن إجراء الفحص النسيجي وتكميم الحمل الفيروسي في أنسجة مختلفة لإنشاء ارتباط بين بدء وتطوير العمليات السريرية والفيروسية والعصبية في التسبب في الـ PRV.
باستخدام نموذج تلقيح لوحة القدمين ، يمكن التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية من pruritus الناجم عن PRV في الفئران. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يوفر هذا النموذج نظرة جديدة في بدء وتطوير العصبية الناجمة عن الفيروسات خلال التهابات فيروس الهربس. قد يؤدي فهم أفضل للعمليات الكامنة الكامنة في اضطرابات الأعصاب الناجمة عن فيروس ألفا هيريس إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. على سبيل المثال، هذا النموذج مفيد للتحقيق في آليات حكة الأعصاب في المرضى الذين يعانون من آفات ما بعد الهربس (على سبيل المثال، الهربس، القوباء المنطقية) واختبار الأهداف العلاجية الجديدة في الفئران للأمراض البشرية المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب الحيوانية وفقًا لبروتوكول (رقم 2083-16 و 2083-19) تم استعراضه واعتماده من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) بجامعة برينستون. وقد تم هذا العمل من خلال اتباع صارم متطلبات السلامة البيولوجية -2 (BSL-2)، التي لدينا مختبر مجهز بالكامل معتمد من قبل لجنة السلامة البيولوجية بجامعة برينستون. تم تنفيذ الإجراءات بما في ذلك كشط الماوس ، والتطعيم الفيروسي ، وتشريح الفئران ، وجمع الأنسجة في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) في غرفة مرفق الحيوانات في جامعة برينستون. أولئك الذين يؤدون العملية ارتدوا العباءات القابلة للتخلص، غطاء الرأس، حماية العين، القفازات المعقمة، الأقنعة الجراحية، وأغطية الأحذية.
1. ماوس footpad كشط
- تخدير ماوس C57BL/6 (5-7 أسابيع) مع مخدر غاز الأيزوفلوران، الذي يتم تسليمه بجرعات 3% عن طريق نظام تخدير صغير (غرفة).
- ضع الفأر في الطائرة الجراحية للتخدير على ظهره ، قبل التطعيم ، في لوحة القدم الخلفية. إرفاق مخروط الأنف مع الحجاب الحاجز (شق الحجم بما فيه الكفاية لتناسب كمامة الحيوان) إلى الماوس وتقديم مخدر غاز isoflurane في جرعة ثابتة من 1.5٪ - 2.0٪.
- مراقبة الماوس عن كثب للاستجابة للمحفزات المؤلمة التي أنشأتها معسر قوية من إصبع قدمه مع ملقط.
- فهم طفيفة واحدة القدم الخلفية مع ملقط مسطحة.
- بلطف abrade الجلد glabrous من القدم الخلفية ما يقرب من 20x، بين كعب ومنصات المشي، مع لوحة emery (100-180 حصى). لا تحفز النزيف عن طريق التآكل في كثير من الأحيان أو تطبيق الكثير من الضغط.
- باستخدام ملقط غرامة، قشر ببطء قبالة القرنية الطبقة فصلها عن طريق الكشط لفضح الطبقة basale.
2. تطعيم الاقدام PRV
- إعداد الفيروس inoculum المخفف إلى titer المطلوب في وسائل الاعلام DMEM التي تحتوي على 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين (جدول المواد).
- قم بتكليس عدد وحدات تشكيل البلاك (PFU) في مخزون الفيروس على خلايا PK15 لحساب الجرعة الفيروسية وتوحيدها وتمييع التلقين الفيروسي وفقًا لذلك.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام سلالة خبيثة من PRV (PRV-بيكر) بجرعة 8 × 106 PFU. تم تحسين هذه الجرعة في تجربة أولية سابقة لضمان أن جميع الحيوانات المحقح أظهرت الأعراض السريرية في 82 ساعة بعد التلقيح (hpi). - الحفاظ على الفيروس inoculum على الجليد ومزيج بلطف قبل الاستخدام.
- قم بتكليس عدد وحدات تشكيل البلاك (PFU) في مخزون الفيروس على خلايا PK15 لحساب الجرعة الفيروسية وتوحيدها وتمييع التلقين الفيروسي وفقًا لذلك.
- إضافة 20 ميكرولتر قطرات من inoculum الفيروس (8 × 106 PFU) على البادباد (الإدارة الموضعية). تنفيذ التطعيمات الوهمية (متوسطة فقط) في موازاة ذلك.
- فرك بلطف 10x مع رمح إبرة لتسهيل الامتزاز من الفيروس. تجنب الخدش مع نقطة إبرة. كرر هذه الخطوة كل 10 دقيقة.
- إبقاء الماوس تحت التخدير لمدة 30 دقيقة حتى مهبط القدم الجافة.
- بعد إيقاف التخدير، مراقبة الماوس حتى يمكن الحفاظ على حفّر الصدر ووضعها في قفص فردي للمتابعة السريرية وأخذ العينات.
3. تشريح الماوس وجمع الأنسجة
- في الأوقات المناسبة بعد العدوى، euthanize الماوس عن طريق طريقة الاختناق (CO2).
ملاحظة: في هذه الدراسة، نقطة النهاية الإنسانية (عندما تبدأ الحيوانات في إظهار أعراض المحطة الطرفية) للفئران المصابة PRV-Becker هو 82 حصان. القتل الرحيم السيطرة على الحيوانات في موازاة ذلك. - ضع الجانب البطني للماوس الذي يواجه على حصيرة جراحية باستخدام الإبر / الدبابيس. تأمين أطراف الماوس مع دبابيس إلى لوحة رغوة الجراحية. الرطب الجانب البطني من الماوس مع 70٪ الإيثانول للحد من تلوث الفراء.
- قرصة الطبقة الخارجية من الفراء والجلد باستخدام ملقط وجعل شق أولي صغير باستخدام مقص غرامة بالقرب من فتح مجرى البول.
- من هذا الافتتاح، مواصلة شق على الجانب البطني منتصف حتى الذقن.
- تمديد شقين الجانبية نحو الأطراف من الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية.
- افصل الجلد عن الطبقة العضلية الأساسية واغلقه إلى الجانب.
- افتح تجويف البطن و اِن تحُزّر إلى قاعدة الصدر. استكمال فتح تجويف البطن عن طريق إجراء شقين مستعرضين.
- افتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز والأضلاع على الجانبين الجانبيين.
ملاحظة: قطع جانبي القفص الصدري يمنع خطر قطع القلب. - اجمع الأعضاء المكشوفة، بما في ذلك القلب والرئتين والطحال والبنكرياس والكبد والكلى والمثانة في أنابيب ميكروبلتي 1.5 مل. إبقاء الأنابيب على الجليد.
- قطع لوح القدم المشطب بين كعب ومنصات المشي ووضع قطعة من الأنسجة في أنبوب كما هو موضح في الخطوة 3.3.6.
- وضع الجانب الظهري الماوس حتى والرطب الفراء مع 70٪ الإيثانول. خفض طبقة الجلد لفضح العمود الفقري.
- إجراء شق صغير في منطقة الحوض. اخلع الجلد من الأطراف الخلفية باتجاه الرأس.
- إزالة الساقين والذراعين عن طريق قطع مع مقص بالتوازي مع وقريبة من العمود الفقري على كلا الجانبين.
- قطع الرأس في قاعدة الجمجمة (C1 - C2 المستوى).
- قطع فتح الجمجمة مع مقص من ماغنوم ماغنوم من التجويف إلى العظام الأمامية.
- سحب فتح الجمجمة في الاتجاهات الجانبي باستخدام ملقط.
- استخرج بلطف من الدماغ باستخدام ملقط والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة 3.3.6.
- تنظيف العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والدهون والأنسجة الرخوة باستخدام مقص المنحني. اقطعي ذيلك ضع العمود الفقري السليم في أنبوب 15 مل يحتوي على محلول ملحي معقم من الجليد البارد (PBS). الحفاظ على أنابيب على الجليد حتى تشريح مزيد من الحبل الشوكي وDG.
4. الحبل الشوكي واستخراج DRG
ملاحظة: استخراج الحبل الشوكي وDDG من العمود الفقرات مباشرة بعد تشريح الماوس. بروتوكول الحبل الشوكي واستخراج DRG تم تكييفها من منشور سابق7.
- إزالة العمود الفقرات من أنبوب PBS الجليد الباردة وإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية، والتي تصبح أسهل بعد التبريد.
- إجراء ثلاثة قطع عرضية في العمود من خلال الفقرات (T1، L1، و S2 المستويات) باستخدام شفرة حلاقة. ضع القطع الثلاث في طبق بيتري 15 ملم يحتوي على PBS الجليد البارد العقيم. تتبع وتحديد أصل الشرائح لتحليل لاحق.
- اتخاذ شريحة واحدة وتأمينه بين ملقط، الجانب الظهري تواجه. جعل واحد، وقطع طولية أسفل من خلال خط الوسط باستخدام شفرة الحلاقة، وتقسيم العمود إلى نصفين متساويين.
- ضع كلا النصفين في طبق بيتري جديد يحتوي على PBS الجليد الباردة العقيمة الجديدة. تأكد من التوجه الصحيح للشريحة لتكون قادرة على التمييز بين الجانبين الأيمن والأيسر.
- تحت مجهر تشريح، قشر بلطف الحبل الشوكي من العمود الفقرات من كل نصف في اتجاه روسترالي إلى السد باستخدام ملقط غرامة.
- جمع كل من نصفي الحبل الشوكي في 1.5 مل microtube التي تحتوي على 500 μL من الثلج الباردة العقيمة PBS. إبقاء الأنابيب على الجليد.
- قم بإزالة السحايا بلطف من جانب واحد من العمود الفقري إلى الجانب الآخر لفضح DRG.
- ازل كل DRG بشكل فردي عن طريق استيعاب العصب الشوكي المكشوف وسحبه بلطف من العمود الفقري. ضع DRG الذي تم جمعه في طبق بيتري عيار 15 مم يحتوي على PBS بارد بالثلج. حصاد كل دراغ ipsilateral و contralateral بشكل منفصل عن الجزء العمود الفقري والمضي قدما على النحو المبين في الخطوة 4.5.
ملاحظة: يمكن رؤية DRG كهيكل شفاف مستدير على طول العصب الشوكي الأبيض. - كرر الخطوات 4.3-4.7 باستخدام مقطعي العمود الفقري الآخرين خلال 30-45 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب بسرعة عالية (17900 × ز)لمدة 3 دقائق في 4 °C.
- أنابيب التعرق وفلاش تجميد في النيتروجين السائل. تخزين أنابيب في -80 درجة مئوية لمزيد من التجانس الأنسجة.
- بدلا من ذلك، إصلاح وقسم DRG تنظيفها وغيرها من أنسجة الماوس للتحليلات الهستوباتية و / أو تلطيخ المناعة بعد الخطوة 4.9.
5. تجانس الأنسجة
- اذيب الأنابيب التي تحتوي على عينات من الأنسجة المجمدة على الجليد.
- تزن 100 ملغ من الأنسجة ووضعها في أنبوب 2 مل microcentrifuge التي تحتوي على حبة الصلب المعقم و 500 ميكرولتر من العازلة RIPA التي تحتوي على 0.5 M EDTA (pH = 8.0)، 1 M تريس-HCl (pH = 8.0)، 5 M NaCl، 10٪ SDS، وأقراص حبوب منع الكوكتيلات protease.
- تعطيل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام التجانس في 20 دورة / ث لمدة 2 دقيقة، تليها فترة انتظار 1 دقيقة، ثم 20 دورة / ث لمدة 2 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب بسرعة عالية (17900 س ز)لمدة 10 دقيقة في RT.
- جمع مُتفَرّع (500 ميكرولتر) في أنبوب جديد وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى أداء ELISA و qPCR لتحديد العلامات الالتهابية والأحمال الفيروسية، على التوالي.
ملاحظة: بالنسبة لـ qPCR، جمع جميع العينات مع RNase خالية من المواد (أي، الخرز، والأنابيب، الخ) وتعطيل الأنسجة مع تحلل الحمض النووي الريبي العازلة التي تحتوي على 1٪ بيتاميركوتويثينول(جدول المواد).
6. إعداد وتلطيخ المناعة من أقسام DRG المجمدة
- معالجة الأنسجة
- إصلاح DRG تشريح وتنظيفها في 1٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 2 ساعة في RT.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع السكروز 10٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع 20٪ السكروز في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
- نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
- تضمين الأنسجة في أكتوبر باستخدام cryomold ووضع كتل في الجليد الجاف لتجميد سريع.
- تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد التكريات
- إزالة كتلة المجمدة من -80 درجة مئوية والسماح لها لتكرير في درجة حرارة غرفة التبريد لمدة 30 دقيقة.
- قم بالتبريد في DRG بسمك 15 ميكرومتر ثم قم بتحميل الأقسام على الشرائح.
- استخدم قلمًا لرسم دائرة مُهدَّبة حول النسيج المُثبَت بالشريحة.
- حافظ على الشرائح عند 4 درجة مئوية حتى تلطخ.
- صبغ المناعة
- غسل أقسام DRG 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
- احتضان المقاطع مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الماوس ضد PRV الجليكوبروتين B) ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية. تخفيف الجسم المضاد الرئيسي في PBS التي تحتوي على مصل الماعز السلبي بنسبة 10٪.
- كرر الخطوة 6.3.1.
- احتضان المقاطع مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المطلوبة (الماعز المضادة للفأر اليكسا فلور 488) لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني فقط.
- إضافة 100 ميكرولتر من DAPI (4′، 6-diamidino-2-فينيليندول) صبغة مخففة في برنامج تلفزيوني على القسم. مزيد من عينات احتضان 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوة 6.3.1.
- قم بتركيب العينات باستخدام الفلوريسنس المتصاعد المتوسط على الشرائح الزجاجية وتأمين وتغطية مع غطاء.
7. إعداد وH & E تلطيخ من أقسام الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ
- إصلاح الأنسجة في 10٪ formalin لمدة 24 ساعة في 4 °C.
- تنفيذ جدول المعالجة القياسية لالبارافين تضمين والقطع من الأنسجة الثابتة. نقل الأنسجة الثابتة إلى 70٪ الإيثانول وعملية من خلال ترقية الكحول إلى الزيلين تليها البارافين، كما سبق وصفه8.
ملاحظة: استخدم الإسفنج البوليستر للحفاظ على عينات الأنسجة الصغيرة مثل DRG داخل الكاسيتات. - تنفيذ إزالة الزعنفة القياسية تليها H & E تلطيخ من أقسام الأنسجة، كما سبق وصفها9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج تطعيم القدم الماوس يسمح لتوصيف من التسبب في التكاثر المناعي لعدوى فيروس ألفاهرب في الجسم الحي، بما في ذلك النسخ المتماثل وانتشار العدوى من مهبط القدم المحق إلى الجهاز العصبي وتحريض استجابات عصبية محددة.
في هذه الدراسة ، ونحن أولا abraded القدم الخلفية الماوس وإما وهمية تلقيح أو تلقيح المنطقة مع سلالة خبيثة من PRV بيكر( PRV-بيكر). كان موقع التآكل مرئيًا في لوحة التحكم. تم تشكيل قشرة في موقع التآكل كجزء من عملية الشفاء (الشكل 1، السهم الأسود). في المقابل، أظهرت الفئران تلقيح مع PRV التهاب شديد في نقطة النهاية الإنسانية (82 إتش بي)، التي تتميز بتورم في لوحة القدم واحمرار.
بعد تلقيح لوحة القدم مع سلالة PRV-Becker الخبيثة ، بدأت الفئران تظهر علامات سريرية عند 72 حصانًا ، تتميز بتورم مهبط القدم الملقح والهزات المتكررة بشكل متزايد. من قبل 82 حصاني، أظهرت الفئران المصابة PRV-بيكر هزات مستمرة في الساق تلقيح وأعراض PRV مميزة، بما في ذلك الخدش الشديد والعض من القدم. ولوحظ أيضا التهاب شديد في مهبط القدمين. ثم تم وصف الاستجابة الالتهابية التي تم الحث عليها أثناء عدوى PRV بشكل أكبر ، بما في ذلك تسلل الخلايا المناعية إلى الأنسجة.
تم إجراء فحص الأنسجة النسيجية للعديد من الأنسجة، بما في ذلك لوحة القدم المحقّدة وDDG، متبوعة بتلوين H&E من أقسام الأنسجة المضمّنة من البارافين. وقد لوحظ نخر البشرة والتهاب الجلد الحاد (وذمة و fibrin) في أقسام القدم المصابة PRV(الشكل 2A، لوحة ب). أظهرت البشرة والأدمة والأنسجة الضامة للفئران المصابة تسللًا هائلًا من العدلات (التي تم تحديدها من قبل النوى المتعددة الفصوص) التي تحمل سهامًا سوداء. كانت لوحات الماوس من فئران التحكم طبيعية(الشكل 2A، لوحة a). أظهر DRG المصاب بـ PRV الحد الأدنى من نخر الخلايا العصبية والالتهاب المختلط في الفئران المصابة في حين أن DRG من الفئران التحكم كانت طبيعية(الشكل 2B ، لوحات a و b). التهاب مختلط تتسلل تتكون أساسا من العدلات والخلايا اللمفاوية.
بعد ذلك ، تم تأسيس حركيات إنتاج السيتوكين الالتهابي في أنسجة الفئران بعد تلقيح مهبط المشاط PRV. تم تحديد مستويات السيتوكينات الالتهابية المحددة كمياً (أي إنترلوكين-6 [IL-6] وعامل تحفيز القولون الحبيبي [G-CSF]) من عدة أنسجة تم جمعها وتجانسها من السيطرة وفئران مصابة بـ PRV. وأظهرت النتائج زيادة كبيرة في مستويات G-CSF في الباد وDG مقارنة بالضوابط في 7 إتش بي و 82 إتش آي(الشكل 3A). لوحظت مستويات كبيرة من G-CSF عند 82 حصان في الحبل الشوكي والدماغ والقلب وأنسجة الكبد من الفئران المصابة بـ PRV مقارنة بالضوابط. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن مستويات كبيرة IL-6 في جميع أنسجة الفئران المصابة PRV مقارنة مع الضوابط بدءا من 24 حصان(الشكل 3B).
واستُخدم نموذج تلقيح الاقدام كذلك في التحقيق في تكرار الـ PRV وانتشرت من لوحة المشاط المحقّلة إلى الـ PNS و CNS وإمكان الارتباطات مع تطور الاستجابة العصبية الفلورية. تم قياس كمية الأحمال PRV في العديد من الأنسجة المتجانسة بواسطة qPCR لتضخيم الحمض النووي PRV. ثم تم تحويل تركيز الحمض النووي إلى PFU، كما سبق وصفه10. تم الكشف عن أحمال PRV في الـ footpad ابتداءً من 24 حصاناً (~ 1 x10 4 PFU/mg من الأنسجة) وفي DRG تبدأ من 60 حصان (~ 1 x10 3 PFU/mg من الأنسجة؛ البيانات غير مبينة).
في حالة احتضار (82 إتش بي), تم الكشف عن PRV في الباد, DRG, الحبل الشوكي, والدماغ, مع أعلى تركيز من PRV في DRG (~ 1 x10 5 PFU/ ملغ من الأنسجة; الشكل 4). تم تأكيد عدوى PRV من DRG عن طريق صبغ الفلوروسين المناعي غير المباشر من عمليات التشريب DRG. تم الكشف عن عدوى PRV في الخلايا العصبية DRG باستخدام الأجسام المضادة PRV gB. PRV الجليكوبروتين gB وأعرب خلال المراحل المتأخرة من العدوى في السيتوبلازم من الخلايا المصابة. كما هو متوقع، تم تأكيد التعبير السيتوبلازمي لـ PRV gB (الأخضر) في DRG المصابة، في حين لم يتم التعبير عن gB في عينات التحكم (الشكل 5). تم تحديد نواة الخلية مع تلطيخ DAPI (الأزرق).
الشكل 1: صور تمثيلية للماوس الحق الكفوف الخلفية بعد التطعيم PRV. الفئران هي إما وهمية تلقيح أو تلقيح مع PRV في القدم الخلفية اليمنى معبّر. تظهر لوحة القدم الملقح PRV علامات الالتهاب، بما في ذلك الاحمرار والتورم عند نقطة النهاية الإنسانية (82 حصان). يبدو أن لوحة القدم الخاصة بفئران التحكم طبيعية مع قشرة حمراء داكنة في الموقع المتآكل ، مما يشير إلى أن الجرح يلتئم. الأسهم السوداء تشير إلى موقع التآكل. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج الهستوثولوجية في مهبط القدمين وDDG بعد تلقيح مهبط المشاة PRV. الهماتوسلين و eosin (H & E) تلطيخ من (A) الماوس ملقح footpads و (B) وIPSilateral DRG من السيطرة (لوحة أ) وPRV المصابة (لوحة ب) الفئران في 82 إتش آي. إن المظاهر الهسجية التي لوحظت في الأنسجة المصابة بـ PRV (نخر البشرة والخلايا العصبية وتسلل العدلات) غائبة عن جميع الفئران المصابة بالسخرية. النتائج هي ممثلة لثلاثة تكرارات بيولوجية لنوع معين من الأنسجة. الأسهم السوداء تشير إلى مناطق تمثيلية من التهاب مع تسلل الخلايا المناعية. يتم الإشارة إلى أشرطة المقياس (50 ميكرومتر) لكل صورة. وقد تم تعديل هذا الرقم من11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حركية إنتاج السيتوكين الالتهابي في أنسجة الماوس المتجانسة بعد تلقيح مرجل PRV. (أ)G-CSF و (B) IL-6 مستويات البروتين الكشف عن في PRV المصابة (الأحمر) والسيطرة (أسود) أنسجة الماوس المجانسة في مختلف hpi. يتم تحديد مستويات البروتين من قبل ELISA ويعبر عنها كما picogram (pg) لكل ملليغرام (ملغ) من الأنسجة المتجانسة (ن = 5 لكل مجموعة، *p < 0.05، ns = غير مهم). وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القياس الكمي لمجين PRV في الأنسجة المتجانسة بالماوس. يتم قياس الحمض النووي PRV في أنسجة الماوس المجانسة بواسطة qPCR باستخدام الزهية PRV UL54. يتم التعبير عن الأحمال PRV كما تشكيل البلاك وحدات (PFU) لكل ملغ من الأنسجة. يتم الكشف عن الحمض النووي PRV فقط في القدم، DRG، الحبل الشوكي، والدماغ (وليس في الأنسجة الأخرى)، ن = 10 لكل مجموعة. يعرض الخط المنقط حد الكشف. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم عدوى PRV في الخلايا العصبية DRG عن طريق تلطيخ الفلوروس. Confocal Z المكدس الصور من الخلايا العصبية DRG وهمية وPRV المصابة بعد stains immunofluorescence باستخدام جسم مضاد الماوس محددة لPRV gB (الأخضر). نواة الخلية ملطخة بDAPI (الأزرق، والألواح أ و ج). لوحة د يظهر العديد من الخلايا العصبية المصابة PRV التعبير عن gB (السهام البيضاء). لم يتم الكشف عن أي تعبير gB في أقسام DRG التحكم (لوحة b). يتم الإشارة إلى أشرطة المقياس (50 ميكرومتر) لكل صورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج تطعيم القدم الموصوف هنا مفيد للتحقيق في بدء وتطوير استجابات الوهن العصبي أثناء عدوى فيروس ألفاهرب. وعلاوة على ذلك، يستخدم هذا في نموذج الجسم الحي لتحديد الحركية من النسخ المتماثل وانتشار فيروس ألفاهرب من PNS إلى CNS. هذا هو بديل لنماذج التلقيح الأخرى، مثل نموذج تلقيح الجلد الجناح، الذي يعتمد على خدش الجلد العميق13،أو الطريق داخل الجمجمة، الذي يدخل الفيروس مباشرة في CNS14،15،16. ونتيجة لذلك، مع نموذج لوحة القدم، فمن الممكن الحصول على تقييم أكثر تفصيلا من الحركية الفيروسية من النسخ المتماثل وانتشار مع العمليات المناعية المحلية والبعيدة المرتبطة في الجهاز العصبي11،12.
في هذا البروتوكول ، كشط من الاقدام والتطعيم الفيروسية اللاحقة هي خطوات حاسمة. في الواقع ، يجب إزالة طبقة القرنية بالكامل بعد كشط كاف من أجل تعريض الطبقة القاعدية للتلقين الفيروسي للعدوى الناجحة. ومع ذلك ، يجب أن يكون التآكل لطيفًا ولا يحفز النزيف ، لأن هذا يساعد على منع الإصابة بال الدورة الدموية. يمكن تصور القرنية الطبقية المنفصلة بواسطة تلطيخ H&E تحت المجهر الخفيف. و corneocytes الموجودة في القرنية الطبقة هي مسطحة، والخلايا اليوزيني التي تفتقر إلى النوى. تم تحسين حجم inoculum الفيروسي (20 ميكرولتر قطرات) لضمان أن تبقى قطرات على لوحة القدم ويغطي موقع متآكل. فرك بلطف القطيرة inoculum على لوحة القدم المتآكلة أمر ضروري لاختراق الفيروسية كفاءة. من المستحسن الانتظار حتى يجف المهبط تماما لوقف التخدير ووضع الحيوان في قفص جديد. هذه الخطوة سوف تجنب الماوس من لعق inoculum الفيروسية قبالة لوحة القدم abraded. من المستحسن معالجة ثلاثة فئران كحد أقصى في وقت واحد ، وذلك باستخدام مخروط الأنف الذي تم تعيينه لتعرضهم للتخدير في وقت واحد.
أثناء إجراء تشريح الماوس ، من المهم إجراء تخفيضات موازية لعمود الفقرات ، مما يمنع تلف الحبل الشوكي وDG المرتبطة به. ويقترح أيضا لإزالة أكبر قدر من الدهون والعضلات والأنسجة الرخوة قدر الإمكان للحد من القطع العرضي في العمود الفقري وتسهيل قبضة أفضل على الجزء العمود مع ملقط قبل خفض خط الوسط.
ويوصى أيضاً بإجراء تخفيضات عرضية عبر عمود الفقرات بين الأقراص من أجل إنتاج شرائح أعمدة نظيفة والحد من خطر إتلاف أزواج DRG. يجب إزالة ال السحايا المحيطة بالحبل الشوكي وتغطية DRG بالكامل لتسهيل تحديد واستخراج DRG. وينبغي إزالة DRG بعناية من العمود الفقري دون ضرر من ملقط. من المهم أن تبقى DRG سليمة لH & E وصبغة الفلوروسين. التوقيت أمر بالغ الأهمية لكفاءة هذا في تجربة الجسم الحي، وينبغي إجراء تشريح الماوس واستخراج الحبل الشوكي / DRG على التوالي من أجل جمع الأنسجة الطازجة قدر الإمكان.
وقد تم تحسين طريقة تجانس الأنسجة الموصوفة هنا لضمان تعطيل فعال لعدد كبير من عينات الأنسجة heterogenous. ومن الأهمية بمكان توحيد كمية الأنسجة المستخدمة، مما يسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين نتائج ELISA و QPCR بين العينات. على سبيل المثال, ويقترح أن تزن 100 ملغ من الأنسجة لكل إجراء التجانس. يجب أن تكون كل عينة الأنسجة متجانسة في مجملها، وبقايا الطعام لا ينبغي أن تذاب التجميد. من المهم أن الأوتوكلاف حبات الصلب والملخرات قبل استخدامها لتجنب أي تلوث أثناء التجانس. حجم 500 ميكرولتر هو الأمثل لضمان التجانس الكامل لعينة الأنسجة 100 ملغ. من المهم ملاحظة أن هذا الحجم المحدود يسمح فقط بمعالجة ثلاث إلى أربع مجموعات ELISA لكل عينة.
باستخدام نموذج تلقيح لوحة القدم ، ثبت أن عدوى PRV في الفئران تحفز التهابًا حادًا ، يتميز بتسلل العدلات في لوحة القدم وDDG. كما تم اكتشاف تركيزات عالية من السيتوكينات الالتهابية G-CSF و IL-6 في العديد من الأنسجة المتجانسة باستخدام ELISA. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على ارتباط قوي بين الجينات PRV والتعبير البروتيني (بواسطة qPCR و IF تلطيخ) في DRG وإنتاج كل من السيتوكينات الموالية للالتهابات.
هذا النموذج هو مناسبة لمقارنة الحركية من الفيروسية النسخ المتماثل / انتشار فضلا عن الاستجابات العصبية بين مختلف التهابات الفيروس ألفاهريس. على سبيل المثال ، فيما يتعلق VZV ، تقييد خصوصية المضيف وعدم وجود مرض سريري قد حد من استخدام النماذج الحيوانية17. ولذلك، قد يمثل نموذج تطعيم PRV للماوس نموذجًا حيوانيًا جديدًا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المسؤولة عن pruritus الأعصاب في المرضى الذين يعانون من آفات ما بعد الهربس. استناداً إلى أوجه التشابه في العلامات السريرية، والأمراض، وجينومسيس بين VZV و PRV، ويعتقد أن هذا النموذج الماوس سيعزز فهم الإمراض VZV ويؤدي إلى التطورات في استراتيجيات علاجية مبتكرة.
وأخيراً، فإن النموذج سوف توجه البحوث على الاعتلالات العصبية الطرفية، مثل التصلب المتعدد والأضرار الناجمة عن الفيروسية المرتبطة بها إلى PNS18. يمكن أيضا دراسة التسبب في العديد من الفيروسات العصبية (أي فيروس داء الكلب، فيروس شلل الأطفال، فيروس غرب النيل، فيروس زيكا)، والتي من المعروف أن تصيب PNS، باستخدام هذا النموذج19،20،2121،22. ويمكن استخدام نموذج تلقيح الاقدام كأداة ممكنة فعالة من حيث التكلفة لتطوير المخدرات. على سبيل المثال، قد يكون بمثابة منصة لفحص واختبار فعالية الأدوية المضادة للالتهابات ومضادات الفيروسات المصممة لمنع الاعتلال العصبي المحيطي الناجم عن الفيروسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف تشارلز ريفر مختبرات لدعمها التقني الممتاز تنفيذ التحليلات الهستوبات. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (RO1 NS033506 و RO1 NS060699). ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو في اتخاذ قرار بنشرها، أو إعدادها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
