Summary
Den footpad vaccination model er et værdifuldt værktøj til at karakterisere viral-induceret neuroinflammatoriske reaktioner in vivo. Den giver især en klar vurdering af viral kinetik og tilhørende immunpatologiske processer, der er indledt i det perifere nervesystem.
Abstract
Denne protokol beskriver en footpad vaccination model, der anvendes til at studere indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion i mus. Som alphaherpesvirus er de vigtigste angribere af det perifere nervesystem (PNS), denne model er egnet til at karakterisere kinetik af viral replikation, dens spredning fra PNS til CNS, og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Den footpad vaccination model giver virus partikler til at sprede sig fra en primær infektion site i footpad epidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes via iskiasnerven til dorsale rod ganglier (DRG) og i sidste ende gennem rygmarven til hjernen. Her, en mus footpad er podet med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nært beslægtet med herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne model viser, at PRV-infektion inducerer alvorlig betændelse, karakteriseret ved neutrofil infiltration i footpad og DRG. Høje koncentrationer af inflammatoriske cytokiner påvises efterfølgende i homogeniserede væv ved ELISA. Desuden observeres en stærk korrelation mellem PRV-genet og proteinudtryk (via qPCR og IF farvning) i DRG og produktionen af proinflammatoriske cytokiner. Derfor, footpad vaccination model giver en bedre forståelse af de processer, der ligger til grund alfaherpesvirus-induceret neuropatier og kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. Desuden kan modellen guide forskning på perifere neuropatier, såsom multipel sklerose og tilhørende viral-induceret skade på PNS. I sidste ende kan det tjene som et omkostningseffektivt in vivo-værktøj til udvikling af lægemidler.
Introduction
Denne undersøgelse beskriver en footpad vaccination model til at undersøge replikation og spredning af virus fra PNS til CNS og tilhørende neuroinflammatoriske reaktioner. Fodplade-inokuleringsmodellen er blevet intensivt anvendt til at undersøge alfaherpesvirusinfektion i neuroner1,,2,3. Hovedformålet med denne model er at tillade neurotropiske vira til at rejse en maksimal afstand gennem PNS før de når CNS. Her, denne model bruges til at opnå nye indsigter i udviklingen af en bestemt neuropati (neuropatisk kløe) i mus inficeret med pseudorabies virus (PRV).
PRV er en alfaherpesvirus relateret til flere velkendte patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsager forkølelsessår, genitale læsioner og skoldkopper, henholdsvis4. Disse vira er alle pantropic og i stand til at inficere mange forskellige celletyper uden at vise affinitet for en bestemt vævstype. Men de udviser alle en karakteristisk neurotropisme ved at invadere PNS (og lejlighedsvis CNS) af værtsarter. Den naturlige vært er grisen, men PRV kan inficere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige værter, PRV inficerer PNS og inducerer en alvorlig kløe kaldet "gal kløe", efterfulgt af perakuute død5,6. Den neuroimmune responss rolle i det kliniske resultat og patogenesensens rolle er blevet dårligt forstået.
Den footpad vaccination model giver PRV at indlede infektion i epidermale celler i footpad. Derefter, infektionen breder sig til sensoriske og sympatiske nervefibre, innervate epidermis, sved kirtler, og dermis. Infektionen spredes ved viruspartikler bevæger sig via iskiasnerven til DRG inden for ca 60 h. Infektionen spredes gennem rygmarven, i sidste ende nå hindhjernen, når dyrene bliver døende (82 h post-infektion). I dette tidsrum kan vævsprøver indsamles, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponset. For eksempel kan histologisk undersøgelse og viral belastning kvantificering udføres i forskellige væv for at etablere sammenhænge mellem indledningen og udviklingen af kliniske, virologiske og neuroinflammatoriske processer i PRV patogenese.
Ved hjælp af fodblok-vaccinationsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismer i PRV-induceret kløe i mus undersøges. Desuden, denne model kan give ny indsigt i indledningen og udvikling af virus-induceret neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bedre forståelse af de processer, der ligger til grund for alfaherpesvirus-inducerede neuropatier, kan føre til udvikling af innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne model nyttig til at undersøge mekanismerne i neuropatisk kløe hos patienter med post-herpetiske læsioner (f.eks herpes zoster, helvedesild) og teste nye terapeutiske mål i mus for de tilsvarende sygdomme hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en protokol (nummer 2083-16 og 2083-19) gennemgået og godkendt af Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Princeton University. Dette arbejde blev udført ved nøje at følge biosikkerhed niveau-2 (BSL-2) krav, som vi har et fuldt udstyret laboratorium godkendt af Princeton University biosikkerhed udvalg. De procedurer, herunder mus footpad slid, viral inokulering, mus dissektion, og væv indsamling blev udført i en biologisk sikkerhed kabinet (BSC) i Princeton University biocontainment dyr facilitet værelse. Dem, der udfører proceduren bar engangskjoler, hovedbeklædning, øjenbeskyttelse, sterile handsker, kirurgiske masker, og sko dækker.
1. Mus footpad slid
- Anæser en C57BL/6 mus (5-7 uger gammel) med isofluran gasbedøvelse, leveret med en dosis på 3% via et lille anæstesisystem (kammer).
- Placer musen i det kirurgiske plan af anæstesi på ryggen, før podning, i baghjulet. Fastgør en næse kegle med en membran (en slids tilstrækkelig størrelse til at passe næsepartiet af dyret) til musen og levere isofluran gasbedøvelse ved en konstant dosis på 1,5%-2,0%.
- Nøje overvåge musen for en reaktion på smertefulde stimulus skabt af kraftig klemning af tåen med pincet.
- Tag let fat i den ene bagfpad med flade pincet.
- Forsigtigt slibe glabrous huden af bagfoden ca 20x, mellem hæl og gå puder, med en smaragd bord (100-180 grus). Fremkald ikke blødning ved at slibe for ofte eller lægge for meget tryk.
- Brug fine pincet, langsomt skalle stratum corneum løsrevet ved slid for at eksponere stratum basale.
2. PRV fodblok podning
- Virus inoculum fortyndet til den ønskede titer i DMEM-medier indeholdende 2% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (Tabel over Materialer).
- Kvantificer antallet af plakdannende enheder (PFU) i virusbestanden på PK15-celler for at beregne og standardisere virusdosis og fortynde den virale inoculum i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev virulente prv-stamme (PRV-Becker) anvendt ved en dosis på 8 x 106 PFU. Denne dosis blev optimeret i et tidligere indledende forsøg for at sikre, at alle podede dyr udviste kliniske symptomer ved 82 timer efter inokulering (hpi). - Hold virus inoculum på is og bland forsigtigt før brug.
- Kvantificer antallet af plakdannende enheder (PFU) i virusbestanden på PK15-celler for at beregne og standardisere virusdosis og fortynde den virale inoculum i overensstemmelse hermed.
- Tilsæt en 20 μL dråbe virusinoculum (8 x 106 PFU) på den afhønsede footpad (aktuel administration). Udfør mock vaccinationer (kun medium) parallelt.
- Gnid forsigtigt 10x med skaftet af en nål for at lette adsorption af virus. Undgå at ridse med nålepunktet. Gentag dette trin hver 10 min.
- Hold musen under bedøvelse i 30 minutter, indtil den forbranerede fodpude er tør.
- Efter standsning anæstesi, overvåge musen, indtil det kan opretholde sternal liggende hæftelighed og læg den i et individuelt bur for klinisk opfølgning og prøveudtagning.
3. Mus dissektion og væv indsamling
- På passende tidspunkter efter infektion, aflive musen ved kvælning metode (CO2).
BEMÆRK: I denne undersøgelse er det humane endepunkt (når dyr begynder at udvise terminale symptomer) for PRV-Becker-inficerede mus 82 hpi. Aflivet kontrol dyr parallelt. - Placer musen ventrale side vender op på en kirurgisk måtten ved hjælp af nåle / stifter. Fastgør lemmerne af musen med stifter til en kirurgisk skum bord. Våd den ventrale side af musen med 70% ethanol for at minimere pels forurening.
- Klem det eksterne lag af pels og hud ved hjælp af pincet og lav et lille indledende snit ved hjælp af fine sakse nær urethral åbning.
- Fra denne åbning, fortsætte snittet på midten ventrale side op til hagen.
- Udvid to laterale indsnit mod ekstremiteterne af forben og bagben.
- Adskil huden fra det underliggende muskulære lag og pin ned til siden.
- Åbn bughulen og incise op til bunden af brystkassen. Fuldføre åbningen af bughulen ved at gøre to tværgående indsnit.
- Åbn brysthulen ved at skære mellemgulvet og ribbenene på begge sidesider.
BEMÆRK: Hvis man skærer i siderne af brystkassen, forhindres der risiko for at skære i hjertet. - Saml eksponerede organer, herunder hjerte, lunger, milt, bugspytkirtel, lever, nyrer og blære i 1,5 ml mikrorør. Hold rørene på is.
- Skær den abraded footpad mellem hæl og gå puder og placere stykke væv i et rør som beskrevet i trin 3.3.6.
- Placer musen dorsal side op og våd pelsen med 70% ethanol. Skær ned hudlaget for at eksponere rygsøjlen.
- Lav et lille snit i området af bækkenet. Strip huden fra bagbenene mod hovedet.
- Fjern ben og arme ved at skære med en saks parallelt med og tæt på rygsøjlen på begge sider.
- Skær hovedet af i bunden af kraniet (C1-C2 niveau).
- Skær åbne kraniet med en saks fra foramen magnum til frontal knoglen.
- Træk åbne kraniet i laterale retninger ved hjælp af pincet.
- Forsigtigt øse ud hjernen ved hjælp af pincet og fortsætte som beskrevet i trin 3.3.6.
- Rengør rygsøjlen ved at skære muskler, fedt og blødt væv ved hjælp af buet saks. Skær halen over. Den intakte rygsøjle anbringes i et 15 ml rør indeholdende sterilt iskoldt fosfatbufferet saltvand (PBS). Opbevar rørene på is, indtil der er foretaget yderligere dissektion af rygmarven og DRG.
4. Rygmarv og DRG ekstraktion
BEMÆRK: Ekstrakt rygmarv og DRG fra ryghvirvler kolonnen direkte efter mus dissektion. Protokollen for rygmarvs- og DRG-ekstraktion er blevet tilpasset fra en tidligerepublikation 7.
- Fjern ryghvirvler kolonne fra iskolde PBS rør og fjerne resterende bløde væv, som bliver lettere efter nedkøling.
- Lav tre tværgående snit i kolonnen gennem ryghvirvlerne (T1, L1 og S2 niveauer) ved hjælp af et barberblad. De tre stykker anbringes i en 15 mm petriskål indeholdende steril iskold PBS. Hold styr på og markere segmenters oprindelse til senere analyse.
- Tag et segment og fastgør det mellem pincet, dorsale side opad. Lav en enkelt, langsgående skære ned gennem midterlinjen ved hjælp af et barberblad, opdele kolonnen i to lige store halvdele.
- Placer begge halvdele i en ny petriskål med ny steril iskold PBS. Sørg for, at segmentets korrekte retning kan skelne mellem venstre og højre side.
- Under en dissekere mikroskop, forsigtigt skræl rygmarven ud af ryghvirvler kolonne fra hver halvdel i en rostral til hale retning ved hjælp af fine pincet.
- Opsaml begge rygmarvshalvdele i 1,5 ml mikrorør indeholdende 500 μL sterilt iskold pbs. Hold rørene på is.
- Fjern forsigtigt meninges fra den ene side af rygsøjlen til den anden for at eksponere DRG.
- Fjern hver DRG individuelt ved at gribe den eksponerede spinal nerve og trække det forsigtigt ud af rygsøjlen. Den opsamlede DRG anbringes i en 15 mm petriskål indeholdende iskold PBS. Alle ipsilaterale og kontralaterale DRG'er skal høstes adskilt fra rygsøjlens segment og fortsættes som beskrevet i trin 4.5.
BEMÆRK: DRG er synlig som en rund gennemsigtig struktur langs den hvide spinalnerve. - Trin 4.3-4.7 gentages ved hjælp af de to andre segmenter for rygsøjlen inden for 30-45 min.
- Centrifuge alle rør ved høj hastighed (17.900 x g) i 3 min ved 4 °C.
- Aspirere supernatant og flash-fryse rør i flydende nitrogen. Rør opbevares ved -80 °C for yderligere vævshomogenisering.
- Alternativt fastgør og sektioner det rensede DRG og andet musevæv til histopatologiske analyser og/eller immunofluorescensfarvning efter trin 4.9.
5. Vævshomogenisering
- Tø rørene med frosne vævsprøver op på is.
- 100 mg væv vejes og anbringes i et 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende en steril stålperle og 500 μL RIPA-buffer indeholdende 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS og proteasecocktailhæmmertabletter.
- Indstyr væv ved stuetemperatur (RT) ved hjælp af en homogenisator ved 20 cyklusser/s i 2 min. efterfulgt af en 1 min ventetid, derefter 20 cyklusser/s i 2 min.
- Centrifuges røret ved høj hastighed (17.900 x g)i 10 min ved RT.
- Opsaml supernatant (500 μL) i et nyt rør, og opbevar det ved -20 °C, indtil elisa og qPCR udføres, for at kvantificere inflammatoriske markører og virusbelastninger.
BEMÆRK: For qPCR skal alle prøver indsamles med RNase-frit materiale (dvs. perler, rør osv.) og forstyrre væv med RNA lysisbuffer indeholdende 1% betamercaptoethanol (Tabel over Materialer).
6. Præparat og immunfluorescensfarvning af frosne DRG-sektioner
- Behandling af væv
- De dissekerede og rengjorte DRG i 1% paraformaldehyd (PFA) i 2 timer ved RT.
- Væv overføres til et 15 ml rør med 10% saccharose i PBS. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Væv overføres til et 15 ml rør med 20% saccharose i PBS. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Væv overføres til et 15 ml rør med 30% saccharose i PBS. Inkuber natten over ved 4 °C.
- Integrer væv i OLT ved hjælp af en cryomold og placere blokke i tøris til hurtig frysning.
- Prøverne opbevares ved -80 °C indtil brug.
- Forberedelse til krybning
- Den frosne blok fjernes fra -80 °C, og den skal være ligevægt i kryostatkammerets temperatur i 30 min.
- Kryosesektion DRG ved en tykkelse på 15 μm og montere sektionerne på dias.
- Brug en pen til at tegne en hydrofob cirkel omkring det slidemonterede væv.
- Diasene holdes ved 4 °C, indtil de er plettet.
- Immunofluorescence farvning
- Drg-afsnittene 3x vaskes i PBS i 10 minutter ved RT.
- Sektionerne inkuberes med 100 μL af det ønskede primære antistof (f.eks. museantistof mod PRV glycoprotein B) i 1 time ved 37 °C. Det primære antistof fortyndes i PBS, der indeholder 10% negativt gedeserum.
- Gentag trin 6.3.1.
- Sektionerne inkuberes med 100 μL af det ønskede sekundære antistof (gedeantimuse Alexa Fluor 488) i 50 min ved 37 °C. Fortynd kun sekundært antistof i PBS.
- Der tilsættes 100 μL DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) farvestof fortyndet i PBS på sektionen. Yderligere inkubere prøver 10 min ved 37 °C.
- Gentag trin 6.3.1.
- Prøverne monteres ved hjælp af et fluorescensmonteringsmedium på glasrutsjebaner og fastgøres og dækkes med dækslæbe.
7. Forberedelse og H&E farvning af paraffin-indlejrede vævssektioner
- Vævet fastgøres i 10% formalin i 24 timer ved 4 °C.
- Udfør standard behandlingsplan for paraffin indlejring og opdeling af faste væv. Overfør fast væv til 70% ethanol og proces gennem opgraderede alkoholer til xylen efterfulgt af paraffin, som tidligere beskrevet8.
BEMÆRK: Brug polyestersvampe til at holde små vævsprøver såsom DRG inde i kassetter. - Udfør standarddeparaffinisering efterfulgt af H&E farvning af vævssektioner, som tidligere beskrevet9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen footpad podning model giver mulighed for karakterisering af immunpatogenese af alphaherpesvirus infektion in vivo, herunder replikering og spredning af infektionen fra den podede footpad til nervesystemet og induktion af specifikke neuroinflammatoriske reaktioner.
I denne undersøgelse, vi først abraded musen bagfødslet og enten mock-podet eller podet den abraded region med en ondartet stamme af PRV (PRV-Becker). Stedet for slid var synlig i kontrol footpad. En skorpe blev dannet på slidstedet som en del af helingsprocessen (Figur 1, sort pil). I modsætning hertil viste mus podet med PRV alvorlig betændelse på humant endepunkt (82 hpi), karakteriseret ved hævelse af footpad og rødme.
Efter footpad vaccination med virulent PRV-Becker stamme, mus begyndte at vise kliniske tegn på 72 hpi, karakteriseret ved hævelse af den podede footpad og stadig hyppigere rystelser. Ved 82 hpi, PRV-Becker inficerede mus viste konstant rystelser i de podede ben og karakteristiske PRV symptomer, herunder intens ridser og bidende af foden. Svær betændelse blev også observeret i footpad. Den inflammatoriske respons induceret under PRV infektion blev derefter yderligere karakteriseret, herunder infiltration af immunceller i væv.
Histopatologisk undersøgelse af flere væv blev udført, herunder den podede footpad og DRG, efterfulgt af H & E farvning af paraffin-indlejrede væv sektioner. Epidermal nekrose og svær dermal inflammation (ødem og fibrin) blev observeret i PRV-inficerede fodsektioner (Figur 2A, panel b). Epidermis, dermis, og bindevæv af inficerede mus viste en massiv infiltration af neutrofiler (identificeret ved multilobed kerner) markeret med sorte pile. Footpads af kontrol mus var normale (Figur 2A, panel a). PRV-inficeret DRG viste minimal neuronal nekrose og blandet inflammation hos inficerede mus, mens DRG af kontrolmus var normale (Figur 2B, panel a og b). Den blandede inflammation infiltrere bestod hovedsageligt af neutrofiler og lymfocytter.
Næste, kinetik af inflammatorisk cytokin produktion i musevæv efter PRV footpad inokulering blev etableret. Niveauer af specifikke inflammatoriske cytokiner blev kvantificeret (dvs. interleukin-6 [IL-6] og granulocyt-koloni stimulerende faktor [G-CSF]) fra flere væv indsamlet og homogeniseret fra kontrol og PRV-inficerede mus. Resultaterne viste en betydelig stigning i G-CSF-niveauerne i fodblokken og DRG sammenlignet med kontroller ved 7 hpi og 82 hpi (figur 3A). Signifikant G-CSF niveauer blev observeret ved 82 hpi i rygmarven, hjernen, hjerte, og levervæv af PRV-inficerede mus i forhold til kontrol. Desuden blev der påvist signifikante IL-6-niveauer i alle væv af PRV-inficerede mus sammenlignet med kontroller, der startede ved 24 hpi (figur 3B).
Den footpad vaccination model blev yderligere brugt til at undersøge PRV replikation og spredes fra den podede footpad til PNS og CNS og potentielle korrelationer med neuroinflammatoriske respons udvikling. PRV-belastninger blev kvantificeret i flere homogeniserede væv ved qPCR for at forstærke PRV DNA. DNA-koncentration blev derefter konverteret til PFU, som tidligere beskrevet10. Prv-belastninger blev påvist i fodpuden fra 24 timer (~1 x 104 PFU/mg af væv) og i DRG startende ved 60 hpi (~1 x 103 PFU/mg væv; data ikke vist).
I en døende tilstand (82 hpi) blev PRV påvist i fodpuden, DRG, rygmarven og hjernen med den højeste koncentration af PRV i DRG (~1 x 105 PFU/mg væv; Figur 4). PRV-infektion med DRG blev bekræftet ved indirekte immunfluorescensfarvning af DRG-kryosektioner. PRV-infektion blev påvist i DRG-neuroner ved hjælp af anti-PRV gB antistof. PRV glycoprotein gB blev udtrykt i sene stadier af infektion i cytoplasmaet af inficerede celler. Som forventet blev det cytoplasmatiske udtryk for PRV gB (grøn) bekræftet i inficeret DRG, mens der ikke blev udtrykt gB i kontrolprøver (figur 5). Cellekerner blev identificeret med DAPI farvning (blå).
Figur 1: Repræsentative billeder af musen højre bagpoter efter PRV inokulering. Mus er enten mock-inokuleret eller podet med PRV i den abraded højre bagfodpad. PRV-podet footpad viser tegn på betændelse, herunder rødme og hævelse ved humant endepunkt (82 hpi). Footpad af kontrol mus synes normal med en mørk rød skorpe på abraded stedet, hvilket indikerer, at såret er healing. Sorte pile angiver slidstedet. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Histopatologiske fund i footpad og DRG efter PRV-fodblokodiokulering. Hematoxylin og eosin (H&E) farvning af (A) museokulerede fodpuder og (B) og ipsilateral DRG fra kontrol (panel a) og PRV-inficerede (panel b) mus ved 82 hpi. Histopatologiske manifestationer observeret i PRV-inficeret væv (epidermal og neuronal nekrose og neutrofil infiltration) er fraværende fra alle undersøgte mock-inficerede mus. Resultaterne er repræsentative for tre biologiske replikater for en given type væv. Sorte pile indikerer repræsentative områder af betændelse med immuncelleinfiltration. Vægtsøjler (50 μm) er angivet for hvert billede. Dette tal er blevet ændret fra11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kinetik af inflammatorisk cytokinproduktion i homogeniseret musevæv efter PRV-fodblokokulering. (A) G-CSF og (B) IL-6 proteinniveauer påvist i PRV-inficerede (rød) og kontrol (sort) mus homogeniseret væv på forskellige hpi. Proteinniveauer kvantificeres ved ELISA og udtrykkes som picogram (pg) pr. milligram (mg) af homogeniseret væv (n = 5 pr. gruppe, *p < 0,05, ns = ikke signifikant). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering af PRV-genom i musehomogeniseret væv. PRV DNA kvantificeres i homogeniseret musevæv ved qPCR ved hjælp af PRV UL54 primere. PRV-belastninger udtrykkes som plaquedannende enheder (PFU) pr. mg væv. PRV DNA påvises kun i foden, DRG, rygmarven, og hjernen (og ikke i andre væv), n = 10 per gruppe. Stiplet linje viser registreringsgrænsen. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Vurdering af PRV-infektion i DRG-neuroner ved immunfluorescensfarvning. Konfokale Z-stack billeder af mock- og PRV-inficerede DRG neuroner efter immunofluorescens farvning ved hjælp af en mus antistof er specifik for PRV gB (grøn). Cellekerner er plettet med DAPI (blå, paneler a og c). Panel d viser flere PRV-inficerede neuroner, der udtrykker gB (hvide pile). Der registreres ikke noget gB-udtryk i drg-sektionerne (panel b). Vægtsøjler (50 μm) er angivet for hvert billede. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den footpad vaccination model beskrevet her er nyttigt at undersøge indledningen og udviklingen af neuroinflammatoriske reaktioner under alphaherpesvirus infektion. Desuden er denne in vivo model bruges til at etablere kinetik af replikation og spredning af alphaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er en alternativ til andre vaccinationsmodeller, såsom flanke hud podning model, som bygger på dyb dermal ridser13, eller intrakraniel rute, som direkte indfører virus i CNS14,15,16. Som et resultat, med footpad model, er det muligt at opnå en mere detaljeret vurdering af viral kinetik af replikation og spredes med tilhørende lokale og fjerne immunopathological processer inervesystemet 11,12.
I denne protokol, slid af footpad og efterfølgende viral inokulering er afgørende skridt. Stratum corneum skal fjernes fuldstændigt efter tilstrækkelig slid for at eksponere stratum basale for viral inoculum for vellykket infektion. Slidstyrken skal dog være skånsom og ikke fremkalde blødning, da dette hjælper med at forhindre infektion i blodcirkulationen. Den fritliggende stratum corneum kan visualiseres ved H & E farvning under lys mikroskopi. De corneocytter til stede i stratum corneum er flade, eosinofile celler, der mangler kerner. Mængden af det virale inoculum (20 μL dråbe) er optimeret for at sikre, at dråben forbliver på fodpladen og dækker det forbranerede sted. Forsigtigt gnide inoculum dråben på den abraded footpad er afgørende for effektiv viral penetration. Det anbefales at vente, indtil fodpuden er helt tør for at stoppe anæstesi og placere dyret i et nyt bur. Dette trin vil undgå musen fra slikke den virale inoculum fra den abraded footpad. Det anbefales at behandle maksimalt tre mus på én gang, ved hjælp af en næse kegle, der er indstillet til at udsætte dem samtidigt for anæstesi.
Under udførelsen af musen dissektion, er det vigtigt at foretage nedskæringer parallelt med ryghvirvler kolonne, som forhindrer skader på rygmarven og tilhørende DRG. Det foreslås også at fjerne så meget fedt, muskel, og blødt væv som muligt for at reducere utilsigtet skæring i rygsøjlen og lette et bedre greb om kolonnen segment med pincet før skære ned midterlinjen.
Det anbefales også at udføre tværgående snit gennem ryghvirvler kolonne mellem diske for at producere renset kolonne segmenter og begrænse risikoen for at beskadige DRG par. De meninges omkring rygmarven og dækker DRG skal fjernes fuldstændigt for at lette identifikation og udvinding af DRG. DRG bør fjernes forsigtigt fra rygsøjlen uden skader fra pincet. Det er vigtigt, at DRG forbliver intakt for H&E og immunfluorescens farvning. Timing er afgørende for effektiviteten af dette in vivo-eksperiment, og musedissektion og rygmarv/DRG-ekstraktion bør udføres fortløbende for at indsamle væv, der er så friskt som muligt.
Den vævshomogeniseringsmetode, der er beskrevet her, er blevet optimeret for at sikre effektiv afbrydelse af et stort antal heterogene vævsprøver. Det er altafgørende at standardisere mængden af anvendt væv, hvilket giver mulighed for direkte sammenligning af ELISA- og qPCR-resultater mellem prøverne. For eksempel, Det foreslås at veje 100 mg væv for hver homogenisering procedure. Hver vævsprøve skal homogeniseres i sin helhed, og rester må ikke fryses op. Det er vigtigt at autoklave stålperler og pincet før brug for at undgå forurening under homogenisering. Et volumen på 500 μL er optimalt for at sikre fuldstændig homogenisering af en 100 mg vævsprøve. Det er vigtigt at bemærke, at denne begrænsede mængde kun tillader behandling af tre til fire ELISA-sæt pr. prøve.
Ved hjælp af footpad vaccination model, Det blev påvist, at PRV infektion i mus inducerer alvorlig betændelse, karakteriseret ved neutrofil infiltration i footpad og DRG. Høje koncentrationer af inflammatoriske cytokiner G-CSF og IL-6 blev også påvist i mange homogeniserede væv ved hjælp af ELISA. Desuden blev der fundet en stærk sammenhæng mellem PRV-genet og proteinudtryk (ved qPCR og IF-farvning) i DRG og produktionen af begge proinflammatoriske cytokiner.
Denne model er velegnet til at sammenligne kinetik af viral replikation / spredning samt neuroinflammatoriske reaktioner blandt forskellige alphaherpesvirus infektioner. Med hensyn til VZV har den begrænsede værtsspecifikke specificitet og mangel på klinisk sygdomf.eks. Derfor kan musen footpad PRV vaccination model repræsentere en ny dyremodel for studiet af de cellulære og molekylære mekanismer, der er ansvarlige for neuropatisk kløe hos patienter med post-herpetiske læsioner. Baseret på lighederne i kliniske tegn, patogenese, og genomer mellem VZV og PRV, menes det, at denne musemodel vil øge forståelsen af VZV patogenese og føre til udviklingen i innovative terapeutiske strategier.
Endelig, modellen vil guide forskning på perifere neuropatier, såsom multipel sklerose og tilhørende viral-induceret skade på PNS18. Patogenesen af flere neurotropiske vira (dvs. rabiesvirus, poliovirus, West Nile-virus, Zika-virus), som er kendt for at inficere PNS, kan også undersøges ved hjælp af denne model19,20,21,22. Fodplade-inokuleringsmodellen kan bruges som et muligt omkostningseffektivt værktøj til udvikling af lægemidler. For eksempel, Det kan tjene som en platform til at screene og teste effekten af anti-inflammatoriske og antivirale lægemidler designet til at forhindre viral-induceret perifere neuropatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Charles River laboratorier for deres fremragende teknisk støtte udfører histopatologi analyser. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
