Summary
Модель прививки стопы является ценным инструментом для характеристики вирусных индуцированных нейровоспалительных реакций в vivo. В частности, он обеспечивает четкую оценку вирусной кинетики и связанных с ней иммунопатологических процессов, инициированных в периферической нервной системе.
Abstract
Этот протокол описывает модель прививки, используемой для изучения инициации и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпепсвирусной инфекции у мышей. Поскольку альфагерпексвирусы являются основными захватчиками периферической нервной системы (PNS), эта модель подходит для характеристики кинетики вирусной репликации, ее распространения от PNS к ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы позволяет частицам вируса распространяться от первичного места инфекции в footpad эпидермис к сенсорным и симпатическим нервным волокнам, которые иннервировать эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется через седалищный нерв к спинной корневой ганглии (DRG) и в конечном итоге через спинной мозг к мозгу. Здесь, мышь footpad прививается с вирусом pseudorabies (PRV), альфагерпезвирус тесно связаны с вирусом простого герпеса (HSV) и вирус ветряной опоясывающий лишай (ВЗВ). Эта модель показывает, что PRV инфекция вызывает сильное воспаление, характеризуется инфильтрацией нейтрофила в подножку и DRG. Высокие концентрации воспалительных цитокинов впоследствии обнаруживаются в гомогенизированных тканях ELISA. Кроме того, наблюдается сильная корреляция между геном PRV и экспрессией белка (через qPCR и IF окрашивания) в DRG и производством провоспалительных цитокинов. Таким образом, модель прививки стопы обеспечивает лучшее понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, и может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Кроме того, модель может направлять исследования на периферических невропатий, таких как рассеянный склероз и связанные с ними вирусные индуцированных повреждений PNS. В конечном счете, он может служить экономически эффективным инструментом in vivo для разработки лекарств.
Introduction
Это исследование описывает модель прививки для исследования репликации и распространения вирусов от PNS до ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы интенсивно используется для изучения альфагерпейвирусной инфекции в нейронах1,,2,,3. Основная цель этой модели заключается в том, чтобы позволить нейротропных вирусов путешествовать максимальное расстояние через PNS до достижения ЦНС. Здесь эта модель используется для получения новых идей в развитии конкретной невропатии (нейропатический зуд) у мышей, инфицированных вирусом псевдораби (PRV).
PRV является альфагерпезвирус, связанный с несколькими известными патогенами (на самом деле, герпес симокс типа 1 и 2 "HSV1 и HSV2" и вирус ветряной опоясывающий лишая, которые вызывают герпес, половые язвы, и ветряная оспа, соответственно4. Эти вирусы все пантропные и в состоянии заразить много различных типов клеток, не показывая сродство к определенному типу ткани. Тем не менее, все они проявляют характерный нейротропизм, вторгаясь в PNS (а иногда и ЦНС) видов-хозяев. Естественным хозяином является свинья, но PRV может заразить большинство млекопитающих. В этих не-естественных хостов, PRV заражает PNS и вызывает тяжелые зуд называется "безумный зуд", а затем peracute смерти5,6. Роль нейроиммуна в клиническом исходе и патогенезе PRV инфекции было плохо изучено.
Модель прививки стопы позволяет PRV инициировать инфекцию в эпидермальных клетках стопы. Затем инфекция распространяется на сенсорные и симпатические нервные волокна, которые иннервирует эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется частицами вируса, движущимися через седалищный нерв к DRG в пределах приблизительно 60 ч. Инфекция распространяется через спинной мозг, в конечном счете, достигнув заднего мозга, когда животные становятся умирающими (82 ч после инфекции). В течение этого времени, образцы тканей могут быть собраны, обработаны и проанализированы для репликации вируса и маркеры иммунного ответа. Например, гистологическое обследование и количественная оценка вирусной нагрузки могут быть выполнены в различных тканях для установления корреляции между началом и развитием клинических, вирусологических и нейровоспалительных процессов в ВОЗ ПАТОГЕНеза PRV.
Используя модель прививки стопы, можно исследовать клеточные и молекулярные механизмы PRV-индуцированного зуда у мышей. Кроме того, эта модель может дать новое представление о начале и развитии вирус-индуцированной нейровоспламеняющиеся во время герпесвирусных инфекций. Более глубокое понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Например, эта модель полезна для исследования механизмов невропатического зуда у пациентов с пост-герпетическими поражениями (например, опоясывающим герпесом, черепицей) и тестирует новые терапевтические цели у мышей на соответствующие заболевания человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколом (номер 2083-16 и 2083-19), рассмотренным и одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Института (МАКУК) Принстонского университета. Эта работа была выполнена строго в соответствии с требованиями уровня биобезопасности-2 (BSL-2), к которым мы имеем полностью оборудованную лабораторию, одобренную комитетом по биобезопасности Принстонского университета. Процедуры, включая ссадину стопы мыши, вирусную прививку, вскрытие мыши и сбор тканей, были выполнены в кабинете биологической безопасности (BSC) в комнате объекта биоконтейнмента Принстонского университета. Лица, выполняющие процедуру, носили одноразовые платья, головной убор, защиту глаз, стерильные перчатки, хирургические маски и бахилы.
1. Мышь footpad ссадины
- Анестезия C57BL/6 мыши (5-7 недель) с изофлуран газ анестезии, поставляется в дозировке 3% через небольшую анестезию системы (камера).
- Поместите мышь в хирургическую плоскость анестезии на спине, до прививки, в заднюю подножку. Прикрепите носовой конус с диафрагмой (разрез достаточно размера, чтобы соответствовать морде животного) к мыши и доставить изофлуран газ анестетик при постоянной дозировке 1,5%-2,0%.
- Внимательно следите за мышью для ответа на болезненный стимул, созданный силовым щипать ног с щипцами.
- Слегка хватает одну заднюю футурк с плоскими щипцами.
- Аккуратно абрадыть glabrous кожи задней панели около 20x, между пяткой и ходьбе колодки, с эмери борту (100-180 песка). Не индуцировать кровотечение путем abrading слишком часто или применения слишком большого давления.
- Используя тонкие щипцы, медленно снимите сослойный роговица, отделенную от ссадины, чтобы разоблачить базалей слоя.
2. прививка для ног PRV
- Подготовка вируса инокулум разбавленной желаемого титера в DMEM средствмассовойинформации, содержащей 2% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин ( Таблица материалов ).
- Количество количества бляшек формирования единиц (PFU) в вирусных запасов на PK15 клеток для расчета и стандартизации вирусной дозы и разбавления вирусного инокула соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, вирулентный штамм PRV (PRV-Becker) был использован в дозе 8 х 106 PFU. Эта доза была оптимизирована в предыдущем предварительном эксперименте, чтобы убедиться, что все привитые животные показали клинические симптомы при 82 ч после прививки (hpi). - Держите вирус инокулум на льду и аккуратно перемешать перед использованием.
- Количество количества бляшек формирования единиц (PFU) в вирусных запасов на PK15 клеток для расчета и стандартизации вирусной дозы и разбавления вирусного инокула соответственно.
- Добавьте 20 капли вируса инокулум (8 х 106 ПФУ) на абрадированную подножку (местное введение). Проводите макет прививки (только средние) параллельно.
- Аккуратно руб 10x с валом иглы для облегчения адсорбции вируса. Избегайте царапин с точки иглы. Повторяйте этот шаг каждые 10 минут.
- Держите мышь под наркозом в течение 30 минут, пока абрадированный подножье не высохнет.
- После остановки анестезии, контролировать мышь, пока он не может поддерживать строгое лежание и поместить его в отдельную клетку для клинического наблюдения и отбора проб.
3. Вскрытие мышей и коллекция тканей
- В соответствующее время после заражения усыпить мышь методом удушья (CO2)..
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, гуманная конечная точка (когда животные начинают проявлять терминальные симптомы) для PRV-Becker инфицированных мышей составляет 82 л.с. Euthanize контроля животных параллельно. - Поместите мышь брюшной вентральной стороны вверх на хирургический коврик с помощью иглы / булавки. Защитите конечности мыши булавкой с булавками к хирургической пенной доске. Влажные брюшной стороны мыши с 70% этанола, чтобы свести к минимуму загрязнение меха.
- Pinch внешний слой меха и кожи с помощью щипцов и сделать небольшой первоначальный разрез с помощью тонких ножниц вблизи уретрального отверстия.
- С этого отверстия, продолжить разрез на средней вентральной стороне до подбородка.
- Расширьте два боковых разреза к конечностям передних конечностей и задних конечностей.
- Отделите кожу от лежащего мышечного слоя и прикрепите вниз к стороне.
- Откройте брюшную полость и процой до основания грудной клетки. Завершите открытие брюшной полости, сделав два поперечного разреза.
- Откройте грудную полость, разрезав диафрагму и ребра на обеих боковых сторонах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резка по бокам грудной клетки предотвращает риск разрезания сердца. - Собирайте открытые органы, включая сердце, легкие, селезенку, поджелудочную железу, печень, почки и мочевой пузырь в микротрубках 1,5 мл. Держите трубки на льду.
- Вырезать abraded footpad между пяткой и ходьбе колодки и поместите кусок ткани в трубку, как описано в шаге 3.3.6.
- Поместите мышь спинной стороне вверх и мокрый мех с 70% этанола. Вырезать слой кожи, чтобы разоблачить позвоночного столба.
- Сделайте небольшой разрез в области таза. Снимите кожу с задних конечностей к голове.
- Удалите ноги и руки, разрезая ножницами параллельно и близко к позвоночнику с обеих сторон.
- Отрежьте голову у основания черепа (уровень C1-C2).
- Отрежьте череп ножницами от форамен магнума до лобной кости.
- Вытяните череп в боковых направлениях с помощью щипцов.
- Аккуратно вычерпывать мозг с помощью щипцов и продолжить, как описано в шаге 3.3.6.
- Очистите позвоночник, разрезая мышцы, жир и мягкие ткани с помощью изогнутых ножниц. Отрежьте хвост. Поместите неповрежденный позвоночник в трубку 15 мЛ, содержащую стерильные ледяные фосфатно-буферизированные солевой раствор (PBS). Держите трубки на льду до дальнейшего вскрытия спинного мозга и DRG.
4. Спинной мозг и DRG извлечения
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките спинной мозг и DRG из позвонков столба непосредственно после вскрытия мыши. Протокол для извлечения спинного мозга и DRG был адаптирован из предыдущей публикации7.
- Удалите столб позвонков из холодной трубки PBS и удалите оставшиеся мягкие ткани, что становится легче после охлаждения.
- Сделайте три поперечных разреза в колонне через позвонки (уровни T1, L1 и S2) с помощью лезвия бритвы. Поместите три части в 15 мм Петри блюдо, содержащее стерильные ледяной PBS. Следите за происхождением сегментов и отметьте их для последующего анализа.
- Возьмите один сегмент и закрепите его между щипцами, спинной стороной вверх. Сделать один, продольный вырезать через средней линии с помощью лезвия бритвы, разделив колонку на две равные половинки.
- Поместите обе половинки в новую чашку Петри, содержащую новые стерильные ледяные PBS. Обеспечьте правильную ориентацию сегмента, чтобы иметь возможность различать левую и правую стороны.
- Под рассекающим микроскопом аккуратно снимите спинной мозг из колонны позвонков от каждой половины в ростовском направлении до хвостового направления с помощью тонких щипцов.
- Соберите обе половинки спинного мозга в микротрубки 1,5 мл, содержащие 500 мл стерильных ледяных х/л PBS. Держите трубки на льду.
- Аккуратно удалите очинки с одной стороны позвоночника на другую, чтобы разоблачить DRG.
- Удалите каждый DRG индивидуально, схватив открытый спинномозговой нерв и вытяните его осторожно из позвоночника. Поместите собранный DRG в 15-мм чашку Петри, содержащую ледяной PBS. Урожай все ipsilateral и контралатеральных DRG отдельно от спинного сегмента колонки и приступить, как описано в шаге 4.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: DRG виден как круглая прозрачная структура вдоль белого спинного нерва. - Повторите шаги 4.3-4.7, используя два других сегмента позвоночника в течение 30-45 мин.
- Центрифуга все трубки на высокой скорости (17900 х г) в течение 3 мин при 4 градусов по Цельсию.
- Аспирировать супернатант и флэш-заморозки труб в жидком азоте. Храните трубки при -80 градусов по Цельсию для дальнейшей гомогенизации тканей.
- Кроме того, исправить и раздел очищены DRG и других тканей мыши для гистопатологических анализов и / или иммунофлуоресценции окрашивания после шага 4.9.
5. Гомогенизация тканей
- Оттепель труб, содержащих замороженные образцы тканей на льду.
- Взвесьте 100 мг ткани и поместите ее в 2 мл микроцентрифуги трубку, содержащую стерильную стальную бусинку и 500 мл буфера RIPA, содержащего 0,5 М EDTA (рН 8,0), 1 M Tris-HCl (рН 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS и ингибиторы протеазы.
- Нарушить ткани при комнатной температуре (RT) с помощью гомогенизатора при 20 циклов / с в течение 2 мин, а затем 1 мин период ожидания, то 20 циклов / с в течение 2 мин.
- Центрифуга трубки на высокой скорости (17900 х г) в течение 10 минут на RT.
- Соберите супернатант (500 мл) в новой трубке и храните его при -20 градусов по Цельсию до выполнения ELISA и qPCR для количественной оценки воспалительных маркеров и вирусных нагрузок, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для qPCR, собрать все образцы с RNase-бесплатно материала (т.е., бисер, трубки и т.д.) и нарушить ткани с RNA лизис буфер, содержащий 1% бетамеркаптоэтанола(Таблица материалов).
6. Подготовка и иммунофлуоресценция окрашивания замороженных секций DRG
- Обработка тканей
- Исправить расчлененные и очищенные DRG в 1% параформальдегида (PFA) для 2 ч на RT.
- Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 10% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 20% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 30% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Встраивайте ткани в OCT с помощью криомолда и размещайте блоки в сухом льду для быстрого замораживания.
- Храните образцы при -80 градусов по Цельсию до использования.
- Криозекционная подготовка
- Снимите замороженный блок с -80 градусов по Цельсию и дайте ему уравнять температуру криостатной камеры в течение 30 мин.
- Криоэнекция DRG толщиной 15 мкм и смонтировать разделы на слайды.
- Используйте ручку, чтобы нарисовать гидрофобный круг вокруг слайд-монтажной ткани.
- Держите слайды на уровне 4 градусов по Цельсию до окрашивания.
- Окрашивание иммунофлуоресценции
- Вымойте разделы DRG 3x в PBS в течение 10 минут на RT.
- Инкубировать разделы с 100 мл желаемого первичного антитела (например, антитела мыши против PRV гликопротеина В) в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию. Разбавить первичное антитело в PBS, содержащее 10% отрицательную козью сыворотку.
- Повторите шаг 6.3.1.
- Инкубировать разделы с 100 мл желаемого вторичного антитела (коза анти-мышь Alexa Fluor 488) в течение 50 мин при 37 градусов по Цельсию. Разбавить вторичные антитела только в PBS.
- Добавьте на секцию краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Дальнейшие инкубировать образцы 10 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Повторите шаг 6.3.1.
- Установите образцы с помощью флуоресценции монтажа среды на стеклянные горки и безопасной и крышкой с крышкой.
7. Подготовка и Окрашивание фрагментов ткани, встроенных в парафин
- Закрените ткань 10% формалином на 24 ч при 4 градусах Цельсия.
- Выполните стандартный график обработки парафина для встраивания парафина и секционого сечения фиксированных тканей. Передача фиксированных тканей на 70% этанола и процесс через модернизированные спирты до ксилена следуют парафин, как описано ранее8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полиэфирные губки, чтобы держать небольшие образцы тканей, такие как DRG внутри кассет. - Выполните стандартную депараффинизацию с последующим окрашивание секций тканей, как описано ранее9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель прививки стопы мыши позволяет олицеделять иммунопатогенез альфагерпезвирусной инфекции in vivo, включая репликацию и распространение инфекции от привитой стопы к нервной системе и индукции специфических нейровоспалительных реакций.
В этом исследовании, мы сначала abraded мыши задней ноге и либо макет-прививки или прививки abraded области с вирулентным штаммом PRV (PRV-Becker). Место ссадины было видно в панели управления. Корка образовалась на месте ссадины в рамках процесса заживления(рисунок 1,черная стрелка). В отличие от этого, мыши, привитые PRV показали сильное воспаление в гуманной конечной точке (82 л.с.), характеризующейся отеком подножки и покраснением.
После прививки стопы с вирулентным штаммом PRV-Becker, мыши начали проявлять клинические признаки при 72 л.с., характеризующихся отеком привитой подножки и все более частыми толчками. К 82 л.с., PRV-Becker инфицированных мышей показали постоянные толчки в привитой ноге и отличительные симптомы PRV, в том числе интенсивные царапины и кусаться стопы. Тяжелое воспаление наблюдалось также в ноге. Воспалительные реакции, индуцированные во время PRV инфекции затем далее характеризуется, в том числе проникновение иммунных клеток в ткани.
Гистопатологическое обследование нескольких тканей было проведено, в том числе привитые подножки и DRG, а затем Н И Е окрашивание парафин-встроенных секций ткани. Эпидермальный некроз и тяжелое дермальное воспаление (отек и фибрин) наблюдались в инфицированных PRV секциях стопы(рисунок 2А, панель b). Эпидермис, дермы и соединительной ткани инфицированных мышей показали массовое проникновение нейтрофилов (идентифицированных многолоевыми ядрами), отмеченных черными стрелками. Footpads контроля мышей были нормальными (Рисунок 2А, панель). PRV-инфицированных DRG показали минимальный нейрональный некроз и смешанное воспаление у инфицированных мышей в то время как DRG контроля мышей были нормальными(Рисунок 2B, панели и б). Смешанное воспаление проникало в основном из нейтрофилов и лимфоцитов.
Далее была установлена кинетика воспалительного производства цитокинов в тканях мыши после прививки prV footpad. Уровни специфических воспалительных цитокинов были количественно (т.е. интерлейкин-6 «IL-6» и гранулоцит-колонии стимулирующего фактора (G-CSF) из нескольких тканей, собранных и гомогенизированных от контроля и PRV-инфицированных мышей. Результаты продемонстрировали значительное увеличение уровня G-CSF в ноге и DRG по сравнению с элементами управления на 7 л.с. и 82 л.с.(рисунок 3A). Значительные уровни G-CSF наблюдались на уровне 82 л.с. в спинном мозге, мозге, сердце и ткани печени инфицированных PRV мышей по сравнению с элементами управления. Кроме того, значительные уровни IL-6 были обнаружены во всех тканях PRV-инфицированных мышей по сравнению с элементами управления, начиная с 24 л.с.(рисунок 3B).
Модель прививки для ног была дополнительно использована для исследования репликации PRV и распространения от привитой подножки к PNS и ЦНС и потенциальных корреляций с развитием нейровоспалительных ответов. PRV нагрузки были количественно в нескольких гомогенизированных тканей qPCR для усиления PRV ДНК. Концентрация ДНК была затем преобразована в PFU, как описано ранее10. PRV нагрузки были обнаружены в ноге, начиная с 24 л.с. (1 х 104 PFU/мг ткани) и в DRG, начиная с 60 л.с.(No 1 х 103 ПФУ / мг ткани; данные не показаны).
В умирающем состоянии (82 л.с.) PRV был обнаружен в ноге, DRG, спинном мозге и головном мозге, с самой высокой концентрацией PRV в DRG (No1 x 105 PFU/mg ткани; Рисунок 4). PRV-инфекция ДРГ была подтверждена косвенным иммунофлуоресценцией окрашивания криозекции ДРГ. PRV инфекция была обнаружена в DRG нейронов с использованием анти-PRV GB антитела. PRV гликопротеин gB был выражен на поздних стадиях инфекции в цитоплазме инфицированных клеток. Как и ожидалось, цитоплазмическое выражение PRV gB (зеленый) было подтверждено в инфицированных DRG, в то время как гБР не было выражено в контрольных образцах(рисунок 5). Ядра клеток были идентифицированы с окрашиванием DAPI (синим).
Рисунок 1: Представитель изображения мыши право задние лапы после ПРИВИВКи PRV. Мыши либо макет-прививки или прививки с PRV в abraded правой ноге. PRV-привитая подножка показывает признаки воспаления, в том числе покраснение и отек на гуманной конечной точке (82 л.с.). Подножка контрольных мышей выглядит нормальной с темно-красной коркой на абрадированном участке, что указывает на то, что рана заживает. Черные стрелки указывают на место ссадины. Эта цифра была изменена из предыдущей публикации11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Гистопатологические находки в ноге и DRG после прививки для ног PRV. Гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание ()мыши прививки footpads и (B) и ipsilateral DRG от управления (панель а) и PRV-инфицированных (панель b) мышей на 82 л.с. Гистопатологические проявления, наблюдаемые в ИНВ-инфицированных тканях (эпидермальный и нейрональный некроз и инфильтрация нейтрофилалов), отсутствуют у всех исследуемых макет-инфицированных мышей. Результаты являются репрезентативными для трех биологических репликаций для данного типа ткани. Черные стрелки указывают на репрезентативные области воспаления при инфильтрации иммунных клеток. Для каждого изображения указаны маштаб-бары (50 мкм). Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Кинетика воспалительного производства цитокинов в гомогенизированных тканях мыши после прививки стоп-стоп PRV. (A) G-CSF и (B) IL-6 уровни белка обнаружены в PRV-инфицированных (красный) и контроля (черный) мыши гомогенизированных тканей на различных hpi. Уровни белка количественно ELISA и выражается как пикограмма (пг) на миллиграмм (мг) гомогенизированной ткани (n No 5 на группу, 0,05, нс - не значительные). Эта цифра была изменена из предыдущей публикации12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Количественная оценка генома PRV в мышиных гомогенизированных тканях. PRV ДНК количественно в гомогенизированных тканей мыши по qPCR с помощью PRV UL54 грунтовки. PRV нагрузки выражаются как бляшки формирования единиц (PFU) на мг ткани. PRV ДНК обнаруживается только в стопе, DRG, спинном мозге и головном мозге (и не в других тканях), n No 10 на группу. Пунктирная линия показывает предел обнаружения. Эта цифра была изменена из предыдущей публикации11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Оценка PRV инфекции в НЕЙРОНах DRG путем окрашивания иммунофлюоресценции. Confocal -стек изображения макет-и PRV-инфицированных нейронов DRG после иммунофлуоресценции окрашивания с помощью мыши антитела, характерные для PRV gB (зеленый). Ядра клеток окрашены DAPI (синий, панелей и c). Панель d показывает несколько PRV-инфицированных нейронов, выражающих gB (белые стрелки). Выражение gB не обнаруживается в секциях управления DRG (панель b). Для каждого изображения указаны маштаб-бары (50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель прививки, описанная здесь, полезна для исследования инициирования и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпейвирусной инфекции. Кроме того, эта модель in vivo используется для установления кинетики репликации и распространения альфагерпезвируса от PNS до ЦНС. Это чередуется с другими моделями прививки, такими как модель прививки кожи фланга, которая опирается на глубокие кожныецарапины 13, или внутричерепный маршрут, который непосредственно вводит вирус в ЦНС14,15,16. В результате, с помощью модели footpad, можно получить более детальную оценку вирусной кинетики репликации и распространения с сопутствующими местными и отдаленными иммунопатологическими процессами в нервной системе11,,12.
В этом протоколе, ссадины подножки и последующей вирусной прививки являются решающими шагами. Действительно, слой роговицы должен быть полностью удален после адекватной ссадины для того, чтобы подвергать слой базале вирусной инокулум для успешной инфекции. Тем не менее, ссадины должны быть нежными и не вызывать кровотечения, так как это помогает предотвратить инфекцию кровообращения. Отдельный слой роговицы может быть визуализирован с помощью Н И E окрашивания под световой микроскопии. Корнеоциты, присутствующие в роговице слоя, плоские, эозинофильные клетки, которым не хватает ядер. Объем вирусного инокулума (20 капли л) был оптимизирован для обеспечения того, чтобы капля остается на ноге и охватывает abraded сайте. Аккуратно потирая капельку инокулум на абрадированную подножку, необходимо для эффективного вирусного проникновения. Рекомендуется подождать, пока подножка полностью высохнет, чтобы остановить анестезию и поместить животное в новую клетку. Этот шаг позволит избежать мыши от лизать вирусные inoculum от abraded footpad. Рекомендуется обрабатывать максимум трех мышей одновременно, используя носовой конус, который установлен, чтобы подвергать их одновременно анестезии.
При выполнении вскрытия мыши, важно сделать разрезы параллельно столбу позвонков, что предотвращает повреждение спинного мозга и связанных с ними DRG. Также предлагается удалить как можно больше жира, мышц и мягких тканей, чтобы уменьшить случайную резки в позвоночнике и облегчить лучшее сцепление на столбец сегмента с щипцами перед вырубкой средней линии.
Также рекомендуется выполнять поперечные прорезывая столб позвонков между дисками, чтобы производить очищенные сегменты колонн и ограничивать риск повреждения пар DRG. Менинги, окружающие спинной мозг и покрывающие DRG, должны быть полностью удалены, чтобы облегчить идентификацию и извлечение DRG. DRG следует тщательно удалить из позвоночника без повреждения от щипцов. Важно, чтобы DRG оставаться нетронутыми для Н И И И и иммунофлуоресценции окрашивания. Сроки имеет решающее значение для эффективности этого эксперимента in vivo, и вскрытие мыши и спинного мозга / DRG извлечения должны выполняться последовательно для того, чтобы собрать ткани, которые как можно свежее.
Описанный здесь метод гомогенизации тканей был оптимизирован для обеспечения эффективного нарушения большого количества образцов неоднородных тканей. Крайне важно стандартизировать количество используемых тканей, что позволяет напрямую сравнивать результаты ELISA и qPCR между образцами. Например, предлагается весить 100 мг ткани для каждой процедуры гомогенизации. Каждый образец ткани должен быть гомогенизирован в полном объеме, а остатки не должны быть заморожены. Важно автоклав стальной бусы и щипцы перед использованием, чтобы избежать загрязнения во время гомогенизации. Объем 500 МЛ является оптимальным для обеспечения полной гомогенизации образца ткани 100 мг. Важно отметить, что этот ограниченный объем позволяет только для обработки трех-четырех комплектов ELISA на один образец.
Используя модель прививки стопы, было продемонстрировано, что PRV инфекция у мышей вызывает сильное воспаление, характеризующееся инфильтрацией нейтрофила в подножку и DRG. Высокие концентрации воспалительных цитокинов G-CSF и IL-6 были также обнаружены во многих гомогенизированных тканях с использованием ELISA. Кроме того, была обнаружена сильная корреляция между геном PRV и экспрессией белка (по qPCR и IF окрашивания) в DRG и производством как провоспалительных цитокинов.
Эта модель подходит для сравнения кинетики вирусной репликации / распространения, а также нейровоспалительных реакций среди различных альфагерпейвирусных инфекций. Например, что касается ВЗВ, ограниченная специфичность хозяина и отсутствие клинических заболеваний ограничили использование моделей животных17. Таким образом, мышь footpad PRV прививки модель может представлять собой новую модель животных для изучения клеточных и молекулярных механизмов, ответственных за нейропатический зуд у пациентов с пост-герпетических поражений. Основываясь на сходстве в клинических признаках, патогенезе и геномах между ВЗВ и PRV, считается, что эта модель мыши повысит понимание патогенеза ВЗВ и приведет к развитию инновационных терапевтических стратегий.
Наконец, модель будет направлять исследования на периферических невропатий, таких как рассеянный склероз и связанные с ними вирусные индуцированных повреждений PNS18. Патогенез нескольких нейротропных вирусов (т.е. вирус бешенства, полиовирус, вирус Западного Нила, вирус Зика), которые, как известно, инфицируют PNS, также могут быть изучены с помощью этой модели19,20,21,22. Модель прививки подножки может быть использована в качестве возможного экономически эффективного инструмента для разработки лекарств. Например, он может служить в качестве платформы для проверки и проверки эффективности противовоспалительных и противовирусных препаратов, предназначенных для предотвращения вирусных индуцированных периферических невропатий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают лаборатории Реки Чарльза за их отличную техническую поддержку выполнения гистопатологических анализов. Эта работа была профинансирована Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) (RO1 NS033506 и RO1 NS060699). Спонсоры не имели никакой роли в разработке и анализе исследований, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
