Summary
El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.
Abstract
Este protocolo describe un modelo de inoculación de la almohadilla para pies utilizado para estudiar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus en ratones. Como los alfaherpesvirus son los principales invasores del sistema nervioso periférico (PNS), este modelo es adecuado para caracterizar la cinética de la replicación viral, su propagación desde el PNS al SNC, y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que las partículas del virus se propaguen desde un sitio de infección primaria en la epidermis del pie a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que invaden la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga a través del nervio ciático a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y, en última instancia, a través de la médula espinal hasta el cerebro. Aquí, se inocula un reposapiés de ratón con el virus pseudorabies (PRV), un alfaherpesvirus estrechamente relacionado con el virus del herpes simple (VHS) y el virus de la varicela-zoster (VZV). Este modelo demuestra que la infección por PRV induce una inflamación grave, caracterizada por la infiltración de neutrófilos en el reposapiés y el DRG. Las altas concentraciones de citoquinas inflamatorias son posteriormente detectadas en tejidos homogeneizados por ELISA. Además, se observa una fuerte correlación entre el gen PRV y la expresión de proteínas (a través de la tinción qPCR e IF) en DRG y la producción de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, el modelo de inoculación de la almohadilla de pie proporciona una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus y puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Además, el modelo puede guiar la investigación sobre neuropatías periféricas, como la esclerosis múltiple y el daño inducido por el virus asociado al PNS. En última instancia, puede servir como una herramienta in vivo rentable para el desarrollo de fármacos.
Introduction
Este estudio describe un modelo de inoculación de la almohadilla para investigar la replicación y propagación de virus desde el PNS al SNC y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie se ha utilizado intensamente para estudiar la infección por alfaherpesvirus en las neuronas1,2,3. El objetivo principal de este modelo es permitir que los virus neurotrópicos viajen una distancia máxima a través del PNS antes de alcanzar el SNC. Aquí, este modelo se utiliza para obtener nuevos conocimientos en el desarrollo de una neuropatía particular (picazón neuropática) en ratones infectados con el virus pseudorabies (PRV).
El PRV es un alfaherpesvirus relacionado con varios patógenos conocidos (es decir, herpes simple tipo 1 y 2 [HSV1 y HSV2] y virus varicela-zoster [VZV]), que causan herpes labial, lesiones genitales y varicela, respectivamente4. Estos virus son todos pantrópicos y capaces de infectar muchos tipos de células diferentes sin mostrar afinidad por un tipo de tejido específico. Sin embargo, todos ellos exhiben un neurotropismo característico al invadir el PNS (y ocasionalmente, el SNC) de especies anfitrionas. El huésped natural es el cerdo, pero el PRV puede infectar a la mayoría de los mamíferos. En estos huéspedes no naturales, PRV infecta el PNS e induce un prurito severo llamado la "prurito loco", seguido de la muerte peraguta5,6. El papel de la respuesta neuroinmune en el resultado clínico y la patogénesis de la infección por PRV ha sido mal entendido.
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que el PRV inicie la infección en las células epidérmicas de la almohadilla. Luego, la infección se propaga a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que inerpen la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga por partículas de virus que se mueven a través del nervio ciático al DRG dentro de aproximadamente 60 h. La infección se propaga a través de la médula espinal, llegando en última instancia al cerebro trasero cuando los animales se vuelven moribundos (82 h después de la infección). Durante este período de tiempo, las muestras de tejido se pueden recoger, procesar y analizar para la replicación del virus y los marcadores de la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el examen histológico y la cuantificación de la carga viral se pueden realizar en diferentes tejidos para establecer correlaciones entre la iniciación y el desarrollo de procesos clínicos, virológicos y neuroinflamatorios en la patogénesis del V PRV.
Utilizando el modelo de inoculación de la almohadilla, se pueden investigar los mecanismos celulares y moleculares del prurito inducido por PRV en ratones. Además, este modelo puede proporcionar una nueva visión de la iniciación y el desarrollo de la neuroinflamación inducida por el virus durante las infecciones por herpesvirus. Una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Por ejemplo, este modelo es útil para investigar los mecanismos de la picazón neuropática en pacientes con lesiones post-herpéticas (por ejemplo, herpes zóster, herpes zóster) y probar nuevas dianas terapéuticas en ratones para las enfermedades humanas correspondientes.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con un protocolo (número 2083-16 y 2083-19) revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Princeton. Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los requisitos de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado aprobado por el comité de bioseguridad de la Universidad de Princeton. Los procedimientos que incluyen la abrasión de la almohadilla del ratón, la inoculación viral, la disección de ratón y la recolección de tejidos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica (BSC) en la sala de instalaciones de biocontención animal de la Universidad de Princeton. Aquellos que realizan el procedimiento llevaban batas desechables, cubierta para la cabeza, protección para los ojos, guantes estériles, máscaras quirúrgicas y fundas de zapatos.
1. Abrasión del teclado del ratón
- Anestesiar un ratón C57BL/6 (5-7 semanas de edad) con anestésico de gas isoflurano, entregado a una dosis del 3% a través de un pequeño sistema de anestesia (cámara).
- Coloque el ratón en el plano quirúrgico de la anestesia en su espalda, antes de la inoculación, en el reposapiés trasero. Fije un cono nasal con un diafragma (una hendidura suficientemente grande para ajustar el hocico del animal) al ratón y entregue anestésico de gas isoflurano a una dosis constante de 1.5%–2.0%.
- Supervise de cerca el ratón para obtener una respuesta al estímulo doloroso creado por la pinza de la dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del objeto con fórceps.
- Sujete ligeramente un pie trasero con fórceps planos.
- Abrasa suavemente la piel glabra de la almohadilla trasera aproximadamente 20x, entre el talón y las almohadillas para caminar, con una tabla de esmeril (100-180 de grano). No induzca el sangrado abrasando con demasiada frecuencia o aplicando demasiada presión.
- Usando fórceps finos, despegue lentamente el estrato córneo separado por abrasión para exponer el estrato basale.
2. Inoculación de la almohadilla de pie PRV
- Preparar el inóculo del virus diluido al título deseado en medios DMEM que contengan un 2% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina(Tabla de Materiales).
- Cantidade el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el stock de virus en las células PK15 para calcular y estandarizar la dosis viral y diluir el inóculo viral en consecuencia.
NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker) a una dosis de 8 x 106 PFU. Esta dosis se optimizó en un experimento preliminar anterior para garantizar que todos los animales inoculados mostraran síntomas clínicos a 82 h después de la inoculación (hpi). - Mantenga el inóculo del virus sobre hielo y mezcle suavemente antes de usarlo.
- Cantidade el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el stock de virus en las células PK15 para calcular y estandarizar la dosis viral y diluir el inóculo viral en consecuencia.
- Añadir una gota de 20 l de inóculo del virus (8 x 106 PFU) a la almohadilla abrasada (administración tópica). Realice inoculaciones simuladas (solo medianas) en paralelo.
- Frote suavemente 10x con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus. Evite rascarse con el punto de la aguja. Repita este paso cada 10 minutos.
- Mantenga el ratón bajo anestesia durante 30 minutos hasta que la almohadilla abrasada esté seca.
- Después de detener la anestesia, monitoree el ratón hasta que pueda mantener la recumbencia esternal y colóquelo en una jaula individual para el seguimiento clínico y el muestreo.
3. Disección del ratón y recolección de tejidos
- En los momentos apropiados después de la infección, eutanasiar el ratón por el método de asfixia (CO2).
NOTA: En este estudio, el punto final humano (cuando los animales comienzan a presentar síntomas terminales) para los ratones infectados por PRV-Becker es de 82 hpi. Eutanasia los animales de control en paralelo. - Coloque el lado ventral del ratón mirando hacia arriba sobre una estera quirúrgica usando agujas/pins. Asegure las extremidades del ratón con alfileres a una placa de espuma quirúrgica. Humedezca el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la contaminación del pelaje.
- Pinche la capa externa de piel y piel usando fórceps y haga una pequeña incisión inicial usando tijeras finas cerca de la abertura uretral.
- Desde esta abertura, continúe la incisión en el lado ventral medio hasta la barbilla.
- Extienda dos incisiones laterales hacia las extremidades de las extremidades delanteras y posteriores.
- Separe la piel de la capa muscular subyacente y ancle hacia abajo hacia un lado.
- Abra la cavidad abdominal e incíme hasta la base del tórax. Completar la apertura de la cavidad abdominal realizando dos incisiones transversales.
- Abra la cavidad torácica cortando el diafragma y las costillas en ambos lados laterales.
NOTA: Cortar los lados de la caja torácica evita el riesgo de cortar el corazón. - Recoger órganos expuestos, incluyendo corazón, pulmones, bazo, páncreas, hígado, riñones y vejiga en microtubos de 1,5 ml. Mantenga los tubos en hielo.
- Corte la almohadilla abrasada entre el talón y las almohadillas para caminar y coloque el trozo de tejido en un tubo como se describe en el paso 3.3.6.
- Coloque el lado dorsal del ratón hacia arriba y moje el pelaje con 70% de etanol. Corte la capa de la piel para exponer la columna vertebral.
- Haga una pequeña incisión en la región de la pelvis. Retire la piel de las extremidades posteriores hacia la cabeza.
- Retire las piernas y los brazos cortando con tijeras paralelas y cerca de la columna vertebral en ambos lados.
- Cortar la cabeza en la base del cráneo (nivel C1–C2).
- Abre el cráneo con tijeras desde el foramen magnum hasta el hueso frontal.
- Tire de abrir el cráneo en direcciones laterales utilizando fórceps.
- Saque suavemente el cerebro usando fórceps y proceda como se describe en el paso 3.3.6.
- Limpie la columna vertebral cortando músculo, grasa y tejidos blandos usando tijeras curvas. Corta la cola. Coloque la columna vertebral intacta en un tubo de 15 ml que contenga solución salina estéril con fosfato frío helado (PBS). Mantenga los tubos sobre hielo hasta una mayor disección de la médula espinal y el DRG.
4. Extracción de la médula espinal y el DRG
NOTA: Extraiga la médula espinal y el DRG de la columna de vértebras directamente después de la disección del ratón. El protocolo para la extracción de la médula espinal y la DRG ha sido adaptado de una publicación anterior7.
- Retire la columna de vértebras del tubo PBS helado y retire los tejidos blandos restantes, lo que se vuelve más fácil después de la refrigeración.
- Realice tres cortes transversales en la columna a través de las vértebras (niveles T1, L1 y S2) utilizando una cuchilla de afeitar. Coloque las tres piezas en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS al hielo estéril. Realice un seguimiento y marque el origen de los segmentos para su posterior análisis.
- Tome un segmento y asegúrelo entre fórceps, lado dorsal hacia arriba. Haga un único corte longitudinal a través de la línea media usando una cuchilla de afeitar, dividiendo la columna en dos mitades iguales.
- Coloque ambas mitades en un nuevo plato de Petri que contenga un nuevo PBS estéril helado. Asegurar la orientación correcta del segmento para poder distinguir los lados izquierdo y derecho.
- Bajo un microscopio diseccionando, pela suavemente la médula espinal de la columna de las vértebras de cada mitad en una dirección rostral a caudal usando fórceps finos.
- Recoger ambas mitades de la médula espinal en microtubos de 1,5 ml que contengan 500 l de PBS estéril helado. Mantenga los tubos en hielo.
- Retire suavemente las meninges de un lado de la columna vertebral al otro para exponer el DRG.
- Retire cada DRG individualmente agarrando el nervio espinal expuesto y sácalo suavemente de la columna vertebral. Coloque el DRG recogido en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS helado. Cosecha todo el DRG ipsilateral y contralateral por separado del segmento de la columna vertebral y proceda como se describe en el paso 4.5.
NOTA: El DRG es visible como una estructura transparente redonda a lo largo del nervio espinal blanco. - Repita los pasos 4.3–4.7 usando los otros dos segmentos de columna vertebral dentro de 30–45 min.
- Centrifugar todos los tubos a alta velocidad (17.900 x g) durante 3 min a 4oC.
- Aspirar tubos de sobrenadantes y de congelación de flash en nitrógeno líquido. Almacene los tubos a -80 oC para una mayor homogeneización del tejido.
- Alternativamente, fije y seccione el DRG limpio y otros tejidos de ratón para análisis histopatológicos y/o tinción de inmunofluorescencia después del paso 4.9.
5. Homogeneización de tejidos
- Descongelar los tubos que contienen muestras de tejido congelado sobre hielo.
- Pesar 100 mg de tejido y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga un cordón de acero estéril y 500 l de tampón RIPA que contenga 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 1 M Tris-HCl (pH a 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS e inhibidores de cócteles proteasas.
- Interrumpir los tejidos a temperatura ambiente (RT) utilizando un homogeneizador a 20 ciclos/s durante 2 min, seguido de un período de espera de 1 min, luego 20 ciclos/s durante 2 min.
- Centrifugar el tubo a alta velocidad (17.900 x g)durante 10 min en RT.
- Recoger el sobrenadante (500 l) en un tubo nuevo y almacenarlo a -20 oC hasta realizar ELISA y qPCR para cuantificar los marcadores inflamatorios y las cargas virales, respectivamente.
NOTA: Para qPCR, recoja todas las muestras con material libre de RNase (es decir, perlas, tubos, etc.) y interrumpa los tejidos con tampón de lice yissis de ARN que contengan 1% de betamercaptoetanol(Tabla de materiales).
6. Preparación y tinción de inmunofluorescencia de secciones DRG congeladas
- Procesamiento de tejidos
- Fijar el DRG diseccionado y limpiado en 1% de paraformaldehído (PFA) durante 2 h en RT.
- Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con 10% de sacarosa en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
- Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa del 20% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
- Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa al 30% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
- Incruste los tejidos en el PTU usando un criomold y coloque bloques en hielo seco para una rápida congelación.
- Conservar las muestras a -80 oC hasta su uso.
- Preparación de criocisión
- Retirar el bloque congelado de -80 oC y dejar que se equilibre en la temperatura de la cámara del criostato durante 30 min.
- Cryosection el DRG a un espesor de 15 m y montar las secciones en diapositivas.
- Utilice una pluma para dibujar un círculo hidrófobo alrededor del tejido montado en la diapositiva.
- Mantenga los portaobjetos a 4 oC hasta que se manches.
- Tinción de inmunofluorescencia
- Lavar las secciones DRG 3x en PBS durante 10 min en RT.
- Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo primario deseado (p. ej., anticuerpo de ratón contra la glicoproteína B) durante 1 h a 37oC. Diluir el anticuerpo primario en PBS que contiene 10% de suero de cabra negativo.
- Repita el paso 6.3.1.
- Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo secundario deseado (antiratón de cabra Alexa Fluor 488) durante 50 min a 37oC. Diluir anticuerpo secundario solo en PBS.
- Añadir 100 l de colorante DAPI (4o,6-diamidino-2-fenilíndole) diluido en PBS en la sección. Incubar más muestras a 10 min a 37oC.
- Repita el paso 6.3.1.
- Monte las muestras utilizando un medio de montaje de fluorescencia en diapositivas de vidrio y asegúrela y cúbrala con cubreobjetos.
7. Preparación y tinción H&E de secciones de tejido incrustadas en parafina
- Fijar el tejido en 10% de formalina durante 24 h a 4 oC.
- Realizar un cronograma de procesamiento estándar para la incrustación de parafina y sección de tejidos fijos. Transfiera los tejidos fijos al 70% de etanol y procese a través de alcoholes mejorados al xileno seguido de parafina, como se describió anteriormente8.
NOTA: Utilice esponjas de poliéster para mantener pequeñas muestras de tejido como DRG dentro de los casetes. - Realizar la desparafinación estándar seguida de la tinción H&E de secciones de tejido, como se describió anteriormente9.
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Representative Results
El modelo de inoculación del ratón para el reposapiés permite caracterizar la inmunopatogénesis de la infección por alfaherpesvirus in vivo, incluida la replicación y propagación de la infección desde la almohadilla inoculada hasta el sistema nervioso y la inducción de respuestas neuroinflamatorias específicas.
En este estudio, primero abrasamos el pie trasero del ratón y nos maglegráramos o inoculamos la región abrasada con una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker). El sitio de abrasión era visible en la almohadilla de control. Se formó una corteza en el sitio de abrasión como parte del proceso de curación(Figura 1, flecha negra). Por el contrario, los ratones inoculados con PRV mostraron una inflamación grave en el punto final humano (82 hpi), caracterizada por la hinchazón de la almohadilla y el enrojecimiento.
Después de la inoculación de la almohadilla con la cepa virulenta PRV-Becker, los ratones comenzaron a mostrar signos clínicos a 72 hpi, caracterizados por la hinchazón de la almohadilla inoculada y temblores cada vez más frecuentes. Con 82 hpi, los ratones infectados por PRV-Becker mostraron temblores constantes en la pierna inoculada y síntomas distintivos de PRV, incluyendo rasguños intensos y mordeduras del pie. También se observó inflamación grave en el reposapiés. La respuesta inflamatoria inducida durante la infección por PRV se caracterizó aún más, incluyendo la infiltración de células inmunitarias en los tejidos.
Se realizó un examen histopatológico de varios tejidos, incluyendo la almohadilla inoculada y el DRG, seguido de la tinción H&E de secciones de tejido incrustadas en parafina. Se observaron necrosis epidérmica e inflamación dérmica grave (edema y fibrina) en secciones de pies infectadas por el PRV(Figura 2A, panel b). La epidermis, la dermis y los tejidos conectivos de los ratones infectados mostraron una infiltración masiva de neutrófilos (identificados por núcleos multilobulados) marcados con flechas negras. Las almohadillas de los ratones de control eran normales(Figura 2A, panel a). DrG infectado por PRV mostró necrosis neuronal mínima e inflamación mixta en ratones infectados, mientras que el DRG de los ratones de control era normal(Figura 2B, paneles a y b). El infiltrado de inflamación mixta consistía principalmente en neutrófilos y linfocitos.
A continuación, se estableció la cinética de la producción inflamatoria de citoquinas en el tejido de ratón después de la inoculación de la almohadilla de pie PRV. Se cuantificaron los niveles de citoquinas inflamatorias específicas (es decir, interleucina-6 [IL-6] y factor estimulante de colonias de granulocitos [G-CSF]) de varios tejidos recogidos y homogeneizados a partir de ratones de control e infectados por PRV. Los resultados demostraron un aumento significativo de los niveles de G-CSF en el teclado y el DRG en comparación con los controles a 7 hpi y 82 hpi(Figura 3A). Se observaron niveles significativos de G-CSF a 82 hpi en la médula espinal, el cerebro, el corazón y el tejido hepático de ratones infectados por el PRV en comparación con los controles. Además, se detectaron niveles significativos de IL-6 en todos los tejidos de ratones infectados por el V PRV en comparación con los controles a partir de 24 hpi(Figura 3B).
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie se utilizó además para investigar la replicación de PRV y se extendió desde la almohadilla de pie inoculada al SNS y el SNC y las correlaciones potenciales con el desarrollo de la respuesta neuroinflamatoria. Las cargas de PRV se cuantificaron en varios tejidos homogeneizados por qPCR para amplificar el ADN PRV. La concentración de ADN se convirtió entonces a PFU, como se describió anteriormente10. Se detectaron cargas de PRV en el teclado a partir de 24 hpi (1 x 104 PFU/mg de tejido) y en DRG a partir de 60 hpi (1 x 103 PFU/mg de tejido; datos no mostrados).
En un estado moribundo (82 hpi), se detectó PRV en la almohadilla, DRG, médula espinal y cerebro, con la mayor concentración de PRV en DRG (1 x 105 PFU/mg de tejido; Figura 4). La infección por PRV de DRG se confirmó mediante la tinción indirecta de inmunofluorescencia de criocciones DRG. Se detectó infección por PRV en las neuronas DRG utilizando anticuerpos anti-PRV gB. La glicoproteína gB PRV se expresó durante las últimas etapas de la infección en el citoplasma de las células infectadas. Como era de esperar, se confirmó la expresión citoplasmático de PRV gB (verde) en el DRG infectado, mientras que no se expresó ningún gB en muestras de control (Figura 5). Los núcleos celulares se identificaron con tinción DAPI (azul).
Figura 1: Imágenes representativas de las patas traseras derechas del ratón después de la inoculación de PRV. Los ratones son inoculados simulados o inoculados con PRV en el pie trasero derecho abrasado. La almohadilla de pie inoculada por PRV muestra signos de inflamación, incluyendo enrojecimiento e hinchazón en el punto final humano (82 hpi). La almohadilla de ratones de control parece normal con una corteza roja oscura en el sitio abrasado, lo que indica que la herida está sanando. Las flechas negras indican el lugar de la abrasión. Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Hallazgos histopatológicos en la almohadilla de pie y DRG después de la inoculación de la almohadilla de pie PRV. Hematoxilina y eosina (H&E) tinción de (A) almohadillas inoculadas de ratón y (B) y DRG ipsilateral de ratones de control (panel a) e infectados por PRV (panel b) a 82 hpi. Las manifestaciones histopatológicas observadas en los tejidos infectados por el PRV (necrosis epidérmica y neuronal e infiltración de neutrófilos) están ausentes de todos los ratones infectados por simulacros examinados. Los resultados son representativos de tres réplicas biológicas para un tipo determinado de tejido. Las flechas negras indican áreas representativas de inflamación con infiltración de células inmunitarias. Para cada imagen se indican las barras de escala (50 m). Esta cifra ha sido modificada de11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cinética de la producción inflamatoria de citoquinas en tejidos de ratón homogeneizados después de la inoculación de la almohadilla del PRO. (A) G-CSF y( B) Niveles de proteína IL-6 detectados en tejidos homogeneizados con PRV (rojo) y ratón de control (negro) a diferentes hpi. Los niveles de proteínas son cuantificados por ELISA y expresados como picogramos (pg) por miligramo (mg) de tejido homogeneizado (n a 5 por grupo, *p < 0,05, ns no significativo). Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación del genoma del V PRV en tejidos homogeneizados del ratón. El ADN PRV se cuantifica en tejidos de ratón homogeneizados mediante qPCR utilizando imprimaciones PRV UL54. Las cargas de PRV se expresan como unidades formadoras de placa (PFU) por mg de tejido. El ADN PRV se detecta sólo en el pie, DRG, médula espinal y cerebro (y no en otros tejidos), n a 10 por grupo. La línea de puntos muestra el límite de detección. Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de la infección por PRV en las neuronas DRG mediante tinción por inmunofluorescencia. Imágenes confocales de la pila Z de neuronas DRG infectadas por PRV y simuladas después de la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo de ratón específico para PRV gB (verde). Los núcleos celulares se tiñen con DAPI (azul, paneles a y c). El panel d muestra varias neuronas infectadas por PRV que expresan gB (flechas blancas). No se detecta ninguna expresión gB en las secciones DRG de control (panel b). Para cada imagen se indican las barras de escala (50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo de inoculación de la almohadilla de pie descrito aquí es útil para investigar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus. Además, este modelo in vivo se utiliza para establecer la cinética de la replicación y propagación del alfaherpesvirus desde el PNS al SNC. Se trata de un suplente de otros modelos de inoculación, como el modelo de inoculación de la piel del flanco, que se basa en el rascado dérmico profundo13,o la ruta intracraneal, que introduce directamente el virus en el SNC14,,15,,16. Como resultado, con el modelo de footpad, es posible obtener una evaluación más detallada de la cinética viral de la replicación y propagación con procesos inmunopatológicos locales y distantes asociados en el sistema nervioso11,,12.
En este protocolo, la abrasión de la almohadilla y la posterior inoculación viral son pasos cruciales. De hecho, el estrato córneo necesita ser completamente eliminado después de una abrasión adecuada con el fin de exponer el estrato basale al inóculo viral para una infección exitosa. Sin embargo, la abrasión debe ser suave y no inducir sangrado, ya que esto ayuda a prevenir la infección de la circulación sanguínea. El estrato córneo separado se puede visualizar mediante tinción H&E bajo microscopía ligera. Los corneocitos presentes en el estrato córneo son células planas eosinofílicas que carecen de núcleos. El volumen del inóculo viral (gota de 20 l) se ha optimizado para garantizar que la gota permanezca en el reposapiés y cubra el sitio abrasado. Frotar suavemente la gota de inóculo en la almohadilla abrasada es esencial para una penetración viral eficiente. Se recomienda esperar hasta que la almohadilla esté completamente seca para detener la anestesia y colocar al animal en una nueva jaula. Este paso evitará que el ratón lame el inóculo viral de la almohadilla abrasada. Se recomienda procesar un máximo de tres ratones a la vez, utilizando un cono nasal que está configurado para exponerlos simultáneamente a la anestesia.
Al realizar la disección del ratón, es importante hacer cortes paralelos a la columna de las vértebras, lo que evita daños en la médula espinal y el DRG asociado. También se sugiere para eliminar tanta grasa, músculo, y tejido blando como sea posible para reducir el corte accidental en la columna vertebral y facilitar un mejor agarre en el segmento de columna con fórceps antes de cortar la línea media.
También se recomienda realizar cortes transversales a través de la columna de vértebras entre discos con el fin de producir segmentos de columna limpiados y limitar el riesgo de dañar los pares de DRG. Las meninges que rodean la médula espinal y cubren el DRG deben eliminarse por completo para facilitar la identificación y extracción del DRG. El DRG debe retirarse cuidadosamente de la columna vertebral sin dañar los fórceps. Es importante que drG permanezca intacto para la tinción de H&E e e inmunofluorescencia. El tiempo es crítico para la eficiencia de este experimento in vivo, y la disección del ratón y la extracción de la médula espinal/ DRG deben realizarse consecutivamente con el fin de recoger el tejido que es lo más fresco posible.
El método de homogeneización tisular descrito aquí se ha optimizado para garantizar la interrupción eficiente de un gran número de muestras de tejido heterogéneo. Es primordial estandarizar la cantidad de tejido utilizado, lo que permite la comparación directa de los resultados de ELISA y qPCR entre muestras. Por ejemplo, se sugiere pesar 100 mg de tejido para cada procedimiento de homogeneización. Cada muestra de tejido debe homogeneizarse en su totalidad, y las sobras no deben ser congeladas. Es importante autoclave las perlas de acero y fórceps antes de su uso para evitar cualquier contaminación durante la homogeneización. Un volumen de 500 l es óptimo para garantizar la homogeneización completa de una muestra de tejido de 100 mg. Es importante tener en cuenta que este volumen limitado solo permite el procesamiento de tres a cuatro kits ELISA por muestra.
Usando el modelo de inoculación de la almohadilla, se demostró que la infección por PRV en ratones induce una inflamación grave, caracterizada por la infiltración de neutrófilos en la almohadilla y el DRG. También se detectaron altas concentraciones de citoquinas inflamatorias G-CSF e IL-6 en muchos tejidos homogeneizados utilizando ELISA. Además, se encontró una fuerte correlación entre el gen PRV y la expresión de proteínas (por tinción qPCR e IF) en DRG y la producción de citoquinas proinflamatorias.
Este modelo es adecuado para comparar la cinética de la replicación viral / propagación, así como respuestas neuroinflamatorias entre diferentes infecciones por alfaherpesvirus. Por ejemplo, en relación con el VZV, la especificidad restringida del huésped y la falta de enfermedad clínica han limitado el uso de modelos animales17. Por lo tanto, el modelo de inoculación PRV del pedal del ratón puede representar un nuevo modelo animal para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares responsables del prurito neuropático en pacientes con lesiones post-herpéticas. Sobre la base de las similitudes en los signos clínicos, la patogénesis y los genomas entre VZV y PRV, se cree que este modelo de ratón mejorará la comprensión de la patogénesis VZV y conducirá a la evolución de las estrategias terapéuticas innovadoras.
Por último, el modelo guiará la investigación sobre neuropatías periféricas, como la esclerosis múltiple y el daño inducido por el virus asociado al PNS18. La patogénesis de varios virus neurotrópicos (es decir, virus de la rabia, poliovirus, virus del Nilo Occidental, virus del Zika), que son conocidos por infectar el PNS, también se puede estudiar utilizando este modelo19,,20,,21,,22. El modelo de inoculación de la almohadilla se puede utilizar como una posible herramienta rentable para el desarrollo de fármacos. Por ejemplo, puede servir como una plataforma para examinar y probar la eficacia de los medicamentos antiinflamatorios y antivirales diseñados para prevenir las neuropatías periféricas inducidas por virus.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen a los laboratorios de Charles River por su excelente apoyo técnico en la ejecución de los análisis de histopatología. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) (RO1 NS033506 y RO1 NS060699). Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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