Summary
Footpad inokulering modellen är ett värdefullt verktyg för att karakterisera viral-inducerad neuroinflammatoriska svar in vivo. I synnerhet ger det en tydlig bedömning av viral kinetik och tillhörande immunopatologiska processer som inletts i det perifera nervsystemet.
Abstract
Detta protokoll beskriver en footpad inokulering modell som används för att studera inledande och utveckling av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion hos möss. Eftersom alphaherpesviruses är huvudsakliga inkräktare av det perifera nervsystemet (PNS), är denna modell lämplig att karakterisera kinetiken av viral replikering, dess spridning från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatoriska svar. Footpad inympning modellen tillåter viruspartiklar att sprida sig från en primär infektion plats i footpad epidermis till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innervera epidermis, svettkörtlar, och dermis. Infektionen sprider sig via ischiasnerven till dorsala rot ganglierna (DRG) och i slutändan genom ryggmärgen till hjärnan. Här är en mus fotplatta inokuleras med pseudorabies virus (PRV), en alphaherpesvirus nära besläktad med herpes simplex virus (HSV) och varicella-zoster virus (VZV). Denna modell visar att PRV-infektion inducerar svår inflammation, som kännetecknas av neutrofilinfiltration i fotplattan och DRG. Höga koncentrationer av inflammatoriska cytokiner upptäcks därefter i homogeniserade vävnader av ELISA. Dessutom observeras en stark korrelation mellan PRV gen och protein uttryck (via qPCR och OM färgning) i DRG och produktion av proinflammatoriska cytokiner. Därför ger footpad inympning modellen en bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier och kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Dessutom kan modellen vägleda forskning om perifera neuropatier, såsom multipel skleros och tillhörande viral-inducerad skada på PNS. I slutändan, Det kan fungera som ett kostnadseffektivt in vivo verktyg för läkemedelsutveckling.
Introduction
Denna studie beskriver en footpad inokulering modell för att undersöka replikering och spridning av virus från PNS till CNS och tillhörande neuroinflammatory svar. Footpad inokulering modellen har intensivt använts för att studera alphaherpesvirus infektion i nervceller1,2,3. Huvudsyftet med denna modell är att tillåta neurotropa virus att resa ett maximalt avstånd genom PNS innan de når CNS. Här används denna modell för att få nya insikter i utvecklingen av en viss neuropati (neuropatisk klåda) hos möss infekterade med pseudorabiesvirus (PRV).
PRV är ett alfaherpesvirus relaterat till flera välkända patogener (dvs. herpes simplex typ 1 och 2 [HSV1 och HSV2] och varicella-zoster virus [VZV]), som orsakar munsår, genitala lesioner, och vattkoppor,respektive 4. Dessa virus är alla pantropiska och kunna infektera många olika celltyper utan att visa affinitet för en viss vävnadstyp. De uppvisar dock alla en karakteristisk neurotropism genom att invadera PNS (och ibland CNS) av värdarter. Den naturliga värden är grisen, men PRV kan infektera de flesta däggdjur. I dessa icke-naturliga värdar infekterar PRV PNS och inducerar en allvarlig klåda som kallas "galna kliar", följt av perakut död5,6. Rollen av neuroimmune svar i det kliniska resultatet och patogenes av PRV infektion har varit dåligt förstått.
Footpad inokulering modellen tillåter PRV att initiera infektion i epidermala cellerna i fotplattan. Sedan sprider infektionen till sensoriska och sympatiska nervfibrer som innerverar epidermis, svettkörtlar och dermis. Infektionen sprids genom viruspartiklar som rör sig via ischiasnerven till DRG inom cirka 60 timmar. Infektionen sprider sig genom ryggmärgen, slutligen når hindbrain när djur blir döende (82 h efter infektion). Under denna tidsperiod kan vävnadsprover samlas in, bearbetas och analyseras för virusreplikation och markörer för immunsvaret. Till exempel kan histologisk undersökning och viral belastning kvantifiering utföras i olika vävnader för att fastställa korrelationer mellan inledande och utveckling av kliniska, virological och neuroinflammatoriska processer i PRV patogenes.
Med hjälp av footpad inokulering modell, cellulära och molekylära mekanismer prv-inducerad klåda hos möss kan undersökas. Dessutom kan denna modell ge ny insikt i initiering och utveckling av virus-inducerad neuroinflammation under herpesvirus infektioner. En bättre förståelse av de processer som ligger bakom alphaherpesvirus-inducerad neuropatier kan leda till utveckling av innovativa terapeutiska strategier. Till exempel är denna modell användbar för att undersöka mekanismerna för neuropatisk klåda hos patienter med postherpetiska lesioner (t.ex. herpes zoster, bältros) och testa nya terapeutiska mål hos möss för motsvarande mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med ett protokoll (nummer 2083-16 och 2083-19) som granskades och godkändes av Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Princeton University. Detta arbete utfördes genom att strikt följa kraven på biosäkerhetsnivå-2 (BSL-2), till vilka vi har ett fullt utrustat labb godkänt av Princeton University biosäkerhetskommitté. Förfarandena inklusive mus fotpad nötning, viral inokulering, mus dissekering och vävnad insamling utfördes i en biologisk säkerhet skåp (BSC) i Princeton University biocontainment djur anläggning rum. De som utför förfarandet bar engångsklänningar, huvudskydd, ögonskydd, sterila handskar, kirurgiska masker och skoöverdrag.
1. Mus fotfotslipsion
- Bedöva en C57BL/6 mus (5–7 veckor gammal) med isoflurangasbedövning, levereras med en dos av 3% via ett litet anestesisystem (kammare).
- Placera musen i det kirurgiska planet av anestesi på ryggen, före inokulering, i bakfotplattan. Fäst en näskon med ett membran (en slits som är tillräckligt stor för att passa djurets nosparti) på musen och leverera isoflurangasbedövning vid en konstant dos på 1,5%–2,0%.
- Noga övervaka musen för ett svar på smärtsam stimulans som skapas av kraftfulla nypa av tå med pincett.
- Ta lätt tag i en bakfotplatta med platta pincett.
- Försiktigt abrade glabrösa huden på bakfotpaden ca 20x, mellan hälen och gångkuddar, med en smärgel ombord (100-180 grus). Framkalla inte blödning genom att slipa för ofta eller utöva för mycket tryck.
- Med hjälp av fina pincett, långsamt skala av stratum corneum lossnat av nötning för att exponera stratum basale.
2. PRV fotplatta inokulering
- Förbered virusinokulatet som spädts ut till önskad titer i DMEM-medium som innehåller 2 % fetalt bovinserum (FBS) och 1 % penicillin/streptomycin (Tabell över material).
- Kvantifiera antalet plackbildande enheter (PFU) i virusbeståndet på PK15-celler för att beräkna och standardisera virusdosen och späda ut virusinokulatet därefter.
OBS: I denna studie användes virulent stam av PRV (PRV-Becker) vid en dos på 8 x 106 PFU. Denna dos optimerades i ett tidigare preliminärt experiment för att säkerställa att alla inokulerade djur visade kliniska symtom vid 82 h post-inympning (hpi). - Håll viruset inokulat på is och blanda försiktigt före användning.
- Kvantifiera antalet plackbildande enheter (PFU) i virusbeståndet på PK15-celler för att beräkna och standardisera virusdosen och späda ut virusinokulatet därefter.
- Tillsätt en 20 μL droppe virusinokulat (8 x 106 PFU) på den slipade fotplattan (lokal administrering). Utför mock inympningar (endast medium) parallellt.
- Gnugga försiktigt 10x med axeln på en nål för att underlätta adsorption av viruset. Undvik att repa med nålpunkten. Upprepa detta steg var 10:e minut.
- Håll musen under anestesi i 30 minuter tills den slipade fotplattan är torr.
- Efter att ha stoppat anestesi, övervaka musen tills den kan upprätthålla sternal recumbency och placera den i en individuell bur för klinisk uppföljning och provtagning.
3. Musdissektion och vävnadsinsamling
- Vid lämpliga tidpunkter efter infektion, avliva musen med kvävningsmetoden (CO2).
OBS: I denna studie är det humana effektmåttet (när djur börjar uppvisa terminala symtom) för PRV-Becker-infekterade möss 82 hpi. Avliva kontrolldjur parallellt. - Placera musen ventral sida vänd upp på en kirurgisk matta med nålar / stift. Säkra lemmarna på musen med stift till en kirurgisk skumbräda. Fukta musens ventrala sida med 70% etanol för att minimera pälskontaminering.
- Nyp ihop det yttre lagret av päls och hud med pincett och gör ett litet första snitt med hjälp av fin sax nära urethralöppningen.
- Från denna öppning, fortsätt snittet på mitten ventrala sidan upp till hakan.
- Utöka två laterala snitt mot extremiteterna av frambenen och bakbenen.
- Separera huden från det underliggande muskelskiktet och stift ner till sidan.
- Öppna bukhålan och incise upp till basen av bröstkorgen. Slutföra öppnandet av bukhålan genom att göra två övergripande snitt.
- Öppna brösthålan genom att klippa mellangärden och revbenen på båda sidor i sidled.
OBS: Genom att klippa ut bröstkorgens sidor kan du minska risken för att hjärtat skärs ned. - Samla exponerade organ, inklusive hjärta, lungor, mjälte, bukspottkörtel, lever, njurar, och urinblåsan i 1,5 ml mikrorör. Håll rören på is.
- Skär den slipade fotplattan mellan hälen och gångkuddarna och placera vävnadsbiten i ett rör enligt beskrivningen i steg 3.3.6.
- Placera musdrsala sidan upp och blöt pälsen med 70% etanol. Skär ner hudlagret för att exponera ryggraden.
- Gör ett litet snitt i bäckenets region. Ta bort huden från bakbenen mot huvudet.
- Ta bort ben och armar genom att skära med sax parallellt med och nära ryggraden på båda sidor.
- Skär huvudet av vid basen av skallen (C1-C2 nivå).
- Skär upp skallen med sax från foramen magnum till frambenet.
- Dra upp skallen i sidled med pincett.
- Skopa försiktigt ut hjärnan med pincett och fortsätt enligt beskrivningen i steg 3.3.6.
- Rengör ryggraden genom att skära muskler, fett och mjuka vävnader med böjda saxar. Skär svansen. Placera den intakta ryggraden i ett 15 ml-rör som innehåller steril iskall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Förvara rören på is tills ryggmärgen och DRG är avsuddas ytterligare.
4. Ryggmärg och DRG extraktion
OBS: Extrahera ryggmärgen och DRG från kotpelaren direkt efter musdissektion. Protokollet för ryggmärgs- och DRG-extraktion har anpassats från en tidigare publikation7.
- Ta bort kotpelaren från iskall PBS-röret och ta bort kvarvarande mjuka vävnader, vilket blir lättare efter kylning.
- Gör tre tvärgående snitt i kolonnen genom kotorna (T1, L1 och S2 nivåer) med hjälp av ett rakblad. Placera de tre bitarna i en 15 mm petriskål som innehåller steril iskallt PBS. Håll spår och markera ursprung segment för senare analys.
- Ta ett segment och säkra den mellan pincett, dorsala sidan uppåt. Gör en enda, längsgående skär ner genom mittlinjen med hjälp av ett rakblad, dela kolumnen i två lika stora halvor.
- Placera båda halvorna i en ny petriskål som innehåller nya sterila iskalla PBS. Se till att segmentets orientering är korrekt för att kunna skilja mellan vänster och höger sida.
- Under ett dissekerande mikroskop, skala försiktigt ryggmärgen ur kotpelaren från varje halv i en rostral till caudal riktning med hjälp av fina pincett.
- Samla båda ryggmärgshalvorna i 1,5 ml mikrorör som innehåller 500 μL sterila iskalla PBS. Håll rören på is.
- Ta försiktigt bort hjärnhinnorna från ena sidan av ryggraden till den andra för att exponera DRG.
- Ta bort varje DRG individuellt genom att ta tag i den exponerade ryggraden och dra den försiktigt ut ur ryggraden. Placera den uppsamlade DRG i en 15 mm petriskål som innehåller iskall PBS. Skörda alla ensidiga och kontralaterala DRG separat från ryggradssegmentet och fortsätt enligt beskrivningen i steg 4.5.
OBS: DRG är synlig som en rund transparent struktur längs den vita spinalnerven. - Upprepa steg 4.3–4.7 med de två andra ryggradssegmenten inom 30–45 minuter.
- Centrifugera alla rör med hög hastighet (17 900 x g)i 3 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatant och blixtfrysa rör i flytande kväve. Förvara rören vid -80 °C för ytterligare vävnadshomogenisering.
- Alternativt, fixa och dela upp den rengjorda DRG och andra musvävnader för histopatologiska analyser och/eller immunofluorescensfärgning efter steg 4.9.
5. Homogenisering av vävnader
- Tina rören som innehåller frysta vävnadsprover på is.
- Väg 100 mg vävnad och placera den i ett 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller en steril stålpärla och 500 μl RIPA-buffert som innehåller 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS och proteascocktail inhibitor tabletter.
- Stör vävnader vid rumstemperatur (RT) med hjälp av en homogenisator vid 20 cykler/s i 2 min, följt av en väntetid på 1 min, sedan 20 cykler/s i 2 min.
- Centrifugera röret med hög hastighet (17 900 x g)i 10 min vid RT.
- Samla upp supernatant (500 μL) i ett nytt rör och förvara det vid -20 °C tills elisa och qPCR utför elisa och qPCR för att kvantifiera inflammatoriska markörer respektive virusbelastningar.
OBS: För qPCR, samla alla prover med RNase-fritt material (dvs. pärlor, rör, etc.) och störa vävnader med RNA-lysbuffert som innehåller 1% betamerkaptoetanol (Tabell över material).
6. Beredning och immunofluorescensfärgning av frysta DRG-sektioner
- Vävnadsbehandling
- Fixera dissekeras och rengöras DRG i 1% paraformaldehyd (PFA) för 2 h vid RT.
- Överför vävnaden till ett 15 ml-rör med 10% sackaros i PBS. Inkubera över natten vid 4 °C.Inkubate overnight at 4 °C.
- Överför vävnaden till ett 15 ml-rör med 20% sackaros i PBS. Inkubera över natten vid 4 °C.Inkubate overnight at 4 °C.
- Överför vävnaden till ett 15 ml-rör med 30% sackaros i PBS. Inkubera över natten vid 4 °C.Inkubate overnight at 4 °C.
- Bädda in vävnader i OCT med hjälp av en cryomold och placera block i torris för snabb frysning.
- Förvara proverna vid -80 °C tills de används.
- Förberedelse av kryosektion
- Ta bort det frusna blocket från -80 °C och låt det balansera i kryostatkammarens temperatur i 30 minuter.
- Kryposektion DRG med en tjocklek av 15 μm och montera sektionerna på diabilder.
- Använd en penna för att rita en hydrofoba cirkel runt den rutmonterade vävnaden.
- Håll rutschbanorna vid 4 °C tills färgningen.
- Immunofluorescensfärgning
- Tvätta DRG sektionerna 3x i PBS i 10 min på RT.
- Inkubera sektionerna med 100 μL önskad primär antikropp (t.ex. musantikropp mot PRV glykoprotein B) i 1 h vid 37 °C. Späd den primära antikroppen i PBS som innehåller 10% negativt getserum.
- Upprepa steg 6.3.1.
- Inkubera sektionerna med 100 μL önskad sekundär antikropp (getantimus Alexa Fluor 488) i 50 min vid 37 °C. Späd endast sekundär antikropp i PBS.
- Tillsätt 100 μl DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) färgämne utspädd i PBS på sektionen. Ytterligare inkubera prover 10 min vid 37 °C.
- Upprepa steg 6.3.1.
- Montera proverna med ett fluorescensmonteringsmedium på glasglas och säkra och täck med täckglas.
7. Beredning och H&E-färgning av paraffininbäddade vävnadssektioner
- Fixera vävnaden i 10% formalin för 24 h vid 4 °C.
- Utför standardbehandlingsschema för paraffininbäddning och snittning av fasta vävnader. Överför fasta vävnader till 70 % etanol och bearbeta genom uppgraderade alkoholer till xylen följt av paraffin, som tidigare beskrivits8.
OBS: Använd polyestersvampar för att hålla små vävnadsprover som DRG inuti kassetter. - Utför standarddeparaffinering följt av H&E-färgning av vävnadssektioner, som tidigare beskrivits9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen footpad inokulering modell möjliggör karakterisering av immunopathogenesis av alphaherpesvirus infektion in vivo, inklusive replikering och spridning av infektionen från inokulerade footpad till nervsystemet och induktion av specifika neuroinflammatoriska svar.
I denna studie avökade vi först musen hind footpad och antingen mock-inokulerade eller inokulerade den avlånga regionen med en virulent stam av PRV (PRV-Becker). Platsen för nötning var synlig i kontroll fotplattan. En skorpa bildades vid nötningsplatsen som en del av läkningsprocessen (figur 1, svart pil). Däremot visade möss inokulerade med PRV allvarlig inflammation vid humana endpoint (82 hpi), kännetecknas av svullnad av footpad och rodnad.
Efter footpad inokulering med virulent PRV-Becker stam, möss började visa kliniska tecken på 72 hpi, kännetecknas av svullnad av inokulerade footpad och allt oftare skakningar. Genom 82 hpi, PRV-Becker infekterade möss visade konstant skakningar i inokulerade benet och särskiljande PRV symtom, inklusive intensiv repor och bita i foten. Svår inflammation observerades också i footpad. Det inflammatoriska svaret som inducerades under PRV-infektion karakteriserades sedan ytterligare, inklusive infiltration av immunceller i vävnader.
Histopatologiska undersökning av flera vävnader utfördes, inklusive inokulerade footpad och DRG, följt av H & E färgning av paraffin-inbäddade vävnad sektioner. Epidermal nekros och svår hudinflammation (ödem och fibrin) observerades i PRV-infekterade fotsektioner (figur 2A, panel b). Epidermis, dermis och bindväv av infekterade möss visade en massiv infiltration av neutrofiler (identifieras av multilobed kärnor) markerade med svarta pilar. Fotplattor av kontrollmöss var normala (figur 2A, panel a). PRV-infekterade DRG visade minimal neuronal nekros och blandad inflammation hos infekterade möss medan DRG av kontrollmöss var normala (Figur 2B, paneler a och b). Den blandade inflammation infiltrate bestod främst av neutrofiler och lymfocyter.
Därefter kinetiken av inflammatoriska cytokin produktion i mus vävnad efter PRV footpad inokulering fastställdes. Nivåer av specifika inflammatoriska cytokiner kvantifierades (dvs interleukin-6 [IL-6] och granulocyte-koloni stimulerande faktor [G-CSF]) från flera vävnader som samlats in och homogeniseras från kontroll och PRV-infekterade möss. Resultaten visade en signifikant ökning av G-CSF-nivåerna i fotplattan och DRG jämfört med kontroller vid 7 hpi och 82 hpi (figur 3A). Betydande G-CSF nivåer observerades vid 82 hpi i ryggmärgen, hjärnan, hjärtat och levervävnad av PRV-infekterade möss jämfört med kontroller. Dessutom upptäcktes signifikanta IL-6-nivåer i alla vävnader av PRV-infekterade möss jämfört med kontroller som börjar vid 24 hpi (figur 3B).
Footpad inokulering modellen användes ytterligare för att undersöka PRV replikering och sprids från inokulerade footpad till PNS och CNS och potentiella korrelationer med neuroinflammatory svar utveckling. PRV laster kvantifierades i flera homogeniserade vävnader av qPCR att förstärka PRV DNA. DNA-koncentrationen omvandlades sedan till PFU, som tidigare beskrivits10. PRV laster upptäcktes i fotplattan börjar på 24 hpi (~ 1 x 104 PFU/mg vävnad) och i DRG börjar vid 60 hpi (~ 1 x 103 PFU/mg vävnad; data visas inte).
I ett döende tillstånd (82 hpi), PRV upptäcktes i footpad, DRG, ryggmärg, och hjärnan, med den högsta koncentrationen av PRV i DRG (~ 1 x 105 PFU/mg vävnad; Bild 4). PRV infektion av DRG bekräftades av indirekt immunofluorescence färgning av DRG cryosections. PRV infektion upptäcktes i DRG nervceller med anti-PRV gB antikroppar. PRV glykoprotein gB uttrycktes under sena stadier av infektion i cytoplasma av infekterade celler. Som väntat bekräftades det cytoplasmatiska uttrycket för PRV gB (grön) i infekterad DRG, medan inget gB uttrycktes i kontrollprover (figur 5). Cellkärnor identifierades med DAPI färgning (blå).
Figur 1: Representativa bilder av mus höger baktassar efter PRV inokulering. Möss är antingen mock-inokulerade eller inokulerade med PRV i den slipade högra hind footpad. PRV-inokulerad fotplatta visar tecken på inflammation, inklusive rodnad och svullnad vid humant endpoint (82 hpi). Fotplattan av kontrollmöss verkar normalt med en mörkröd skorpa på den slipade platsen, vilket indikerar att såren läker. Svarta pilar indikerar nötningsplatsen. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Histopatologiska resultaten i footpad och DRG efter PRV footpad inokulering. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning av(A)mus inokulerade fotplattor och (B) och ipsilateral DRG från kontroll (panel a) och PRV-infekterade (panel b) möss på 82 hpi. Histopatologiska manifestationer observerats i PRV-infekterade vävnader (epidermal och neuronal nekros och neutrofil infiltration) är frånvarande från alla undersökta mock-infekterade möss. Resultaten är representativa för tre biologiska replikat för en viss typ av vävnad. Svarta pilar indikerar representativa områden av inflammation med immuncellinfiltration. Skalstaplar (50 μm) anges för varje bild. Denna siffra har ändrats från11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kinetik av inflammatorisk cytokinproduktion i homogeniserade musvävnader efter PRV-fotuddinokuulation. (A)G-CSF och(B)IL-6 proteinnivåer som detekteras i PRV-infekterade (röda) och kontroll (svart) mus homogeniserade vävnader vid olika hpi. Proteinnivåerna kvantifieras av ELISA och uttrycks som pikogram (pg) per milligram (mg) homogeniserad vävnad (n = 5 per grupp, *p < 0,05, ns = inte signifikant). Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantifiering av PRV-genom i mushomogeniserade vävnader. PRV DNA kvantifieras i homogeniserade musvävnader genom qPCR med HJÄLP AV PRV UL54 grundfärger. PRV-belastningar uttrycks som plackbildande enheter (PFU) per mg vävnad. PRV DNA detekteras endast i foten, DRG, ryggmärg och hjärna (och inte i andra vävnader), n = 10 per grupp. Streckad linje visar identifieringsgränsen. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bedömning av PRV-infektion i DRG nervceller genom immunofluorescens färgning. Confocal Z-stack bilder av mock- och PRV-infekterade DRG nervceller efter immunofluorescens färgning med hjälp av en mus antikropp specifik för PRV gB (grön). Cellkärnor färgas med DAPI (blå, paneler a och c). Panel d visar flera PRV-infekterade nervceller som uttrycker gB (vita pilar). Inget gB-uttryck detekteras i kontroll-DRG-sektionerna (panel b). Skalstaplar (50 μm) anges för varje bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Footpad inokulering modell som beskrivs här är användbart för att undersöka inledandet och utvecklingen av neuroinflammatory svar under alphaherpesvirus infektion. Dessutom används denna in vivo-modell för att fastställa kinetiken för replikering och spridning av alphaherpesvirus från PNS till CNS. Detta är en alternativ till andra inokulering modeller, såsom flanken huden inympning modell, som bygger på djup dermal repor13, eller intrakraniell väg, som direkt introducerar viruset i CNS14,15,16. Som ett resultat, med footpad modellen, är det möjligt att få en mer detaljerad bedömning av viral kinetik av replikering och sprids med tillhörande lokala och avlägsna immunopatologiska processer i nervsystemet11,12.
I detta protokoll, nötning av footpad och efterföljande viral inokulering är avgörande steg. I själva verket måste stratum corneum tas bort helt efter tillräcklig nötning för att exponera stratum basale till viral inokulat för framgångsrik infektion. Dock måste nötningen vara mild och inte framkalla blödning, eftersom detta hjälper till att förhindra infektion i blodcirkulationen. Det fristående stratum corneum kan visualiseras genom H & E färgning under ljus mikroskopi. Hornhinnan som finns i stratum corneum är platta, eosinofila celler som saknar kärnor. Volymen av det virala inokulatet (20 μL droppe) har optimerats för att säkerställa att droppen stannar kvar på fotplattan och täcker det abraded platsen. Försiktigt gnugga inokulat droppen på den slipade footpad är viktigt för effektiv viruspenetration. Det rekommenderas att vänta tills fotplattan är helt torr för att stoppa anestesi och placera djuret i en ny bur. Detta steg kommer att undvika musen från att slicka viral inoculum utanför den slipade footpad. Det rekommenderas att bearbeta högst tre möss samtidigt, med hjälp av en näsa kon som är inställd på att utsätta dem samtidigt för anestesi.
När du utför musdissektionen är det viktigt att göra skärsår parallellt med kotpelaren, vilket förhindrar skador på ryggmärgen och tillhörande DRG. Det föreslås också att ta bort så mycket fett, muskler, och mjukvävnad som möjligt för att minska oavsiktlig skärning i ryggraden och underlätta ett bättre grepp om kolonn segmentet med pincett innan du skär ner mittlinjen.
Det rekommenderas också att utföra tvärgående skärsår genom kotpelaren mellan skivorna för att producera rengjorda kolonnsegment och begränsa risken för att drg-par skadas. Hjärnhinnorna som omger ryggmärgen och täcker DRG måste avlägsnas helt för att underlätta identifiering och extraktion av DRG. DRG bör avlägsnas försiktigt från ryggraden utan skador från pincetten. Det är viktigt att DRG förblir intakt för H&E och immunofluorescensfärgning. Timing är avgörande för effektiviteten i detta in vivo experiment, och musen dissekering och ryggmärg / DRG utvinning bör utföras i följd för att samla vävnad som är så färsk som möjligt.
Vävnadshomogeniseringsmetoden som beskrivs här har optimerats för att säkerställa effektiva störningar av ett stort antal heterogena vävnadsprover. Det är av största vikt att standardisera mängden vävnad som används, vilket möjliggör direkt jämförelse av ELISA och qPCR-resultat mellan proverna. Till exempel, Det föreslås att väga 100 mg vävnad för varje homogenisering förfarande. Varje vävnadsprov måste homogeniseras i sin helhet, och rester får inte frysas upp. Det är viktigt att autoklavera stålpärlor och pincett före användning för att undvika kontaminering under homogenisering. En volym på 500 μL är optimal för att säkerställa fullständig homogenisering av ett 100 mg vävnadsprov. Det är viktigt att notera att denna begränsade volym endast tillåter bearbetning av tre till fyra ELISA-satser per prov.
Med hjälp av footpad inokulering modell, det visades att PRV infektion hos möss inducerar svår inflammation, kännetecknas av neutrofil infiltration i footpad och DRG. Höga koncentrationer av inflammatoriska cytokiner G-CSF och IL-6 upptäcktes också i många homogeniserade vävnader med ELISA. Dessutom konstaterades en stark korrelation mellan PRV gen och protein uttryck (genom qPCR och OM färgning) i DRG och produktionen av både pro-inflammatoriska cytokiner.
Denna modell är lämplig att jämföra kinetiken av viral replikering/spridning samt neuroinflammatoriska svar mellan olika alphaherpesvirus infektioner. När det till exempel gäller VZV har den begränsade värds specificiteten och bristen på klinisk sjukdom begränsat användningen av djurmodeller17. Därför kan musen fotplattan PRV inokulering modell representerar en ny djurmodell för studier av cellulära och molekylära mekanismer som ansvarar för neuropatisk klåda hos patienter med post-herpetiska skador. Baserat på likheterna i kliniska tecken, patogenes och genom mellan VZV och PRV, man tror att denna mus modell kommer att öka förståelsen av VZV patogenes och leda till utvecklingen i innovativa terapeutiska strategier.
Slutligen kommer modellen att vägleda forskning om perifera neuropatier, såsom multipel skleros och tillhörande viral-inducerad skada på PNS18. Patogenesen vid flera neurotropa virus (dvs rabiesvirus, poliovirus, West Nile-virus, Zika virus), som är kända för att infektera PNS, kan också studeras med hjälp av denna modell19,20,21,22. Fotplattans inokuleringsmodell kan användas som ett möjligt kostnadseffektivt verktyg för läkemedelsutveckling. Till exempel, Det kan fungera som en plattform för att skärmen och testa effekten av antiinflammatoriska och antivirala läkemedel för att förhindra viral-inducerad perifera neuropatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Charles River laboratorier för deras utmärkta tekniska stöd utför histopathology analyser. Detta arbete finansierades av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 och RO1 NS060699). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
