Summary
Il modello di inoculazione del footpad è uno strumento prezioso per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie indotte da virali in vivo. In particolare, fornisce una valutazione chiara della cinetica virale e dei processi immunopatologici associati avviati nel sistema nervoso periferico.
Abstract
Questo protocollo descrive un modello di inoculazione del footpad utilizzato per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus nei topi. Poiché gli alfaherppi sono i principali invasori del sistema nervoso periferico (PNS), questo modello è adatto a caratterizzare la cinetica della replicazione virale, la sua diffusione dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad consente alle particelle di virus di diffondersi da un sito di infezione primaria nell'epidermide del footpad alle fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e la dermide. L'infezione si diffonde attraverso il nervo sciatico ai gangli della radice dorsale (DRG) e, infine, attraverso il midollo spinale al cervello. Qui, un piede di topo è inoculato con pseudorabies virus (PRV), un virus alfaherpesvirus strettamente correlato al virus dell'herpes simplex (HSV) e del virus varicella-zoster . Questo modello dimostra che l'infezione da PRV induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie vengono successivamente rilevate nei tessuti omogeneizzati da ELISA. Inoltre, si osserva una forte correlazione tra l'espressione genica e proteica PRV (tramite qPCR e colorazione IF) nella DRG e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, il modello di inoculazione del footpad fornisce una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte da alfaancorato e può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Inoltre, il modello può guidare la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e il danno ai virali associato al PNS. In definitiva, può servire come uno strumento in vivo conveniente per lo sviluppo di farmaci.
Introduction
Questo studio descrive un modello di inoculazione del footpad per studiare la replica e la diffusione dei virus dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad è stato utilizzato intensamente per studiare l'infezione da alfaherpesvirus nei neuroni1,2,3. L'obiettivo principale di questo modello è quello di consentire ai virus neurotropici di percorrere una distanza massima attraverso il PNS prima di raggiungere il SNC. Qui, questo modello viene utilizzato per ottenere nuove intuizioni nello sviluppo di un particolare neuropatia (prurito neuropatico) in topi infettati da pseudorabies virus (PRV).
Il PRV è un alfaintovirus correlato a diversi patogeni ben noti (cioè herpes simplex di tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e virus varicella-zoster [VV]), che causano herpivi di freddo, lesioni genitali e varicella, rispettivamente4. Questi virus sono tutti pantropici e in grado di infettare molti diversi tipi di cellule senza mostrare affinità per un tipo di tessuto specifico. Tuttavia, tutti presentano un caratteristico neurotropismo invadendo il PNS (e occasionalmente, il CNS) delle specie ospiti. L'ospite naturale è il maiale, ma il PRV può infettare la maggior parte dei mammiferi. In questi ospiti non naturali, PRV infetta il PNS e induce un forte prurito chiamato "prurito pazzo", seguito da morte peracuta5,6. Il ruolo della risposta neuroimmune nell'esito clinico e nella patogenesi dell'infezione da PRV è stato poco compreso.
Il modello di inoculazione del footpad consente a PRV di avviare l'infezione nelle cellule epidermiche del footpad. Quindi, l'infezione si diffonde in fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e il derma. L'infezione si diffonde da particelle di virus che si muovono attraverso il nervo sciatico al DRG entro circa 60 h. L'infezione si diffonde attraverso il midollo spinale, raggiungendo infine il cervello posteriore quando gli animali diventano moribondi (82 h dopo l'infezione). Durante questa finestra temporale, i campioni di tessuto possono essere raccolti, elaborati e analizzati per la replicazione del virus e marcatori della risposta immunitaria. Ad esempio, l'esame istologico e la quantificazione del carico virale possono essere eseguiti in diversi tessuti per stabilire correlazioni tra l'avvio e lo sviluppo di processi clinici, virologici e nevrinfiammatori nella patogenesi PRV.
Utilizzando il modello di inoculazione del pedebole, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari del prurito indotta da PRV nei topi. Inoltre, questo modello può fornire nuove informazioni sull'avvio e lo sviluppo di neuroinfiammazioni indotte da virus durante le infezioni da herpesvirus. Una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte dall'alfadante può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Ad esempio, questo modello è utile per studiare i meccanismi del prurito neuropatico nei pazienti con lesioni post-epetiche (ad esempio, herpes zoster, heringles) e testare nuovi bersagli terapeutici nei topi per le corrispondenti malattie umane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità a un protocollo (numero 2083-16 e 2083-19) esaminato e approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituzione (IACUC) dell'Università di Princeton. Questo lavoro è stato fatto seguendo rigorosamente i requisiti di livello di biosicurezza-2 (BSL-2), a cui abbiamo un laboratorio completamente attrezzato approvato dal comitato per la biosicurezza dell'Università di Princeton. Le procedure, tra cui l'abrasione del piede del topo, l'inoculazione virale, la dissezione del topo e la raccolta dei tessuti, sono state eseguite in un mobile di sicurezza biologica (BSC) nella sala per animali di biocontenimento dell'Università di Princeton. Coloro che eseguivano la procedura indossavano abiti usa e getta, copricapo, protezione degli occhi, guanti sterili, maschere chirurgiche e copriscarpe.
1. Abrasione del piede del mouse
- Anestetizza un topo C57BL/6 (5-7 settimane) con anestetico a gas isoflurano, consegnato ad un dosaggio del 3% tramite un piccolo sistema di anestesia (camera).
- Posizionare il topo nel piano chirurgico dell'anestesia sulla schiena, prima dell'inoculazione, nel piede posteriore. Fissare un cono naso con un diaframma (una scianda sufficientemente dimensionata per adattarsi al muso dell'animale) al topo e fornire anestetico gasisco isoflurane a un dosaggio costante di 1,5%–2,0%.
- Monitorare attentamente il mouse per una risposta allo stimolo doloroso creato da un forte pizzico della punta con pinze.
- Afferra leggermente un pedana posteriore con pinze piatte.
- Abrade delicatamente la pelle glavante del piede posteriore circa 20x, tra il tallone e le pastiglie, con una tavola emery (100–180 grinta). Non indurre il sanguinamento da abradere troppo frequentemente o applicando troppa pressione.
- Utilizzando pinze sottili, lentamente staccare lo strato corneo staccato dall'abrasione per esporre lo strato basale.
2. Inoculazione del pedolo PRV
- Preparare l'inoculum del virus diluito al timetro desiderato nel supporto DMEM contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomycin (Tabella dei materiali).
- Quantificate il numero di unità di formazione di placche (PFU) nello stock di virus sulle cellule PK15 per calcolare e standardizzare la dose virale e diluire di conseguenza l'inoculo virale.
NOTA: In questo studio, ceppo virulento di PRV (PRV-Becker) è stato utilizzato ad una dose di 8 x 106 PFU. Questa dose è stata ottimizzata in un precedente esperimento preliminare per garantire che tutti gli animali inoculati mostrasse sintomi clinici a 82 ore dopo l'inoculazione (hpi). - Mantenere il virus inoculum sul ghiaccio e mescolare delicatamente prima dell'uso.
- Quantificate il numero di unità di formazione di placche (PFU) nello stock di virus sulle cellule PK15 per calcolare e standardizzare la dose virale e diluire di conseguenza l'inoculo virale.
- Aggiungere una goccia di 20 litri di inoculum del virus (8 x 106 PFU) sul footpad abrato (amministrazione topica). Eseguire inoculazioni fittizie (solo medie) in parallelo.
- Strofinare delicatamente 10x con l'albero di un ago per facilitare l'adsordimento del virus. Evitare di graffiare con l'ago. Ripetere questo passaggio ogni 10 min.
- Tenere il mouse sotto anestesia per 30 min fino a quando il piede abrabraded è asciutto.
- Dopo aver interrotto l'anestesia, monitorare il mouse fino a quando non può mantenere la recumbenza sternale e posizionarlo in una gabbia individuale per il follow-up clinico e il campionamento.
3. Dissezione del topo e raccolta dei tessuti
- Nei momenti appropriati dopo l'infezione, eutanasia il topo con il metodo di asfissia (CO2).
NOTA: In questo studio, l'endpoint umano (quando gli animali iniziano a presentare sintomi terminali) per i topi infetti da PRV-Becker è 82 hpi. Eutanasia controllare gli animali in parallelo. - Posizionare il lato ventrale del topo rivolto verso l'alto su un tappetino chirurgico utilizzando aghi/spill. Fissare gli arti del topo con perni a una scheda di schiuma chirurgica. Sorrida il lato ventrale del topo con il 70% di etanolo per ridurre al minimo la contaminazione della pelliccia.
- Pizzicare lo strato esterno di pelliccia e pelle con pinze e fare una piccola incisione iniziale utilizzando forbici fini vicino all'apertura uretrale.
- Da questa apertura, continuare l'incisione sul lato ventrale medio fino al mento.
- Estendere due incisioni laterali verso le estremità degli arti anteriori e degli arti posteriori.
- Separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e fissare verso il basso di lato.
- Aprire la cavità addominale e incise fino alla base del torace. Completare l'apertura della cavità addominale facendo due incisioni trasversali.
- Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma e le costole su entrambi i lati laterali.
NOTA: Tagliare i lati della gabbia toracica previene il rischio di tagliare il cuore. - Raccogliere organi esposti, tra cui cuore, polmoni, milza, pancreas, fegato, reni, e vescica in 1,5 mL microtubi. Tenere i tubi sul ghiaccio.
- Tagliare il piede abraso tra il tallone e le pastiglie e posizionare il pezzo di tessuto in un tubo come descritto al punto 3.3.6.
- Posizionare il lato dorsale del topo verso l'alto e umidare la pelliccia con il 70% di etanolo. Tagliare lo strato della pelle per esporre la colonna vertebrale.
- Fare una piccola incisione nella regione del bacino. Strisciare la pelle dagli arti posteriori verso la testa.
- Rimuovere le gambe e le braccia tagliando con le forbici parallele e vicine alla colonna vertebrale su entrambi i lati.
- Tagliare la testa alla base del cranio (livello C1-C2).
- Tagliare il cranio con le forbici dal forame magnum all'osso frontale.
- Tirare aprire il cranio in direzioni laterali utilizzando pinze.
- Scoop delicatamente il cervello utilizzando la pinze e procedere come descritto nel passaggio 3.3.6.
- Pulire la colonna vertebrale tagliando muscoli, grassi e tessuti molli utilizzando forbici curve. Taglia la coda. Collocare la colonna vertebrale intatta in un tubo da 15 mL contenente una salina sterile con tamponamenti di fosfato a freddo ghiaccio (PBS). Tenere i tubi sul ghiaccio fino a quando non ulteriore dissezione del midollo spinale e DRG.
4. Estrazione del midollo spinale e DRG
NOTA: Estrarre il midollo spinale e il DRG dalla colonna vertebrale direttamente dopo la dissezione del mouse. Il protocollo per l'estrazione del midollo spinale e drG è stato adattato da una precedente pubblicazione7.
- Rimuovere la colonna vertebrale dal tubo PBS ghiacciato e rimuovere i tessuti molli rimanenti, che diventa più facile dopo la refrigerazione.
- Fai tre tagli trasversali nella colonna attraverso le vertebre (livelli T1, L1 e S2) usando una lama di rasoio. Mettere i tre pezzi in una teglia Petri da 15 mm contenente pbS sterile freddo ghiaccio. Tieni traccia e contrassegna l'origine dei segmenti per un'analisi successiva.
- Prendi un segmento e fissalo tra le pinze, il lato dorsale rivolto verso l'alto. Fare un singolo, longitudinale tagliato attraverso la linea mediana utilizzando una lama di rasoio, dividendo la colonna in due metà uguali.
- Collocare entrambe le metà in una nuova parabola Petri contenente un nuovo PBS sterile ghiacciato. Assicurarsi che sia corretto l'orientamento del segmento per poter distinguere i lati sinistro e destro.
- Sotto un microscopio dissecinte, sbucciare delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale da ogni metà in una direzione rostrale a caudale utilizzando pinze sottili.
- Raccogliere entrambe le metà del midollo spinale in microtubi da 1,5 mL contenenti 500 - L di PBS sterile a freddo ghiaccio. Tenere i tubi sul ghiaccio.
- Rimuovere delicatamente le meningi da un lato della colonna vertebrale all'altro per esporre il DRG.
- Rimuovere ogni DRG singolarmente afferrando il nervo spinale esposto e tirarlo delicatamente fuori dalla colonna vertebrale. Collocare il DRG raccolto in una piastra Petri da 15 mm contenente PBS ghiacciato. Raccogliere tutte le DRG ipsilaterali e contralaterali separatamente dal segmento della colonna vertebrale e procedere come descritto al punto 4.5.
NOTA: Il DRG è visibile come una struttura rotonda trasparente lungo il nervo spinale bianco. - Ripetere i passaggi da 4,3 a 4,7 utilizzando gli altri due segmenti della colonna vertebrale entro 30-45 min.
- Centrifugare tutti i tubi ad alta velocità (17.900 x g) per 3 min a 4 gradi centigradi.
- Tubi supernatali aspirati e flash-congelano in azoto liquido. Conservare i tubi a -80 gradi centigradi per un'ulteriore omogeneizzazione dei tessuti.
- In alternativa, fissare e sezionare il DRG pulito e altri tessuti del topo per le analisi istopatologiche e/o la colorazione dell'immunofluorescenza dopo il passaggio 4.9.
5. omogeneizzazione dei tessuti
- Scongelare i tubi contenenti campioni di tessuto congelato sul ghiaccio.
- Pesare 100 mg di tessuto e posizionarlo in un tubo di microcentrifuga da 2 mL contenente un tallone d'acciaio sterile e 500 -L di buffer RIPA contenente 0,5 M EDTA (pH 8,0), 1 M Tris-HCl (pH - 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS e compresse di inibitori protease cocktail.
- Interrompere i tessuti a temperatura ambiente (RT) utilizzando un omogeneizzatore a 20 cicli / s per 2 min, seguito da un periodo di attesa di 1 min, poi 20 cicli / s per 2 min.
- Centrifugare il tubo ad alta velocità (17.900 x g) per 10 min a RT.
- Raccogliere supernatali (500 ) in un nuovo tubo e conservarlo a -20 gradi centigradi fino a quando non esegue ELISA e qPCR per quantificare i marcatori infiammatori e i carichi virali, rispettivamente.
NOTA: Per qPCR, raccogliere tutti i campioni con materiale privo di RNase (ad esempio, perline, tubi, ecc.) e interrompere i tessuti con buffer di lisiRNA contenente 1% betamercaptoetanolo (Tabella dei materiali).
6. Preparazione e colorazione dell'immunofluorescenza delle sezioni DRG congelate
- Lavorazione dei tessuti
- Fissare il DRG sezionato e pulito in 1% paraformaldeide (PFA) per 2 h a RT.
- Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con saccarosio al 10% in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con il 20% di saccarosio in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con il 30% di saccarosio in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Incorporare i tessuti nello Strumento di personalizzazione di Office utilizzando un criomuffone e posizionare blocchi nel ghiaccio secco per un congelamento rapido.
- Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino all'uso.
- Preparazione alla criosezione
- Togliere il blocco congelato da -80 gradi e lasciarlo eclacazione nella temperatura della camera criostat per 30 min.
- Criosezione il DRG con uno spessore di 15 m e montare le sezioni su vetrini.
- Utilizzare una penna per disegnare un cerchio idrofobico intorno al tessuto montato su scivolo.
- Tenere i vetrini a 4 gradi centigradi fino a colorazione.
- Colorazione immunofluorescenza
- Lavare le sezioni DRG 3x in PBS per 10 min a RT.
- Incubare le sezioni con 100 l dell'anticorpo primario desiderato (ad esempio, anticorpo murino contro glicoproteina B PRV) per 1 h a 37 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo primario in PBS contenente il 10% di siero di capra negativo.
- Ripetere il passaggio 6.3.1.
- Incubare le sezioni con 100 l dell'anticorpo secondario desiderato (capra anti-topo Alexa Fluor 488) per 50 min a 37 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo secondario solo in PBS.
- Aggiungere 100 -L di colorante DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) diluito in PBS sulla sezione. Ulteriori campioni di incubatura 10 min a 37 .
- Ripetere il passaggio 6.3.1.
- Montare i campioni utilizzando un supporto di montaggio a fluorescenza su vetrini di vetro e fissare e coprire con coverslip.
7. Preparazione e colorazione H&E delle sezioni di tessuto incorporate in paraffina
- Fissare il tessuto in formalina del 10% per 24 h a 4 gradi centigradi.
- Eseguire la pianificazione di elaborazione standard per l'incorporamento paraffina e la sezionamento di tessuti fissi. Trasferire tessuti fissi al 70% di etanolo e processo attraverso alcoli aggiornati a xilene seguito da paraffina, come descritto in precedenza8.
NOTA: Utilizzare spugne in poliestere per tenere piccoli campioni di tessuto come DRG all'interno delle cassette. - Eseguire la deparaffinizzazione standard seguita dalla colorazione H&E delle sezioni di tessuto, come descritto in precedenza9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il modello di inoculazione del piede del mouse consente la caratterizzazione dell'immunopatogenesi dell'infezione da alfarevirus in vivo, compresa la replicazione e la diffusione dell'infezione dal footpad inoculato al sistema nervoso e l'induzione di specifiche risposte neuroinfiammatorie.
In questo studio, abbiamo prima abraso il piede posteriore del topo e sia finto-inoculato o inoculato la regione abrasa con un ceppo virulento di PRV (PRV-Becker). Il sito di abrasione era visibile nella pedana di controllo. Una crosta si è formata nel sito di abrasione come parte del processo diguarigione( Figura 1 , freccia nera). Al contrario, i topi inoculati con PRV hanno mostrato una grave infiammazione al punto finale umano (82 hpi), caratterizzata da gonfiore del footpad e arrossamento.
Dopo l'inoculazione del footpad con il ceppo virulento PRV-Becker, i topi hanno iniziato a mostrare segni clinici a 72 hpi, caratterizzati da gonfiore del footpad inoculato e tremori sempre più frequenti. Con 82 hpi, i topi infetti da PRV-Becker hanno mostrato continui tremori nella gamba inocuata e sintomi distintivi di PRV, tra cui graffi intensi e morsi del piede. Grave infiammazione è stata osservata anche nel footpad. La risposta infiammatoria indotta durante l'infezione da PRV è stata poi ulteriormente caratterizzata, compresa l'infiltrazione delle cellule immunitarie nei tessuti.
È stato eseguito un esame istopatologico di diversi tessuti, tra cui la pedana inocuizzata e la DRG, seguita dalla colorazione H&E delle sezioni di tessuto incorporate in paraffina. Necrosi epidermica e grave infiammazione dermica (edema e fibrina) sono state osservate nelle sezioni del piede infettate da PRV(Figura 2A, pannello b). L'epidermide, il dermide e i tessuti connettivi dei topi infetti hanno mostrato una massiccia infiltrazione di neutrofili (identificata da nuclei multilobed) contrassegnati con frecce nere. Le pedane dei topi di controllo erano normali (Figura 2A, pannello A). DrG infetto da PRV ha mostrato una necrosi neuronale minima e un'infiammazione mista nei topi infetti, mentre il DRG dei topi di controllo era normale (Figura 2B, pannelli a e b). L'infiltrato di infiammazione misto consisteva principalmente di neutrofili e linfociti.
Successivamente, sono state stabilite le cinete della produzione infiammatoria di citochina nel tessuto del topo dopo l'inoculazione del piede PRV. Sono stati quantificati i livelli di citochine infiammatorie specifiche (cioè interleuchina-6 [IL-6] e fattore stimolante della colonia di granulociti [G-CSF]) da diversi tessuti raccolti e omogeneizzati dal controllo e dai topi infettati da PRV. I risultati hanno dimostrato un aumento significativo dei livelli di G-CSF nel footpad e nel DRG rispetto ai controlli a 7 hpi e 82 hpi (Figura 3A). Livelli significativi di G-CSF sono stati osservati a 82 hpi nel midollo spinale, cervello, cuore, e tessuto epatico di topi infettati DA PRV rispetto ai controlli. Inoltre, sono stati rilevati livelli significativi di IL-6 in tutti i tessuti di topi infettati da PRV rispetto ai controlli a partire da 24 hpi (Figura 3B).
Il modello di inoculazione del pedone è stato ulteriormente utilizzato per studiare la replica e la diffusione del PRV dal pedana inoculato al PNS e al SNC e alle potenziali correlazioni con lo sviluppo della risposta neuroinfiammatoria. I carichi di PRV sono stati quantificati in diversi tessuti omogeneizzati da qPCR per amplificare il DNA PRV. La concentrazione del DNA è stata poi convertita in PFU, come descritto in precedenza10. I carichi di PRV sono stati rilevati nel footpad a partire da 24 hpi (1 x 104 PFU/mg di tessuto) e in DRG a partire da 60 hpi (1 x 103 PFU/mg di tessuto; dati non mostrati).
In uno stato moribondo (82 hpi), il PRV è stato rilevato nel footpad, nel DRG, nel midollo spinale e nel cervello, con la più alta concentrazione di PRV nella DRG (1 x 105 PFU/mg di tessuto; Figura 4). L'infezione da PRV di DRG è stata confermata dalla colorazione indiretta dell'immunofluorescenza delle criosezioni DRG. L'infezione da PRV è stata rilevata nei neuroni DRG usando anticorpi gB anti-PRV. PRV glofoproteina gB è stato espresso durante le fasi finali dell'infezione nel citoplasma delle cellule infette. Come previsto, l'espressione citoplasmica di PRV gB (verde) è stata confermata nel DRG infetto, mentre nessun gB è stato espresso in campioni di controllo (Figura 5). I nuclei cellulari sono stati identificati con la colorazione DAPI (blu).
Figura 1: Immagini rappresentative delle zampe posteriori destra del topo dopo l'inoculazione del PRV. I topi sono o inoculati o inoculati con PRV nel piede posteriore destro abrasito. Il pedaggio inoculato da PRV mostra segni di infiammazione, tra cui arrossamento e gonfiore al punto finale umano (82 hpi). Il piede dei topi di controllo appare normale con una crosta rossa scura sul sito abraso, che indica che la ferita sta guarendo. Le frecce nere indicano il sito di abrasione. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati istopatologici in footpad e DRG dopo l'inoculazione del footpad PRV. Ematossialina ed eosina (H&E) colorazione di (A) mouse inoculato footpads e (B) e IPsilateral DRG dal controllo (pannello a) e PRV-infettati (pannello b) mouse a 82 hpi. Le manifestazioni istopatologiche osservate nei tessuti infettati dal PRV (necrosi epidermica e neuronale e infiltrazione dei neutrofili) sono assenti da tutti i topi infettati finti esaminati. I risultati sono rappresentativi di tre repliche biologiche per un dato tipo di tessuto. Le frecce nere indicano aree rappresentative di infiammazione con infiltrazione immunitaria delle cellule. Per ogni immagine sono indicate barre di scala (50 m). Questa cifra è stata modificata a partire da11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Kinetics della produzione di citochina infiammatoria nei tessuti del topo omogeneizzati dopo l'inoculazione del piede PRV. (A) G-CSF e(B)IL-6 livelli di proteine rilevati nei tessuti omogenei del topo infettati da PRV (rosso) e controllo (nero) del topo a diversi dispositivi hpi. I livelli proteici sono quantificati da ELISA ed espressi come picogramma (pg) per milligrammo (mg) di tessuto omogeneizzato (n - 5 per gruppo, s< 0,05, ns - non significativo). Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione del genoma del PRV nei tessuti omogeneizzati del topo. Il DNA PRV viene quantificato nei tessuti murini omogeneizzati da qPCR utilizzando primer PRV UL54. I carichi di PRV sono espressi come unità di formazione della placca (PFU) per mg di tessuto. Il DNA PRV viene rilevato solo nel piede, nella DRG, nel midollo spinale e nel cervello (e non in altri tessuti), n - 10 per gruppo. La linea punteggiata indica il limite di rilevamento. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione dell'infezione da PRV nei neuroni DRG mediante colorazione immunofluorescenza. Confocalimmagini confocali di neuroni DRG infettati da mock e PRV dopo l'colorazione dell'immunofluorescenza utilizzando un anticorpo murino specifico per PRV gB (verde). I nuclei cellulari sono macchiati con DAPI (blu, pannelli a e c). Il pannello d mostra diversi neuroni infettati da PRV che esprimono gB (frecce bianche). Non viene rilevata alcuna espressione gB nelle sezioni DRG di controllo (pannello b). Per ogni immagine sono indicate barre di scala (50 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il modello di inoculazione del footpad descritto qui è utile per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus. Inoltre, questo modello in vivo viene utilizzato per stabilire la cinetica della replicazione e la diffusione di alfaherpesvirus dal PNS al SNC. Si tratta di un'alternativa ad altri modelli di inoculazione, come il modello di inoculazione della pelle del fianco, che si basa su graffi dermici profondi13, o il percorso intracranico, che introduce direttamente il virus nel CNS14,15,16. Di conseguenza, con il modello footpad, è possibile ottenere una valutazione più dettagliata della cinetica virale della replicazione e diffondersi con i processi immunopatologici locali e distanti associati nel sistema nervoso11,12.
In questo protocollo, l'abrasione del footpad e la successiva inoculazione virale sono passi cruciali. Infatti, lo strato corneo deve essere completamente rimosso dopo un'adeguata abrasione al fine di esporre lo strato basale all'inoculo virale per un'infezione di successo. Tuttavia, l'abrasione deve essere delicata e non indurre sanguinamento, in quanto ciò aiuta a prevenire l'infezione della circolazione sanguigna. Lo strato staccato corneo può essere visualizzato dalla colorazione H&E in microscopia leggera. I corneociti presenti nello strato corneo sono cellule piatte ed eosinofiliche prive di nuclei. Il volume dell'inoculum virale (20-L gocciola) è stato ottimizzato per garantire che la goccia rimanga sul pedone e copra il sito abraso. Strofinare delicatamente la goccia di inoculo sul footpad abrato è essenziale per una penetrazione virale efficiente. Si consiglia di attendere fino a quando il piede è completamente asciutto per fermare l'anestesia e posizionare l'animale in una nuova gabbia. Questo passo eviterà al mouse di leccare l'inoculum virale dal piede abraso. Si raccomanda di elaborare un massimo di tre topi contemporaneamente, utilizzando un cono naso che è impostato per esporli contemporaneamente all'anestesia.
Durante l'esecuzione della dissezione del topo, è importante fare tagli paralleli alla colonna vertebrale, che previene danni al midollo spinale e DRG associato. Si consiglia inoltre di rimuovere il maggior contenuto di grasso, muscoli e tessuti molli possibile per ridurre il taglio accidentale nella colonna vertebrale e facilitare una migliore presa sul segmento della colonna con pinze prima di tagliare la linea mediana.
Si raccomanda inoltre di eseguire tagli trasversali attraverso la colonna vertebrale tra i dischi al fine di produrre segmenti di colonna puliti e limitare il rischio di danneggiare le coppie DRG. Le meningi che circondano il midollo spinale e che coprono il DRG devono essere completamente rimosse per facilitare l'identificazione e l'estrazione della DRG. Il DRG deve essere rimosso con attenzione dalla colonna vertebrale senza danni dalle pinze. È importante che la DRG rimanga intatta per la colorazione H&E e immunofluorescenza. La tempistica è fondamentale per l'efficienza di questo esperimento in vivo, e la dissezione del topo e l'estrazione del midollo spinale/DRG devono essere eseguite consecutivamente al fine di raccogliere il tessuto che è il più fresco possibile.
Il metodo di omogeneizzazione dei tessuti descritto qui è stato ottimizzato per garantire un'interruzione efficiente di un gran numero di campioni di tessuto eterogenoso. È fondamentale standardizzare la quantità di tessuto utilizzato, che consente il confronto diretto dei risultati ELISA e qPCR tra i campioni. Per esempio, si consiglia di pesare 100 mg di tessuto per ogni procedura di omogeneizzazione. Ogni campione di tessuto deve essere omogeneizzato nella sua interezza e gli avanzi non devono essere congelati. È importante autoclave le perline d'acciaio e pinze prima dell'uso per evitare qualsiasi contaminazione durante l'omogeneizzazione. Un volume di 500 -L è ottimale per garantire l'omogeneizzazione completa di un campione di tessuto da 100 mg. È importante notare che questo volume limitato consente solo l'elaborazione di tre o quattro kit ELISA per campione.
Utilizzando il modello di inoculazione del pedebolo, è stato dimostrato che l'infezione da PRV nei topi induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie G-CSF e IL-6 sono state rilevate anche in molti tessuti omogeneizzati utilizzando ELISA. Inoltre, è stata trovata una forte correlazione tra l'espressione genica e proteica PRV (per qPCR e la colorazione IF) nella DRG e la produzione di entrambe le citochine pro-infiammatorie.
Questo modello è adatto per confrontare la cinetica della replicazione/diffusione virale, nonché le risposte neuroinfiammatorie tra diverse infezioni da alfaferi. Per quanto riguarda la VV, la limitata specificità dell'ospite e la mancanza di malattia clinica hanno limitato l'uso di modelli animali17. Pertanto, il modello di inoculazione PRV piede mouse può rappresentare un nuovo modello animale per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari responsabili del prurito neuropatico in pazienti con lesioni post-erpetica. Sulla base delle somiglianze nei segni clinici, nella patogenesi e nei genomi tra V-V e PRV, si ritiene che questo modello murino migliorerà la comprensione della patogenesi di V-V e porterà agli sviluppi in strategie terapeutiche innovative.
Infine, il modello guiderà la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e i danni virali associati al PNS18. La patogenesi di diversi virus neurotropici (cioè virus della rabbia, poliovirus, virus del Nilo occidentale, virus zika), che sono noti per infettare il PNS, può anche essere studiato utilizzando questo modello19,20,21,22. Il modello di inoculazione del footpad può essere utilizzato come un possibile strumento conveniente per lo sviluppo di farmaci. Per esempio, può servire come una piattaforma per lo screening e testare l'efficacia dei farmaci anti-infiammatori e antivirali progettati per prevenire neuropatie periferiche indotte da virali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono i laboratori Charles River per il loro eccellente supporto tecnico nell'esecuzione delle analisi istopatologiche. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
