Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

वायरल प्रेरित न्यूरोइनफ्लैम्परी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए माउस फुटपैड टीका मॉडल

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/61121
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular Biology, Princeton University, 2Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

Summary

फुटपैड टीका मॉडल वीवो में वायरल-प्रेरित न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। विशेष रूप से, यह परिधीय तंत्रिका तंत्र में शुरू की गई वायरल काइनेटिक्स और संबद्ध इम्यूनोपैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं का स्पष्ट आकलन प्रदान करता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल चूहों में अल्फाहेरपेसवायरस संक्रमण के दौरान न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं की दीक्षा और विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फुटपैड टीका मॉडल का वर्णन करता है। चूंकि अल्फाहेर्प्सवायरस परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) के मुख्य आक्रमणकारी हैं, यह मॉडल वायरल प्रतिकृति के काइनेटिक्स की विशेषता के लिए उपयुक्त है, पीएनएस से सीएनएस तक इसका फैलाव, और संबद्ध न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाएं। फुटपैड टीका मॉडल वायरस कणों को फुटपैड एपिडर्मिस में प्राथमिक संक्रमण स्थल से संवेदी और सहानुभूतिपूर्ण तंत्रिका फाइबर तक फैलने की अनुमति देता है जो एपिडर्मिस, पसीने की ग्रंथियों और डर्मिस को आंतरिक रूप देते हैं। संक्रमण सियाटिक तंत्रिका के माध्यम से पृष्ठीय जड़ गैंगलिया (डीआरजी) और अंततः रीढ़ की हड्डी के माध्यम से मस्तिष्क में फैलता है। यहां, एक माउस फुटपैड को छद्म वायरस (पीआरवी) के साथ टीका लगाया जाता है, जो दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) और वेरिकेला-ज़ोस्टर वायरस (वीजेडवी) से निकटता से संबंधित एक अल्फाहेर्प्सवायरस है। यह मॉडल दर्शाता है कि पीआरवी संक्रमण गंभीर सूजन को प्रेरित करता है, जो फुटपैड और डीआरजी में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की विशेषता है। बाद में एलिसा द्वारा समरूप ऊतकों में भड़काऊ साइटोकिन्स की उच्च सांद्रता का पता लगाया जाता है। इसके अलावा, डीआरजी में पीआरवी जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति (क्यूपीसीआर और यदि धुंधला के माध्यम से) और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन के बीच एक मजबूत सहसंबंध देखा जाता है। इसलिए, फुटपैड टीका मॉडल अल्फाहेरपेसवायरस-प्रेरित न्यूरोपैथी में अंतर्निहित प्रक्रियाओं की बेहतर समझ प्रदान करता है और अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों के विकास का कारण बन सकता है। इसके अलावा, मॉडल परिधीय न्यूरोपैथी पर अनुसंधान का मार्गदर्शन कर सकता है, जैसे कि मल्टीपल स्क्लेरोसिस और पीएनएस को संबद्ध वायरल-प्रेरित क्षति। अंततः, यह दवा के विकास के लिए वीवो उपकरण में लागत प्रभावी के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

यह अध्ययन पीएनएस से सीएनएस और संबद्ध न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रतिक्रियाओं में वायरस की प्रतिकृति और प्रसार की जांच करने के लिए एक फुटपैड टीका मॉडल का वर्णन करता है। पैरों के टीका लगाने वाले मॉडल का उपयोग न्यूरॉन्स 1,2,,3में अल्फाहेर्पसवायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया गया है ।3 इस मॉडल का मुख्य उद्देश्य न्यूरोट्रोपिक वायरस को सीएनएस तक पहुंचने से पहले पीएनएस के माध्यम से अधिकतम दूरी की यात्रा करने की अनुमति देना है। यहां, इस मॉडल का उपयोग छद्म वायरस (पीआरवी) से संक्रमित चूहों में एक विशेष न्यूरोपैथी (न्यूरोपैथिक खुजली) के विकास में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया जाता है।

पीआरवी कई प्रसिद्ध रोगजनकों (यानी, दाद सिंप्लेक्स टाइप 1 और 2 [एचएसवी 1 और एचएसवी 2] और वेरिकेला-ज़ोस्टर वायरस [वीजेडवी] से संबंधित एक अल्फाहेरपेसवायरस है, जो क्रमशः4ठंडे घावों, जननांग घावों और चिकन पॉक्स का कारण बनता है। ये वायरस सभी पैनट्रॉपिक होते हैं और एक विशिष्ट ऊतक प्रकार के लिए आत्मीयता दिखाए बिना कई अलग-अलग सेल प्रकारों को संक्रमित करने में सक्षम होते हैं। हालांकि, वे सभी मेजबान प्रजातियों के पीएनएस (और कभी-कभी, सीएनएस) पर हमला करके एक विशेषता न्यूरोट्रोपिज्म प्रदर्शित करते हैं। प्राकृतिक मेजबान सुअर है, लेकिन पीआरवी सबसे स्तनधारियों को संक्रमित कर सकते हैं । इन गैर-प्राकृतिक मेजबानों में, पीआरवी पीएनएस को संक्रमित करता है और "मैड खुजली" नामक एक गंभीर प्रेटिटस को प्रेरित करता है, जिसके बाद पेराक्यूट डेथ5,,6होती है। पीआरवी संक्रमण के नैदानिक परिणाम और रोगजनन में न्यूरोइम्यून प्रतिक्रिया की भूमिका को खराब समझा गया है।

फुटपैड टीका मॉडल पीआरवी को फुटपैड की एपिडर्मल कोशिकाओं में संक्रमण शुरू करने की अनुमति देता है। फिर, संक्रमण संवेदी और सहानुभूति तंत्रिका फाइबर में फैलता है जो एपिडर्मिस, पसीने की ग्रंथियों और डर्मिस को आंतरिक रूप देते हैं। संक्रमण लगभग 60 घंटे के भीतर डीआरजी के लिए sciatic तंत्रिका के माध्यम से चलती वायरस कणों से फैलता है। संक्रमण रीढ़ की हड्डी के माध्यम से फैलता है, अंततः हिंडब्रेन तक पहुंच जब जानवर मरणासन्न (82 घंटे के बाद संक्रमण) हो जाते हैं। इस समय खिड़की के दौरान, ऊतक के नमूनों को एकत्र किया जा सकता है, संसाधित किया जा सकता है, और वायरस प्रतिकृति और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्कर के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीआरवी रोगजनकता में नैदानिक, विषाणुविज्ञान और न्यूरोइंफ्लैमेटरी प्रक्रियाओं की दीक्षा और विकास के बीच सहसंबंध स्थापित करने के लिए विभिन्न ऊतकों में हिस्टोलॉजिकल परीक्षा और वायरल लोड क्वांटिफिकेशन किया जा सकता है।

फुटपैड टीका मॉडल का उपयोग करके, चूहों में पीआरवी-प्रेरित प्रेट्रिटी के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, यह मॉडल दाद वायरस संक्रमण के दौरान वायरस प्रेरित न्यूरोइनफ्लेमेशन की दीक्षा और विकास में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। अल्फाहेरपेसवायरस-प्रेरित न्यूरोपैथी में अंतर्निहित प्रक्रियाओं की बेहतर समझ अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों के विकास का कारण बन सकती है। उदाहरण के लिए, यह मॉडल पोस्ट-हर्पेटिक घावों (जैसे, दाद जोस्टर, दाद) और इसी मानव रोगों के लिए चूहों में उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों का परीक्षण करने वाले रोगियों में न्यूरोपैथिक खुजली के तंत्र की जांच करने के लिए उपयोगी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रिंसटन विश्वविद्यालय की संस्था एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदित प्रोटोकॉल (संख्या 2083-16 और 2083-19) के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए थे। यह काम बायोसेफ्टी लेवल-2 (बीएसएल-2) आवश्यकताओं का कड़ाई से पालन करके किया गया था, जिसके लिए हमारे पास प्रिंसटन विश्वविद्यालय जैवसेफ्टी समिति द्वारा अनुमोदित एक पूरी तरह से सुसज्जित प्रयोगशाला है। प्रिंसटन विश्वविद्यालय बायोकंटेनमेंट पशु सुविधा कक्ष में एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में माउस फुटपैड घर्षण, वायरल टीका, माउस विच्छेदन, और ऊतक संग्रह सहित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । प्रक्रिया प्रदर्शन करने वालों ने डिस्पोजेबल गाउन, हेड कवर, आंखों की सुरक्षा, बाँझ दस्ताने, सर्जिकल मास्क और जूता कवर पहना था।

1. माउस फुटपैड घर्षण

  1. एनेस्थेटाइज एक C57BL/6 माउस (5-7 सप्ताह पुराना) आइसोफ्लुन गैस एनेस्थेटिक के साथ, एक छोटे संज्ञाहरण प्रणाली (कक्ष) के माध्यम से 3% की खुराक पर दिया जाता है।
    1. माउस को एनेस्थीसिया के सर्जिकल विमान में अपनी पीठ पर रखें, टीका लगाने से पहले, हिंद फुटपैड में। माउस में डायाफ्राम (जानवर के थूथन को फिट करने के लिए पर्याप्त आकार का एक स्लिट) के साथ नाक शंकु संलग्न करें और 1.5%-2.0% की निरंतर खुराक पर आइसोफ्लुन गैस एनेस्थेटिक वितरित करें।
    2. संदंश के साथ पंजे के सशक्त चुटकी द्वारा बनाई गई दर्दनाक उत्तेजना की प्रतिक्रिया के लिए माउस की बारीकी से निगरानी करें।
  2. हल्के से फ्लैट संदंश के साथ एक हिंद फुटपैड पकड़।
    1. धीरे-धीरे एड़ी बोर्ड (100-180 धैर्य) के साथ एड़ी और चलने वाले पैड के बीच, लगभग 20x हिंद फुटपैड की ग्लैब्रोस त्वचा को एम्ब्राड करें। बहुत बार या बहुत अधिक दबाव लागू करके रक्तस्राव को प्रेरित न करें।
    2. ठीक संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे स्ट्रैटम बेसेल को बेनकाब करने के लिए घर्षण द्वारा अलग स्ट्रैटम कॉर्नियम को छीलें।

2. पीआरवी फुटपैड टीका

  1. डीएमईएम मीडिया में वांछित टाइटर के लिए पतला वायरस इनोकुलम तैयार करें जिसमें 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमामाइसिन(सामग्री की तालिका) शामिल हैं।
    1. वायरल खुराक की गणना और मानकीकरण और तदनुसार वायरल इनोकुलम को पतला करने के लिए PK15 कोशिकाओं पर वायरस स्टॉक में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) की संख्या को मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: इस अध्ययन में, पीआरवी (पीआरवी-बेकर) के उग्र तनाव का उपयोग 8 x 106 पीएलएफयू की खुराक पर किया गया था। इस खुराक को पिछले प्रारंभिक प्रयोग में अनुकूलित किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी टीका लगाने वाले जानवरों ने 82 घंटे के बाद टीका (एचपीआई) में नैदानिक लक्षण दिखाए।
    2. वायरस इनोकुलम को बर्फ पर रखें और उपयोग से पहले धीरे-धीरे मिलाएं।
  2. abraded फुटपैड (सामयिक प्रशासन) पर वायरस इनोकुलम (8 x 106 पीएलयूएफयू) की 20 माइक्रोन ड्रॉपलेट जोड़ें। समानांतर रूप से नकली टीका (केवल माध्यम) करें।
  3. धीरे-धीरे वायरस के सोखने की सुविधा के लिए सुई के शाफ्ट के साथ 10x रगड़ें। सुई बिंदु के साथ खरोंच से बचें। इस चरण को हर 10 मिनट दोहराएं।
  4. माउस को 30 मिनट के लिए संज्ञाहरण के नीचे रखें जब तक कि abraded फुटपैड सूखा न हो जाए।
  5. संज्ञाहरण को रोकने के बाद, माउस की निगरानी करें जब तक कि यह स्टर्नल रेक्यूबेंसी बनाए रख सके और इसे नैदानिक अनुवर्ती और नमूने के लिए एक व्यक्तिगत पिंजरे में रख सके।

3. माउस विच्छेदन और ऊतक संग्रह

  1. संक्रमण के बाद उचित समय पर, माउस को एस्फिक्सेशन विधि (सीओ2)द्वारा इच्छामृत्युदें।
    नोट: इस अध्ययन में, पीआरवी-बेकर संक्रमित चूहों के लिए मानवीय एंडपॉइंट (जब जानवर टर्मिनल लक्षण प्रदर्शित करना शुरू करते हैं) 82 एचपीआई है। समानांतर में जानवरों को नियंत्रित करें।
  2. सुई/पिन का उपयोग कर एक सर्जिकल चटाई पर सामना करना पड़ माउस वेंट्रल पक्ष रखें । एक सर्जिकल फोम बोर्ड के लिए पिन के साथ माउस के अंगों को सुरक्षित करें। फर संदूषण को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस के वेंट्रल साइड को गीला करें।
  3. बलदंश का उपयोग कर फर और त्वचा की बाहरी परत चुटकी और मूत्रमार्ग खोलने के पास ठीक कैंची का उपयोग कर एक छोटे से प्रारंभिक चीरा बनाते हैं ।
    1. इस उद्घाटन से, ठोड़ी तक मध्य वेंट्रल साइड पर चीरा जारी रखें।
    2. अग्रभाग और हिंद अंगों के चरम हिस्सों की ओर दो पार्श्व चीरों का विस्तार करें।
    3. त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से अलग करें और साइड में पिन करें।
    4. पेट की गुहा खोलें और छाती के आधार तक चीरा। दो ट्रांसवर्सल चीरे बनाकर पेट की गुहा को खोलने का काम पूरा करें।
    5. दोनों पार्श्व पक्षों पर डायाफ्राम और पसलियों को काटकर छाती गुहा खोलें।
      नोट: रिबकेज के किनारों को काटने से दिल काटने का खतरा रहता है।
    6. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में हृदय, फेफड़े, तिल्ली, अग्न्याशय, यकृत, गुर्दे और मूत्राशय सहित उजागर अंगों को इकट्ठा करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    7. एड़ी और चलने पैड के बीच abraded फुटपैड काटें और एक ट्यूब में ऊतक के टुकड़े जगह के रूप में कदम ३.३.६ में वर्णित है ।
  4. माउस पृष्ठीय पक्ष को ऊपर रखें और 70% इथेनॉल के साथ फर को गीला करें। कशेरुकी स्तंभ को बेनकाब करने के लिए त्वचा की परत को काट लें।
    1. श्रोणि के क्षेत्र में एक छोटा सा चीरा बनाएं। त्वचा को पिछले अंगों से सिर की ओर पट्टी करें।
    2. दोनों तरफ रीढ़ की हड्डी के कॉलम के समानांतर और करीब कैंची से काटकर पैरों और बाहों को हटा दें।
    3. खोपड़ी (C1-C2 स्तर) के आधार पर सिर काट लें।
    4. फोरमेन मैग्नम से ललाट की हड्डी तक कैंची से खोपड़ी को खोलें।
    5. संदंश का उपयोग कर पार्श्व दिशाओं में खोपड़ी खोलें।
    6. धीरे-धीरे संदंश का उपयोग करके मस्तिष्क को स्कूप करें और चरण 3.3.6 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
  5. घुमावदार कैंची का उपयोग करके मांसपेशियों, वसा और नरम ऊतकों को काटकर रीढ़ की हड्डी के कॉलम को साफ करें। पूंछ काटें। एक 15 एमएल ट्यूब में बरकरार रीढ़ की हड्डी का कॉलम रखें जिसमें बाँझ बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) होते हैं। रीढ़ की हड्डी और डीआरजी के आगे विच्छेदन तक बर्फ पर ट्यूब रखें।

4. रीढ़ की हड्डी और डीआरजी निष्कर्षण

नोट: माउस विच्छेदन के बाद सीधे कशेरुकी कॉलम से रीढ़ की हड्डी और डीआरजी निकालें। रीढ़ की हड्डी और डीआरजी निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल को पिछले प्रकाशन7से अनुकूलित किया गया है ।

  1. बर्फ से ठंडे पीबीएस ट्यूब से कशेरुकी कॉलम निकालें और शेष नरम ऊतकों को हटा दें, जो प्रशीतन के बाद आसान हो जाता है।
  2. एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके कशेरुकी (टी 1, एल1 और एस 2 स्तर) के माध्यम से कॉलम में तीन ट्रांसवर्स कटौती करें। तीनों टुकड़ों को बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस युक्त 15 मिमी पेट्री डिश में रखें। बाद के विश्लेषण के लिए खंडों की उत्पत्ति को ट्रैक और चिह्नित रखें।
  3. एक सेगमेंट लें और इसे संदंश, पृष्ठीय पक्ष का सामना करने के बीच सुरक्षित करें। एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके मिडलाइन के माध्यम से एक एकल, देशांतर को काट दें, कॉलम को दो बराबर हिस्सों में विभाजित करें।
  4. दोनों हिस्सों को एक नई पेट्री डिश में रखें जिसमें नई बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस होते हैं। बाएं और दाएं पक्षों को अलग करने में सक्षम होने के लिए सेगमेंट का सही अभिविन्यास सुनिश्चित करें।
  5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी को कशेरुकी स्तंभ से बाहर निकालें प्रत्येक आधे से एक रोस्ट्रल में ठीक संदंश का उपयोग करके कौडल दिशा में।
  6. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में दोनों रीढ़ की हड्डी के हिस्सों को इकट्ठा करें जिसमें बाँझ बर्फ-ठंडे पीबीएस के 500 माइक्रोल होते हैं। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  7. डीआरजी को बेनकाब करने के लिए स्पाइनल कॉलम के एक तरफ से दूसरे हिस्से में मेनिंग्स को धीरे-धीरे हटा दें।
  8. उजागर रीढ़ की हड्डी तंत्रिका लोभी द्वारा व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक DRG निकालें और यह धीरे रीढ़ की हड्डी कॉलम से बाहर खींच । एकत्र डीआरजी को बर्फ-ठंडे पीबीएस युक्त 15 मिमी पेट्री डिश में रखें। स्पाइनल कॉलम सेगमेंट से अलग से सभी इप्सिल्टरल और कॉन्ट्रालेटरल डीआरजी को हार्वेस्ट करें और स्टेप 4.5 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
    नोट: डीआरजी सफेद रीढ़ की हड्डी तंत्रिका के साथ एक गोल पारदर्शी संरचना के रूप में दिखाई देता है।
  9. 30-45 मिनट के भीतर दो अन्य रीढ़ की हड्डी स्तंभ खंडों का उपयोग करके चरण 4.3-4.7 दोहराएं।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए उच्च गति (17,900 x ग्राम)पर सभी ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
  11. तरल नाइट्रोजन में सुपरनेट और फ्लैश-फ्रीज ट्यूब ों को एस्पिरेट करें। आगे के ऊतक समरूपता के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करें।
  12. वैकल्पिक रूप से, फिक्स और हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के लिए साफ DRG और अन्य माउस ऊतकों अनुभाग और/

5. ऊतक समरूपता

  1. बर्फ पर जमे हुए ऊतकों के नमूनों वाली ट्यूबों को पिघलाएं।
  2. ऊतक के 100 मिलीग्राम वजन और एक 2 मिलीएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एक बाँझ स्टील मनका और रिपा बफर के 500 माइक्रोन युक्त 0.5 एम EDTA (पीएच = 8.0), 1 एम Tris-HCl (पीएच = 8.0), 5 एम NaCl, 10% SDS, और प्रोटीज़ कॉकटेल अवरोधक गोलियों युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।
  3. कमरे के तापमान पर ऊतकों को बाधित (आरटी) 20 चक्रों में एक समरूपता का उपयोग/2 मिनट के लिए एस, एक 1 मिनट प्रतीक्षा अवधि के बाद, तो 20 चक्र/2 मिनट के लिए एस ।
  4. आर टी में 10 मिनट के लिए उच्च गति (17,900 x ग्राम)पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  5. एक नई ट्यूब में सुपरनैंट (500 माइक्रोन) लीजिए और क्रमशः भड़काऊ मार्कर और वायरल लोड की मात्रा निर्धारित करने के लिए एलिसा और क्यूपीसीआर प्रदर्शन करते हुए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: क्यूपीसीआर के लिए, आरएनएसई-मुक्त सामग्री (यानी, मोती, ट्यूब, आदि) के साथ सभी नमूनों को एकत्र करें और आरएनए लाइसिस बफर के साथ ऊतकों को बाधित करें जिसमें 1% बीटामरकैप्टोएथेनॉल(सामग्री की तालिका) होती है।

6. जमे हुए डीआरजी वर्गों की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. ऊतक प्रसंस्करण
    1. आरटी में 2 घंटे के लिए 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में विच्छेदित और साफ डीआरजी को ठीक करें।
    2. पीबीएस में 10% सुक्रोज के साथ ऊतक को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. पीबीएस में 20% सुक्रोज के साथ ऊतक को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस में 30% सुक्रोज के साथ ऊतक को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. अक्टूबर में ऊतकों को एक क्रायोमोल्ड का उपयोग करके एम्बेड करें और तेजी से ठंड के लिए सूखी बर्फ में ब्लॉक रखें।
    6. उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।
  2. क्रायोसेक्शनिंग की तैयारी
    1. -80 डिग्री सेल्सियस से जमे हुए ब्लॉक को हटा दें और इसे क्रायोस्टेट चैंबर तापमान में 30 मिनट के लिए बराबर करने की अनुमति दें।
    2. 15 माइक्रोन की मोटाई पर डीआरजी को क्रायोसेक्शन करें और स्लाइड्स पर वर्गों को माउंट करें।
    3. स्लाइड-माउंटेड ऊतक के चारों ओर हाइड्रोफोबिक सर्कल खींचने के लिए पेन का उपयोग करें।
    4. स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला होने तक रखें।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. आरटी में 10 मिनट के लिए पीबीएस में डीआरजी सेक्शन 3x धोएं ।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, पीआरवी ग्लाइकोप्रोटीन बी के खिलाफ माउस एंटीबॉडी) के 100 माइक्रोल के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें। 10% नकारात्मक बकरी सीरम युक्त पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
    3. दोहराएं चरण 6.3.1।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए वांछित माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 488) के 100 माइक्रोल के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें। केवल पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
    5. अनुभाग पर पीबीएस में पतला DAPI (4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडल) डाई के 100 माइक्रोन जोड़ें। इसके अलावा 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के नमूने ों को इनक्यूबेट किया।
    6. दोहराएं चरण 6.3.1।
    7. ग्लास स्लाइड पर फ्लोरेसेंस बढ़ते माध्यम का उपयोग करके नमूनों को माउंट करें और कवरस्लिप के साथ सुरक्षित और कवर करें।

7. पैराफिन एम्बेडेड ऊतक वर्गों की तैयारी और एच एंड ई धुंधला

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मलिन में ऊतक को ठीक करें।
  2. पैराफिन एम्बेडिंग और निश्चित ऊतकों की धारा के लिए मानक प्रसंस्करण अनुसूची करें। फिक्स्ड ऊतकों को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें और उन्नत अल्कोहल के माध्यम से पैराफिन के बाद जाइलीन में प्रक्रिया करें, जैसा कि पहले8वर्णित है।
    नोट: कैसेट के अंदर डीआरजी जैसे छोटे ऊतक नमूनों को रखने के लिए पॉलिएस्टर स्पंज का उपयोग करें।
  3. ऊतक वर्गों के एच एंड ई धुंधला के बाद मानक deparaffinization प्रदर्शन, जैसा कि पहले9वर्णित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

माउस फुटपैड टीका मॉडल वीवो में अल्फाहेर्पेवायरस संक्रमण के इम्यूनोपैथोजेनेसिस के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, जिसमें टीका लगाने वाले फुटपैड से तंत्रिका तंत्र में संक्रमण की प्रतिकृति और प्रसार और विशिष्ट न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं को शामिल करना शामिल है।

इस अध्ययन में, हमने पहले माउस हिंद फुटपैड को abraded किया और या तो नकली-टीका लगाया या पीआरवी (पीआरवी-बेकर) के उग्र तनाव के साथ घर्षण क्षेत्र को टीका लगाया। कंट्रोल फुटपैड में घर्षण की साइट दिखाई दे रही थी । चिकित्सा प्रक्रिया(चित्रा 1,काला तीर) के हिस्से के रूप में घर्षण स्थल पर एक पपड़ी का गठन किया गया था। इसके विपरीत, पीआरवी के साथ टीका लगाने वाले चूहों ने मानवीय एंडपॉइंट (82 एचपीआई) में गंभीर सूजन दिखाई, जो फुटपैड और लाली की सूजन की विशेषता है।

उग्र पीआरवी-बेकर तनाव के साथ फुटपैड टीका के बाद, चूहों ने 72 एचपीआई पर नैदानिक संकेत दिखाना शुरू किया, जो टीका लगाने वाले फुटपैड की सूजन और तेजी से लगातार झटके की विशेषता है। ८२ एचपीआई तक पीआरवी-बेकर संक्रमित चूहों ने टीका लगाने वाले पैर और विशिष्ट पीआरवी लक्षणों में लगातार झटके दिखाए, जिसमें पैर की तीव्र खरोंच और काटने शामिल हैं । फुटपैड में गंभीर सूजन भी देखी गई। पीआरवी संक्रमण के दौरान प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया को आगे की विशेषता थी, जिसमें ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ शामिल थी।

कई ऊतकों की हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा की गई थी, जिसमें टीका लगाया गया फुटपैड और डीआरजी शामिल थे, जिसके बाद पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों के एच एंड ई धुंधला हो गए थे। पीआरवी-संक्रमित पैर वर्गों(चित्रा 2ए, पैनल बी)में एपिडर्मल नेक्रोसिस और गंभीर डर्मल सूजन (एडीमा और फाइब्रिन) देखे गए। संक्रमित चूहों के एपिडर्मिस, डर्मिस और कनेक्टिव ऊतकों ने काले तीरों के साथ चिह्नित न्यूट्रोफिल (मल्टीलोड्यूल्ड न्यूक्लियी द्वारा पहचाने गए) की भारी घुसपैठ दिखाई। नियंत्रण चूहों के फुटपैड सामान्य थे(चित्रा 2ए, पैनल ए)। पीआरवी-संक्रमित डीआरजी ने संक्रमित चूहों में न्यूनतम न्यूरोनल नेक्रोसिस और मिश्रित सूजन दिखाई जबकि नियंत्रण चूहों का डीआरजी सामान्य था(चित्रा 2बी, पैनल ए और बी)। मिश्रित सूजन घुसपैठ में मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल और लिम्फोसाइट्स शामिल थे।

इसके बाद, पीआरवी फुटपैड टीका स्थापित होने के बाद माउस ऊतक में भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन की काइनेटिक्स स्थापित की गई। नियंत्रण और पीआरवी संक्रमित चूहों से एकत्र और समरूप कई ऊतकों से विशिष्ट भड़काऊ साइटोकिन्स के स्तर (यानी, इंटरल्यूकिन-6 [आईएल-6] और ग्रैनुलोसाइट-कॉलोनी उत्तेजक कारक [जी-सीएसएफ]) निर्धारित किए गए थे। परिणामों ने 7 एचपीआई और 82 एचपीआई(चित्रा 3 ए)पर नियंत्रण की तुलना में फुटपैड और डीआरजी में जी-सीएसएफ के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। नियंत्रण की तुलना में पीआरवी संक्रमित चूहों के रीढ़ की हड्डी, मस्तिष्क, हृदय और यकृत ऊतक में 82 एचपीआई पर जी-सीएसएफ का महत्वपूर्ण स्तर देखा गया। इसके अलावा, 24 एचपीआई (चित्रा 3बी) से शुरू होने वाले नियंत्रणों की तुलना में पीआरवी-संक्रमित चूहों के सभी ऊतकों में महत्वपूर्णआईएल-6 स्तरों कापता लगाया गया था।

फुटपैड टीका मॉडल का उपयोग पीआरवी प्रतिकृति की जांच करने और टीका लगाने वाले फुटपैड से पीएनएस और सीएनएस और न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया विकास के साथ संभावित सहसंबंधों की जांच करने के लिए किया गया था। पीआरवी डीएनए को बढ़ाने के लिए क्यूपीसीआर द्वारा कई समरूप ऊतकों में पीआरवी लोड की मात्रा निर्धारित की गई थी। डीएनए एकाग्रता तो PFU में परिवर्तित किया गया था, जैसा कि पहले10वर्णित है । पीआरवी लोड 24 एचपीआई (~ 1 x 104 PFU/ऊतक के मिलीग्राम) से शुरू फुटपैड में पाया गया और डीआरजी में ६० एचपीआई (~ 1 x 103 PFU/मिलीग्राम ऊतक; डेटा नहीं दिखाया गया) से शुरू होता है ।

एकसन्नाद राज्य (८२ एचपीआई) में, पीआरवी को फुटपैड, डीआरजी, रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क में पाया गया, जिसमें डीआरजी में पीआरवी की उच्चतम एकाग्रता (~ 1 x 105 पीएलयू/एमजी ऊतक; चित्रा 4)। डीआरजी के पीआरवी संक्रमण की पुष्टि डीआरजी क्रायोसेक्शन के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग से हुई । पीआरवी में एंटी पीआरवी जीबी एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए डीआरजी न्यूरॉन्स में इंफेक्शन का पता चला। संक्रमित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में संक्रमण के देर से चरणों के दौरान पीआरवी ग्लाइकोप्रोटीन जीबी व्यक्त किया गया था। जैसा कि उम्मीद थी, संक्रमित डीआरजी में पीआरवी जीबी (ग्रीन) की साइटोप्लाज्मिक अभिव्यक्ति की पुष्टि हुई थी, जबकि नियंत्रणनमूनों (चित्र 5)में कोई जीबी व्यक्त नहीं किया गया था। सेल नाभिक की पहचान दापी स्टेनिंग (नीला) से की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: पीआरवी टीका के बाद माउस सही हिंद पंजे के प्रतिनिधि छवियां। चूहों को या तो नकली टीका लगाया जाता है या घर्षण दाएं हिंद फुटपैड में पीआरवी के साथ टीका लगाया जाता है। पीआरवी-टीका लगाने वाले फुटपैड में सूजन के लक्षण दिखाई दिए हैं, जिनमें मानवीय एंडपॉइंट (82 एचपीआई) पर लालिमा और सूजन शामिल है। नियंत्रण चूहों का फुटपैड घर्षण स्थल पर एक गहरे लाल परत के साथ सामान्य दिखाई देता है, जो यह दर्शाता है कि घाव उपचार कर रहा है। काले तीर घर्षण की साइट को इंगित करते हैं। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीआरवी फुटपैड टीका के बाद फुटपैड और डीआरजी में हिस्टोपैथोलॉजिकल निष्कर्ष। हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) का धुंधला(ए)माउस टीका लगाने वाले फुटपैड और(बी)और इप्सिलाटरल डीआरजी नियंत्रण से (पैनल ए) और पीआरवी-संक्रमित (पैनल बी) चूहों पर 82 एचपीआई। पीआरवी-संक्रमित ऊतकों (एपिडर्मल और न्यूरोनल नेक्रोसिस और न्यूट्रोफिल घुसपैठ) में देखे गए हिस्टोपैथोलॉजिकल अभिव्यक्तियां सभी जांच किए गए नकली संक्रमित चूहों से अनुपस्थित हैं। परिणाम ऊतक के एक दिए गए प्रकार के लिए तीन जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि हैं। काले तीर प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के साथ सूजन के प्रतिनिधि क्षेत्रों का संकेत देते हैं। प्रत्येक चित्र के लिए स्केल बार (50 माइक्रोन) इंगित किए गए हैं। इस आंकड़े को11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीआरवी फुटपैड टीका के बाद समरूप माउस ऊतकों में भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन की काइनेटिक्स। (A)जी-सीएसएफ और(बी)आईएल-6 प्रोटीन का स्तर पीआरवी-संक्रमित (लाल) और नियंत्रण (काला) माउस समरूप ऊतकों में विभिन्न एचपीआई पर पाया गया । एलिसा द्वारा प्रोटीन के स्तर को निर्धारित किया जाता है और समरूप ऊतक (एन = 5 प्रति समूह, * पी एंड एलटी; 0.05, एनएस = महत्वपूर्ण नहीं) के पिकोग्राम (स्नातकोत्तर) प्रति मिलीग्राम (मिलीग्राम) के रूप में व्यक्त किया जाता है। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: माउस समरूप ऊतकों में पीआरवी जीनोम का मात्राकरण। पीआरवी यूएल 54 प्राइमर का उपयोग करके क्यूपीसीआर द्वारा समरूप माउस ऊतकों में पीआरवी डीएनए की मात्रा निर्धारित की जाती है। पीआरवी लोड ऊतक के प्रति मिलीग्राम पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। पीआरवी डीएनए केवल पैर, डीआरजी, रीढ़ की हड्डी, और मस्तिष्क में पाया जाता है (और अन्य ऊतकों में नहीं), एन = 10 प्रति समूह। बिंदीदार रेखा का पता लगाने की सीमा से पता चलता है । इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा डीआरजी न्यूरॉन्स में पीआरवी संक्रमण का आकलन। पीआरवी जीबी (ग्रीन) के लिए विशिष्ट माउस एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद मॉक-और पीआरवी-संक्रमित डीआरजी न्यूरॉन्स की कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियां। सेल नाभिक DAPI (नीले, पैनल ए और सी) के साथ दाग रहे हैं । पैनल डी जीबी (सफेद तीर) व्यक्त करने वाले कई पीआरवी-संक्रमित न्यूरॉन्स को दिखाता है। नियंत्रण डीआरजी अनुभागों (पैनल बी) में कोई जीबी अभिव्यक्ति का पता नहीं चला है। प्रत्येक चित्र के लिए स्केल बार (50 माइक्रोन) इंगित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित फुटपैड टीका मॉडल अल्फाहेरपेसवायरस संक्रमण के दौरान न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रियाओं की दीक्षा और विकास की जांच करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, वीवो मॉडल में इसका उपयोग पीएनएस से सीएनएस तक अल्फाहेर्प्सवायरस की प्रतिकृति और प्रसार की गतिज स्थापित करने के लिए किया जाता है। यह अन्य टीका मॉडलों के लिए एक वैकल्पिक है, जैसे कि पार्श्व त्वचा टीका मॉडल, जो गहरे डर्मल खरोंच13,या इंट्राक्रैनियल मार्ग पर निर्भर करता है, जो सीधे सीएनएस14,15,,16में वायरस का परिचय देता है।, नतीजतन, फुटपैड मॉडल के साथ, प्रतिकृति के वायरल काइनेटिक्स का अधिक विस्तृत आकलन प्राप्त करना संभव है और तंत्रिका तंत्र11, 12,12में संबद्ध स्थानीय और दूर की इम्यूनोपैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं के साथ फैल गया है।

इस प्रोटोकॉल में, फुटपैड का घर्षण और बाद में वायरल टीका महत्वपूर्ण कदम हैं। दरअसल, सफल संक्रमण के लिए वायरल इनोकुलम के लिए स्ट्रैटम बेसले को बेनकाब करने के लिए पर्याप्त घर्षण के बाद स्ट्रैटम कॉर्नियम को पूरी तरह से हटाने की जरूरत है। हालांकि, घर्षण कोमल होना चाहिए और रक्तस्राव को प्रेरित नहीं करता है, क्योंकि यह रक्त परिसंचरण के संक्रमण को रोकने में मदद करता है। अलग स्ट्रैटम कॉर्नियम को प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत एच एंड ई धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है। स्ट्रैटम कॉर्नियम में मौजूद कॉर्नियोसाइट्स फ्लैट, इओसिनोफिलिक कोशिकाएं होती हैं जिनमें नाभिक की कमी होती है। वायरल इनोकुलम (20 माइक्रोल ड्रॉपलेट) की मात्रा को यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि बूंद फुटपैड पर रहती है और abraded साइट को कवर करती है। धीरे-धीरे abraded फुटपैड पर इनोकुलम बूंद रगड़ कुशल वायरल प्रवेश के लिए आवश्यक है। संज्ञाहरण को रोकने और जानवर को एक नए पिंजरे में रखने के लिए फुटपैड पूरी तरह से सूखी होने तक इंतजार करने की सिफारिश की जाती है। यह कदम माउस को abraded फुटपैड से वायरल इनोकुलम चाट से बचना होगा। नाक शंकु का उपयोग करके एक बार में अधिकतम तीन चूहों को संसाधित करने की सिफारिश की जाती है जो उन्हें संज्ञाहरण के साथ बेनकाब करने के लिए सेट किया जाता है।

माउस विच्छेदन का प्रदर्शन करते समय, कशेरुकी कॉलम के समानांतर कटौती करना महत्वपूर्ण है, जो रीढ़ की हड्डी और संबद्ध डीआरजी को नुकसान से बचाता है। यह भी रीढ़ की हड्डी कॉलम में आकस्मिक काटने को कम करने और मिडलाइन नीचे काटने से पहले संदंश के साथ कॉलम खंड पर एक बेहतर पकड़ की सुविधा के लिए संभव के रूप में ज्यादा वसा, मांसपेशियों, और नरम ऊतक को दूर करने के लिए सुझाव दिया है ।

साफ कॉलम सेगमेंट का उत्पादन करने और डीआरजी जोड़े को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को सीमित करने के लिए डिस्क के बीच कशेरुकी कॉलम के माध्यम से ट्रांसवर्स कटौती करने की भी सिफारिश की जाती है। रीढ़ की हड्डी के आसपास के मेनिंग्स और डीआरजी को कवर करने के लिए डीआरजी की पहचान और निकासी को सुविधाजनक बनाने के लिए पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए । डीआरजी को संदंश से बिना नुकसान के रीढ़ की हड्डी के कॉलम से सावधानी से हटा दिया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि डीआरजी एच एंड ई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए बरकरार रहे। वीवो प्रयोग में इसकी दक्षता के लिए समय महत्वपूर्ण है, और माउस विच्छेदन और रीढ़ की हड्डी/डीआरजी निष्कर्षण को ऊतक एकत्र करने के लिए लगातार किया जाना चाहिए जो यथासंभव ताजा है ।

यहां वर्णित ऊतक समरूपता विधि को बड़ी संख्या में विषम ऊतक नमूनों के कुशल व्यवधान को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। उपयोग किए गए ऊतकों की मात्रा को मानकीकृत करना सर्वोपरि है, जो नमूनों के बीच एलिसा और क्यूपीसीआर परिणामों की सीधी तुलना की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, प्रत्येक समरूपता प्रक्रिया के लिए 100 मिलीग्राम ऊतक का वजन करने का सुझाव दिया जाता है। प्रत्येक ऊतक नमूने को अपनी संपूर्णता में समरूप होना चाहिए, और बचा फ्रीज-गल नहीं होना चाहिए। समरूपता के दौरान किसी भी प्रदूषण से बचने के लिए उपयोग से पहले स्टील के मोतियों और संदंश को ऑटोक्लेव करना महत्वपूर्ण है। 100 मिलीग्राम ऊतक नमूने का पूर्ण समरूपता सुनिश्चित करने के लिए 500 माइक्रोन की मात्रा इष्टतम है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह सीमित मात्रा केवल प्रति नमूने तीन से चार एलिसा किट के प्रसंस्करण के लिए अनुमति देती है।

फुटपैड टीका मॉडल का उपयोग करके, यह प्रदर्शित किया गया था कि चूहों में पीआरवी संक्रमण गंभीर सूजन को प्रेरित करता है, जो फुटपैड और डीआरजी में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की विशेषता है। एलिसा का उपयोग करके कई समरूप ऊतकों में भड़काऊ साइटोकिन्स जी-सीएसएफ और आईएल-6 की उच्च सांद्रता का भी पता लगाया गया था। इसके अलावा, डीआरजी में पीआरवी जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति (क्यूपीसीआर और यदि धुंधला द्वारा) और दोनों समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन के बीच एक मजबूत संबंध पाया गया था।

यह मॉडल विभिन्न अल्फाहेर्पसवायरस संक्रमणों के बीच वायरल प्रतिकृति/प्रसार के साथ-साथ न्यूरोइंफ्लेमैरेटरी प्रतिक्रियाओं के काइनेटिक्स की तुलना करने के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, वीजेडवी के बारे में, प्रतिबंधित मेजबान-विशिष्टता और नैदानिक रोग की कमी ने पशु मॉडल17के उपयोग को सीमित कर दिया है। इसलिए, माउस फुटपैड पीआरवी टीका मॉडल पोस्ट-हर्पेटिक घावों वाले रोगियों में न्यूरोपैथिक प्रेरिटस के लिए जिम्मेदार सेलुलर और आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक नए पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकता है। वीजेडवी और पीआरवी के बीच नैदानिक संकेतों, रोगजनन और जीनोम में समानताओं के आधार पर, यह माना जाता है कि यह माउस मॉडल वीजेडवी रोगजनन की समझ को बढ़ाएगा और अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों में विकास का कारण बनेगा।

अंत में, मॉडल परिधीय न्यूरोपैथी पर अनुसंधान का मार्गदर्शन करेगा, जैसे मल्टीपल स्क्लेरोसिस और पीएनएस18को संबद्ध वायरल-प्रेरित क्षति। पीएनएस को संक्रमित करने के लिए जाने जाने वाले कई न्यूरोट्रोपिक वायरस (यानी रेबीज वायरस, पोलियो वायरस, वेस्ट नाइल वायरस, जीका वायरस) के रोगजनन का भी अध्ययन,इस मॉडल19,20, 21,,,22का उपयोग करके किया जा सकता है ।22 फुटपैड टीका मॉडल दवा विकास के लिए एक संभावित लागत प्रभावी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह वायरल-प्रेरित परिधीय न्यूरोपैथी को रोकने के लिए डिज़ाइन की गई एंटी-भड़काऊ और एंटीवायरल दवाओं की प्रभावकारिता को स्क्रीन और परीक्षण करने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक हिस्टोपैथोलॉजी विश्लेषणों को निष्पादित करने वाले उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं को स्वीकार करते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक (एनआईएनएस) (आरओ1 एनएस033506 और आरओ1 एनएस060699) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody anti-PRV gB Made by the lab 1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red Fisher scientific 2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks) The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml) Fisher scientific 62248 1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm Sigma-Aldrich P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30028
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone, GE Healthcare life Sciences SH30088
Fine curved scissors stainless steel FST 14095-11
Fluoromount-G mounting media Fisher scientific 0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Isothesia Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml Denville Scientific 1000945
Microtube 1.5ml SARSTEDT 72692005
Negative goat serum Vector S-1000
Penicillin/Streptomycin Gibco 154022
Precision Glide needle 18G BD 305196
Razor blades steel back Personna 9412071
RNA lysis buffer (RLT) Qiagen 79216
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Superfrost/plus microscopic slides Fisher scientific 12-550-15
Tissue lyser LT Qiagen 69980
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
488 (goat anti-mouse) Life Technologies A11029 1/2000 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
  2. Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
  3. Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
  6. Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
  7. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
  8. Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
  9. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  10. Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
  11. Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
  12. Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
  13. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  14. Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
  15. Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
  16. Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
  17. Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
  18. Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
  19. MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
  20. Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
  21. Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
  22. Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).

Tags

इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 160 फुटपैड टीका चूहों वायरल इंफेक्शन अल्फाहेर्प्सवायरस छद्म वायरस नर्वस सिस्टम पृष्ठीय रूट गैंगलिया न्यूरोइंफ्लैमेशन इम्यूनोपैथोजेनिस साइटोकिन्स
वायरल प्रेरित न्यूरोइनफ्लैम्परी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए माउस फुटपैड टीका मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laval, K., Maturana, C. J., Enquist, … More

Laval, K., Maturana, C. J., Enquist, L. W. Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses. J. Vis. Exp. (160), e61121, doi:10.3791/61121 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter