Summary
Het voetpad inentingsmodel is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van virale geïnduceerde neuro-inducerende reacties in vivo. Het biedt met name een duidelijke beoordeling van virale kinetiek en bijbehorende immunopathologische processen die in het perifere zenuwstelsel worden geïnitieerd.
Abstract
Dit protocol beschrijft een voetpad inenting model dat wordt gebruikt om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alphaherpesvirus infectie bij muizen te bestuderen. Als alfaherpesvirussen zijn belangrijkste indringers van het perifere zenuwstelsel (PNS), dit model is geschikt om de kinetiek van virale replicatie, de verspreiding ervan van de PNS naar CNS, en de bijbehorende neuro-inflammatorische reacties te karakteriseren. Het voetpad inentingsmodel maakt het mogelijk virusdeeltjes te verspreiden van een primaire infectie site in het voetpad opperhuid tot zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich via de heupzenuw naar de rugwortel ganglia (DRG) en uiteindelijk via het ruggenmerg naar de hersenen. Hier wordt een muisvoetpad ingeënt met pseudorabiesvirus (PRV), een alfaherpesvirus dat nauw verwant is aan het Herpes simplex virus (HSV) en het varicella-zostervirus (VZV). Dit model toont aan dat PRV-infectie ernstige ontsteking veroorzaakt, gekenmerkt door neutrofiele infiltratie in het voetpad en DRG. Hoge concentraties inflammatoire cytokinen worden vervolgens gedetecteerd in gehomogeniseerde weefsels door ELISA. Daarnaast wordt een sterke correlatie waargenomen tussen PRV-gen- en eiwitexpressie (via qPCR en IF-kleuring) in DRG en de productie van pro-inflammatoire cytokinen. Daarom biedt het voetpad inentingsmodel een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën en kan het leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Daarnaast kan het model onderzoek naar perifere neuropathieën begeleiden, zoals multiple sclerose en bijbehorende virale schade aan de PNS. Uiteindelijk kan het dienen als een kosteneffectief in vivo instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Introduction
Deze studie beschrijft een voetpad inenting model om de replicatie en verspreiding van virussen te onderzoeken van de PNS naar CNS en de bijbehorende neuro-ontstekingsreacties. Het voetpad inentingsmodel is intensief gebruikt om alfaherpesvirusinfectie in neuronen1,2,,3te bestuderen. Het belangrijkste doel van dit model is om neurotrope virussen om een maximale afstand te reizen door de PNS voor het bereiken van de CNS. Hier wordt dit model gebruikt om nieuwe inzichten te verkrijgen in de ontwikkeling van een bepaalde neuropathie (neuropathische jeuk) bij muizen die besmet zijn met het pseudorabiesvirus (PRV).
PRV is een alfaherpesvirus gerelateerd aan verschillende bekende ziekteverwekkers (d.w.z. herpes simplex type 1 en 2 [HSV1 en HSV2] en varicella-zoster virus [VZV]), die koortsblaasjes, genitale laesies en waterpokken veroorzaken, respectievelijk4. Deze virussen zijn allemaal pantropisch en in staat om veel verschillende celtypes te infecteren zonder affiniteit te tonen voor een specifiek weefseltype. Ze vertonen echter allemaal een karakteristiek neurotropisme door de PNS (en af en toe het CNS) van gastsoorten binnen te vallen. De natuurlijke gastheer is het varken, maar PRV kan de meeste zoogdieren infecteren. In deze niet-natuurlijke gastheren, PRV infecteert de PNS en induceert een ernstige pruritus genaamd de "mad jeuk", gevolgd door peracute dood5,6. De rol van de neuro-immuunrespons in de klinische uitkomst en pathogenese van PRV-infectie is slecht begrepen.
Het voetpad inentingsmodel stelt PRV in staat om infectie in de opperhuidcellen van het voetpad te starten. Dan, de infectie verspreidt zich in zintuiglijke en sympathische zenuwvezels die innervate de opperhuid, zweetklieren, en dermis. De infectie verspreidt zich door virusdeeltjes die binnen ongeveer 60 uur via de heupzenuw naar de DRG bewegen. De infectie verspreidt zich door het ruggenmerg, uiteindelijk het bereiken van de achterhersenen wanneer dieren stervende raken (82 uur na infectie). Gedurende deze tijd venster, weefsel monsters kunnen worden verzameld, verwerkt, en geanalyseerd voor virus replicatie en markers van de immuunrespons. Bijvoorbeeld, histologisch onderzoek en virale belasting kwantificering kan worden uitgevoerd in verschillende weefsels om correlaties tussen de initiatie en ontwikkeling van klinische, virologische en neuro-inflammatoire processen in PRV pathogenese vast te stellen.
Met behulp van het voetpad inentingsmodel kunnen de cellulaire en moleculaire mechanismen van PRV-geïnduceerde pruritus bij muizen worden onderzocht. Bovendien kan dit model nieuw inzicht geven in de initiatie en ontwikkeling van door virussen geïnduceerde neuro-ontsteking tijdens herpesvirusinfecties. Een beter begrip van de processen die ten grondslag liggen aan alfaherpesvirus-geïnduceerde neuropathieën kan leiden tot de ontwikkeling van innovatieve therapeutische strategieën. Dit model is bijvoorbeeld nuttig om de mechanismen van neuropathische jeuk te onderzoeken bij patiënten met postherpetische laesies (bijvoorbeeld herpes zoster, gordelroos) en nieuwe therapeutische doelen bij muizen te testen op de overeenkomstige menselijke ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens een protocol (nummer 2083-16 en 2083-19) dat is beoordeeld en goedgekeurd door het Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) van Princeton University. Dit werk werd gedaan door strikt te volgen op de bioveiligheid niveau-2 (BSL-2) eisen, waaraan we een volledig uitgerust lab goedgekeurd door de Princeton University biosafety com. De procedures met inbegrip van muis voetpad slijtage, virale inenting, muis dissectie, en weefsel collectie werden uitgevoerd in een biologische veiligheid kast (BSC) in de Princeton University biocontainment dierlijke faciliteit kamer. Degenen die de procedure droegen wegwerpjurken, hoofddekking, oogbescherming, steriele handschoenen, chirurgische maskers, en schoenhoezen.
1. Muis voetpad slijtage
- Verdoes een C57BL/6 muis (5-7 weken oud) met isoflurane gasverdoving, geleverd bij een dosering van 3% via een klein anesthesiesysteem (kamer).
- Plaats de muis in het chirurgische vlak van anesthesie op zijn rug, voorafgaand aan inenting, in het achterste voetpad. Bevestig een neuskegel met een membraan (een spleet voldoende groot om de snuit van het dier te passen) aan de muis en lever isoflurane gasverdoving bij een constante dosering van 1,5%-2,0%.
- Houd de muis nauwlettend in de gaten voor een reactie op pijnlijke prikkels die worden gecreëerd door krachtig knijpen van de teen met tangen.
- Pak een achtervoetpad met platte tangen licht vast.
- Schuur de glabroushuid van het achterste voetpad ongeveer 20x, tussen de hiel en wandelpads, met een emery board (100-180 grit). Verdring geen bloedingen door te vaak te schuren of te veel druk uit te oefenen.
- Met behulp van fijne tangen, langzaam schil van de stratum corneum losgemaakt door slijtage aan de stratum basale bloot te stellen.
2. PRV-voetpadinenting
- Bereid het virusintmateriaal verdund tot de gewenste titer in DMEM-media met 2% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (Tabel van materialen).
- Kwantificeren van het aantal plaquevormende eenheden (PFU) in de virusvoorraad op PK15-cellen om de virale dosis te berekenen en te standaardiseren en het virale entmateriaal dienovereenkomstig te verdunnen.
OPMERKING: In deze studie werd virulente prv-stam (PRV-Becker) gebruikt bij een dosis van 8 x 106 PFU. Deze dosis werd geoptimaliseerd in een eerder vooronderzoek om ervoor te zorgen dat alle ingeënte dieren klinische symptomen vertoonden bij 82 uur na inenting (hpi). - Houd het virus enent op ijs en meng voorzichtig voor gebruik.
- Kwantificeren van het aantal plaquevormende eenheden (PFU) in de virusvoorraad op PK15-cellen om de virale dosis te berekenen en te standaardiseren en het virale entmateriaal dienovereenkomstig te verdunnen.
- Voeg een druppel van 20 μL van virusenoculum (8 x 106 PFU) toe aan het geschuurde voetpad (actuele toediening). Voer schijninentingen (alleen gemiddeld) parallel uit.
- Wrijf voorzichtig 10x met de schacht van een naald om adsorptie van het virus te vergemakkelijken. Vermijd krassen met het naaldpunt. Herhaal deze stap elke 10 minuten.
- Houd de muis 30 minuten onder narcose totdat het geschuurde voetpad droog is.
- Na het stoppen van anesthesie, controleer de muis totdat deze kan handhaven sternale recumbency en plaats deze in een individuele kooi voor klinische follow-up en bemonstering.
3. Muizendissectie en weefselverzameling
- Op de juiste momenten na infectie, euthanaseren de muis door de verstikkingsmethode (CO2).
OPMERKING: In deze studie is het humane eindpunt (wanneer dieren beginnen terminale symptomen te vertonen) voor met PRV-Becker geïnfecteerde muizen 82 hpi. Euthanaseer de controledieren parallel. - Plaats de muis ventrale kant naar boven gericht op een chirurgische mat met behulp van naalden / pinnen. Zet de ledematen van de muis met pinnen vast aan een chirurgisch schuimbord. Maak de ventrale kant van de muis nat met 70% ethanol om bontverontreiniging te minimaliseren.
- Knijp de externe laag van bont en huid met behulp van tangen en maak een kleine initiële incisie met behulp van fijne schaar in de buurt van de urethrale opening.
- Vanaf deze opening, blijven de incisie op het midden ventrale kant tot aan de kin.
- Verleng twee laterale insnijdingen naar de ledematen van de voorpoten en de achterste ledematen.
- Scheid de huid van de onderliggende spierlaag en pin naar de zijkant.
- Open de buikholte en snij in tot aan de basis van de thorax. Voltooi de opening van de buikholte door twee transversale insnijdingen te maken.
- Open de borstholte door het middenrif en de ribben aan beide zijde te snijden.
LET OP: Het snijden van de zijkanten van de ribbenkast voorkomt het risico van het snijden van het hart. - Verzamel blootgestelde organen, waaronder hart, longen, milt, alvleesklier, lever, nieren en blaas in 1,5 mL microbuisjes. Hou de buizen op ijs.
- Snijd het geschuurde voetpad tussen de hiel en wandelpads en plaats het stuk weefsel in een buis zoals beschreven in stap 3.3.6.
- Plaats de muis rugzijde omhoog en nat de vacht met 70% ethanol. Snijd de huidlaag om de wervelkolom bloot te leggen.
- Maak een kleine incisie in de regio van het bekken. Strip de huid van de achterste ledematen naar het hoofd.
- Verwijder de benen en armen door te snijden met een schaar parallel met en dicht bij de wervelkolom aan beide zijden.
- Snijd het hoofd af aan de basis van de schedel (C1-C2-niveau).
- Snijd de schedel open met een schaar van de foramen magnum tot het voorste bot.
- Trek de schedel open in zijrichtingen met tangen.
- Schep voorzichtig de hersenen met behulp van tangen en ga verder zoals beschreven in stap 3.3.6.
- Reinig de wervelkolom door het snijden van spier-, vet- en zachte weefsels met behulp van gebogen schaar. Snijd de staart door. Plaats de intacte wervelkolom in een buis van 15 mL met steriele ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd buizen op ijs tot verdere dissectie van het ruggenmerg en DRG.
4. Ruggenmerg en DRG-extractie
OPMERKING: Haal ruggenmerg en DRG direct na muisdissectie uit de wervelkolom. Het protocol voor ruggenmerg en DRG-extractie is aangepast aan een eerdere publicatie7.
- Verwijder de wervelkolom van de wervels uit de ijskoude PBS-buis en verwijder de resterende zachte weefsels, die na de koeling gemakkelijker worden.
- Maak drie dwarse sneden in de kolom door de wervels (T1, L1 en S2 niveaus) met behulp van een scheermesje. Plaats de drie stukken in een petrischaaltje van 15 mm met steriele ijskoude PBS. Houd de oorsprong van segmenten bij en markeer deze voor latere analyses.
- Neem een segment en zet het tussen tangen, rugkant naar boven gericht. Maak een enkele, longitudinale gekapt door de middellijn met behulp van een scheermesje, het splitsen van de kolom in twee gelijke helften.
- Plaats beide helften in een nieuwe petrischaal met nieuwe steriele ijskoude PBS. Zorg voor de juiste oriëntatie van het segment om de linker- en rechterkant te kunnen onderscheiden.
- Pel onder een ontledenmicroscoop het ruggenmerg voorzichtig uit de wervelkolom van elke helft in een rostral tot caudal richting met behulp van fijne tangen.
- Verzamel beide ruggenmerghelften in 1,5 mL microbuisjes met 500 μL steriele ijskoude PBS. Hou de buizen op ijs.
- Verwijder de hersenvliezen voorzichtig van de ene kant van de wervelkolom naar de andere om de DRG bloot te leggen.
- Verwijder elke DRG individueel door het grijpen van de blootgestelde spinale zenuw en trek het zachtjes uit de wervelkolom. Plaats de verzamelde DRG in een petrischaaltje van 15 mm met ijskoude PBS. Oogst alle ipsilaterale en contralaterale DRG los van het segment van de wervelkolom en ga verder zoals beschreven in stap 4.5.
LET OP: De DRG is zichtbaar als een ronde transparante structuur langs de witte ruggenmergzenuw. - Herhaal stappen 4.3–4.7 met behulp van de twee andere wervelkolom segmenten binnen 30-45 min.
- Centrifuge alle buizen op hoge snelheid (17.900 x g)gedurende 3 min bij 4 °C.
- Aanzuigen supernatant en flash-freeze buizen in vloeibare stikstof. Bewaar buizen bij -80 °C voor verdere weefselhomogenisatie.
- U ook de gereinigde DRG en andere muisweefsels repareren en doorsnee voor histopathologische analyses en/of immunofluorescentievlekken na stap 4.9.
5. Weefselhomogenisatie
- Ontdooi de buizen met bevroren weefselmonsters op ijs.
- Weeg 100 mg weefsel af en plaats het in een 2 mL microcentrifugebuis met een steriele stalen kraal en 500 μL RIPA-buffer met 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 MCl, 10% SDS en protease cocktailtabletten.
- Verstoor weefsels bij kamertemperatuur (RT) met behulp van een homogenisator bij 20 cycli/s gedurende 2 min, gevolgd door een wachttijd van 1 min, vervolgens 20 cycli/s gedurende 2 min.
- Centrifuge de buis op hoge snelheid (17.900 x g) gedurende 10 minuten bij RT.
- Verzamel supernatant (500 μL) in een nieuwe buis en bewaar deze op -20 °C tot het uitvoeren van ELISA en qPCR om respectievelijk ontstekingsmarkers en virale belastingen te kwantificeren.
OPMERKING: Voor qPCR verzamel u alle monsters met RNase-vrij materiaal (d.w.z. kralen, buizen, enz.) en verstoor weefsels met RNA lysebuffer met 1% betamercaptoethanol (Tabel van materialen).
6. Preparaten en immunofluorescentie kleuring van bevroren DRG-secties
- Weefselverwerking
- Fix de ontleed en gereinigd DRG in 1% paraformaldehyde (PFA) voor 2 uur op RT.
- Breng het weefsel over in een buis van 15 mL met 10% sacharose in PBS. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Breng het weefsel over in een buis van 15 mL met 20% sacharose in PBS. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Breng het weefsel over in een buis van 15 mL met 30% sacharose in PBS. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Sluit weefsels in OKT met behulp van een cryomold en plaats blokken in droogijs voor een snelle bevriezing.
- Bewaar de monsters op -80 °C tot gebruik.
- Cryosectioning voorbereiding
- Verwijder het bevroren blok van -80 °C en laat het 30 minuten in de cryostatkamertemperatuur in evenwicht brengen.
- Cryosection de DRG bij een dikte van 15 μm en monteer de secties op dia's.
- Gebruik een pen om een hydrofobe cirkel rond het op de schuif gemonteerde weefsel te tekenen.
- Houd de glijbanen op 4 °C tot de kleuring.
- Immunofluorescentie kleuring
- Was de DRG secties 3x in PBS gedurende 10 minuten op RT.
- Incubeer de secties met 100 μL gewenst primair antilichaam (bijvoorbeeld muisantilichaam tegen PRV glycoprotein B) gedurende 1 uur bij 37 °C. Verdun het primaire antilichaam in PBS met 10% negatief geitenserum.
- Herhaal stap 6.3.1.
- Incubeer de secties met 100 μL gewenst secundair antilichaam (geitenantimuis Alexa Fluor 488) gedurende 50 minuten bij 37 °C. Verdun secundair antilichaam alleen in PBS.
- Voeg 100 μL DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) kleurstof verdund in PBS op de sectie. Verdere incubeermonsters 10 min bij 37 °C.
- Herhaal stap 6.3.1.
- Monteer de monsters met behulp van een fluorescentie montagemedium op glazen platen en veilig en dekken met coverslip.
7. Preparaten en H&E-kleuring van in paraffine ingebedde weefselsecties
- Bevestig het weefsel in 10% formaline gedurende 24 uur bij 4 °C.
- Voer standaard verwerkingsschema uit voor paraffine inbedding en sectie van vaste weefsels. Breng vaste weefsels over naar 70% ethanol en verwerk verbeterde alcoholen naar xyleen, gevolgd door paraffine, zoals eerder beschreven8.
OPMERKING: Gebruik polyester sponzen om kleine weefselmonsters zoals DRG in cassettes te bewaren. - Voer standaard deparaffinisatie uit, gevolgd door H&E-kleuring van weefselsecties, zoals eerder beschreven9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het muisvoetpad inentingsmodel maakt karakterisering van de immunopathogenese van alfaherpesvirusinfectie in vivo mogelijk, inclusief replicatie en verspreiding van de infectie van het ingeënte voetpad naar het zenuwstelsel en de inductie van specifieke neuro-inflammatoire reacties.
In deze studie schuurden we eerst het achtervoetpad van de muis en hebben we het geschuurde of ingeënt gebied met een virulente stam van PRV (PRV-Becker) geschuurd of ingeënt. De plaats van slijtage was zichtbaar in het controlevoetpad. Een korst werd gevormd op de slijtplaats als onderdeel van het genezingsproces(figuur 1, zwarte pijl). Muizen ingeënt met PRV vertoonden daarentegen een ernstige ontsteking bij het humane eindpunt (82 hpi), gekenmerkt door zwelling van het voetpad en roodheid.
Na voetpad inenting met de virulente PRV-Becker stam, muizen begon met klinische symptomen op 72 hpi, gekenmerkt door zwelling van de ingeënte voetpad en steeds vaker tremoren. Door 82 hpi, PRV-Becker geïnfecteerde muizen toonde constante tremoren in de ingeënte been en onderscheidende PRV symptomen, met inbegrip van intense krassen en bijten van de voet. Ernstige ontsteking werd ook waargenomen in het voetpad. De ontstekingsreactie die werd veroorzaakt tijdens prv-infectie werd vervolgens verder gekarakteriseerd, inclusief de infiltratie van immuuncellen in weefsels.
Histopathologisch onderzoek van verschillende weefsels werd uitgevoerd, waaronder het ingeënt voetpad en drg, gevolgd door H&E-kleuring van paraffine-ingebedde weefselsecties. Epidermale necrose en ernstige huidontsteking (oedeem en fibrine) werden waargenomen in PRV-geïnfecteerde voetsecties(figuur 2A, paneel b). De opperhuid, dermis, en bindweefsel van geïnfecteerde muizen toonde een massale infiltratie van neutrofielen (geïdentificeerd door multilobed kernen) gemarkeerd met zwarte pijlen. Voetpaden van controlemuizen waren normaal(figuur 2A, paneel a). PRV-geïnfecteerde DRG toonde minimale neuronale necrose en gemengde ontsteking in geïnfecteerde muizen, terwijl de DRG van controlemuizen normaal waren(figuur 2B, panelen a en b). De gemengde ontstekinginfiltreren bestond voornamelijk uit neutrofielen en lymfocyten.
Vervolgens werden de kinetiek van inflammatoire cytokineproductie in muisweefsel vastgesteld nadat PRV-voetpadinenting werd vastgesteld. Niveaus van specifieke ontstekingscytokinen werden gekwantificeerd (d.w.z. interleukine-6 [IL-6] en granulocytenkolonie stimulerende factor [G-CSF]) uit verschillende weefsels verzameld en gehomogeniseerd uit controle en PRV-geïnfecteerde muizen. De resultaten toonden een aanzienlijke toename van het G-CSF-niveau in het voetpad en drg ten opzichte van de controles op 7 hpi en 82 hpi (figuur 3A). Significante G-CSF niveaus werden waargenomen bij 82 hpi in het ruggenmerg, hersenen, hart, en leverweefsel van PRV-geïnfecteerde muizen in vergelijking met controles. Bovendien werden in alle weefsels van met PRV geïnfecteerde muizen significante IL-6-niveaus vastgesteld in vergelijking met controles vanaf 24 pki(figuur 3B).
Het voetpad inenting model werd verder gebruikt om PRV replicatie te onderzoeken en verspreid van de ingeënte voetpad naar de PNS en CNS en potentiële correlaties met neuro-inflammatoire respons ontwikkeling. PRV-belastingen werden door qPCR in verschillende gehomogeniseerde weefsels gekwantificeerd om het PRV-DNA te versterken. DNA-concentratie werd vervolgens omgezet in PFU, zoals eerder beschreven10. PRV ladingen werden gedetecteerd in het voetpad vanaf 24 hpi (~ 1 x 104 PFU/mg weefsel) en in DRG vanaf 60 hpi (~ 1 x 103 PFU/mg weefsel; gegevens niet getoond).
In een stervende toestand (82 hpi), PRV werd gedetecteerd in het voetpad, DRG, ruggenmerg, en hersenen, met de hoogste concentratie van PRV in DRG (~ 1 x 105 PFU / mg van weefsel; Figuur 4). PRV-infectie van DRG werd bevestigd door indirecte immunofluorescentie kleuring van DRG cryosections. PRV infectie werd gedetecteerd in DRG neuronen met behulp van anti-PRV gB antilichaam. PRV glycoprotein gB werd uitgedrukt tijdens de late stadia van infectie in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen. Zoals verwacht werd de cytoplastische expressie van PRV gB (groen) bevestigd in geïnfecteerde DRG, terwijl geen gB werd uitgedrukt in controlemonsters (figuur 5). Celkernen werden geïdentificeerd met DAPI-kleuring (blauw).
Figuur 1: Representatieve afbeeldingen van muis rechter achterpoten na PRV-inenting. Muizen worden ofwel bespot of ingeënt met PRV in het geschuurde rechter achtervoetpad. PRV-ingeënt voetpad vertoont tekenen van ontsteking, waaronder roodheid en zwelling bij humane eindpunt (82 hpi). Het voetpad van controlemuizen lijkt normaal met een donkerrode korst op de geschuurde plaats, wat aangeeft dat de wond geneest. Zwarte pijlen geven de plaats van slijtage aan. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Histopathologische bevindingen in voetpad en DRG na PRV voetpad inenting. Hematoxylin en eosine (H&E) kleuring van (A) muis ingeënt voetpaden en (B) en ipsilaterale DRG van control (paneel a) en PRV-geïnfecteerde (paneel b) muizen op 82 hpi. Histopathologische manifestaties waargenomen in PRV-geïnfecteerde weefsels (epidermale en neuronale necrose en neutrofiele infiltratie) zijn afwezig bij alle onderzochte mock-geïnfecteerde muizen. De resultaten zijn representatief voor drie biologische replica's voor een bepaald type weefsel. Zwarte pijlen geven representatieve gebieden van ontsteking met immuuncel infiltratie. Voor elke afbeelding worden schaalbalken (50 μm) aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kinetiek van inflammatoire cytokineproductie in gehomogeniseerde muisweefsels na PRV-voetpadinenting. (A) G-CSF en (B) IL-6 eiwitniveaus gedetecteerd in PRV-geïnfecteerde (rood) en controle (zwarte) muis gehomogeniseerde weefsels op verschillende hpi. Eiwitgehalten worden gekwantificeerd door ELISA en uitgedrukt als picogram (pg) per milligram (mg) gehomogeniseerd weefsel (n = 5 per groep, *p < 0,05, ns = niet significant). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van prv-genoom in gehomogeniseerde weefsels van muizen. PRV DNA wordt gekwantificeerd in gehomogeniseerde muisweefsels door qPCR met behulp van PRV UL54 primers. PRV-belastingen worden uitgedrukt als plaquevormende eenheden (PFU) per mg weefsel. PRV DNA wordt alleen gedetecteerd in de voet, DRG, ruggenmerg en hersenen (en niet in andere weefsels), n = 10 per groep. Stippellijn toont de detectielimiet. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Beoordeling van PRV-infectie bij DRG-neuronen door immunofluorescentie kleuring. Confocale Z-stack beelden van mock- en PRV-geïnfecteerde DRG-neuronen na immunofluorescentie kleuring met behulp van een muis antilichaam specifiek voor PRV gB (groen). Celkernen zijn gekleurd met DAPI (blauw, panelen a en c). Panel d toont verschillende PRV-geïnfecteerde neuronen uitdrukken gB (witte pijlen). Er wordt geen gB-expressie gedetecteerd in de DRG-secties van het besturingselement (paneel b). Voor elke afbeelding worden schaalbalken (50 μm) aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven voetpad inentingsmodel is nuttig om de initiatie en ontwikkeling van neuro-inflammatoire reacties tijdens alfaherpesvirusinfectie te onderzoeken. Bovendien wordt dit in vivo model gebruikt om de kinetiek van replicatie en verspreiding van alfaherpesvirus van het PNS naar CNS vast te stellen. Dit is een alternatief voor andere inentingsmodellen, zoals het flankhuidinentingsmodel, dat is gebaseerd op diepe huidkrassen13, of de intracraniale route, die het virus rechtstreeks introduceert in het CNS14,15,16. Als gevolg hiervan is het met het voetpadmodel mogelijk om een meer gedetailleerde beoordeling van virale kinetiek van replicatie te verkrijgen en zich te verspreiden met bijbehorende lokale en verre immunopathologische processen in het zenuwstelsel11,12.
In dit protocol zijn de slijtage van het voetpad en de daaropvolgende virale inenting cruciale stappen. Inderdaad, het stratum corneum moet volledig worden verwijderd na voldoende slijtage om de stratum basale bloot te stellen aan virale entmateriaal voor een succesvolle infectie. De slijtage moet echter zacht zijn en geen bloeding veroorzaken, omdat dit helpt infectie van de bloedcirculatie te voorkomen. De vrijstaande stratum corneum kan worden gevisualiseerd door H & E kleuring onder lichte microscopie. De corneocyten aanwezig in het stratum corneum zijn platte, eosinofiele cellen die geen kernen hebben. Het volume van het virale entmateriaal (20 μL druppel) is geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de druppel op het voetpad blijft en de geschuurde site bedekt. Zachtjes wrijven de inoculum druppel op de geschuurde voetpad is essentieel voor een efficiënte virale penetratie. Het wordt aanbevolen om te wachten tot het voetpad volledig droog is om de anesthesie te stoppen en het dier in een nieuwe kooi te plaatsen. Deze stap voorkomt dat de muis het virale entmateriaal van het geschuurde voetpad likt. Het wordt aanbevolen om maximaal drie muizen tegelijk te verwerken, met behulp van een neuskegel die is ingesteld om ze tegelijkertijd bloot te stellen aan anesthesie.
Tijdens het uitvoeren van de muisdissectie is het belangrijk om sneden parallel aan de wervelkolom te maken, wat schade aan het ruggenmerg en bijbehorende DRG voorkomt. Het wordt ook voorgesteld om zo veel vet, spier, en zacht weefsel mogelijk te verwijderen om per ongeluk snijden in de wervelkolom te verminderen en een betere grip op de kolom segment met tangen te vergemakkelijken voordat het kappen van de middellijn.
Het wordt ook aanbevolen om dwarse sneden uit te voeren door de wervelkolom van de wervels tussen schijven om gereinigde kolomsegmenten te produceren en het risico op beschadiging van DRG-paren te beperken. De hersenvliezen rond het ruggenmerg en het bedekken van de DRG moeten volledig worden verwijderd om de identificatie en extractie van DRG te vergemakkelijken. De DRG moet zorgvuldig uit de wervelkolom worden verwijderd zonder schade van de tangen. Het is belangrijk dat DRG intact blijft voor H&E en immunofluorescentie kleuring. Timing is van cruciaal belang voor de efficiëntie van dit in vivo experiment, en de muis dissectie en ruggenmerg / DRG extractie moet achtereenvolgens worden uitgevoerd om weefsel dat zo vers mogelijk te verzamelen.
De hier beschreven weefselhomogenisatiemethode is geoptimaliseerd om een efficiënte verstoring van een groot aantal heterogene weefselmonsters te garanderen. Het is van het grootste belang om de hoeveelheid gebruikte weefsel te standaardiseren, waardoor elisa- en qPCR-resultaten tussen de monsters direct kunnen worden vergeleken. Bijvoorbeeld, wordt voorgesteld om 100 mg weefsel te wegen voor elke homogenisatie procedure. Elk weefselmonster moet in zijn geheel worden gehomogeniseerd en restjes mogen niet worden bevroren. Het is belangrijk om de stalen kralen en tangen voor gebruik autoclave om besmetting tijdens homogenisatie te voorkomen. Een volume van 500 μL is optimaal om een volledig homogenisatie van een weefselmonster van 100 mg te garanderen. Het is belangrijk op te merken dat dit beperkte volume alleen de verwerking van drie tot vier ELISA-kits per monster mogelijk maakt.
Met behulp van het voetpad inentingsmodel werd aangetoond dat PRV-infectie bij muizen ernstige ontstekingen veroorzaakt, gekenmerkt door neutrofiele infiltratie in het voetpad en DRG. Hoge concentraties inflammatoire cytokines G-CSF en IL-6 werden ook gedetecteerd in veel gehomogeniseerde weefsels met behulp van ELISA. Daarnaast werd een sterke correlatie gevonden tussen PRV-gen- en eiwitexpressie (door qPCR en IF-kleuring) in DRG en de productie van beide pro-inflammatoire cytokinen.
Dit model is geschikt om de kinetiek van virale replicatie / spread te vergelijken, evenals neuro-inflammatorische reacties onder verschillende alfaherpesvirus infecties. Wat VZV betreft, hebben bijvoorbeeld de beperkte host-specificiteit en het gebrek aan klinische ziekte het gebruik van diermodellenbeperkt 17. Daarom kan het muisvoetpad PRV-inentingsmodel een nieuw diermodel vormen voor de studie van de cellulaire en moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor neuropathische pruritus bij patiënten met postherpetische laesies. Op basis van de overeenkomsten in klinische symptomen, pathogenese en genomen tussen VZV en PRV, wordt aangenomen dat dit muismodel het begrip van VZV pathogenese zal verbeteren en zal leiden tot de ontwikkelingen in innovatieve therapeutische strategieën.
Ten slotte zal het model onderzoek naar perifere neuropathieën begeleiden, zoals multiple sclerose en bijbehorende virale schade aan de PNS18. De pathogenese van verschillende neurotrope virussen (d.w.z. rabiësvirus, poliovirus, West-Nijlvirus, Zika-virus), waarvan bekend is dat ze de PNS infecteren, kunnen ook worden bestudeerd met behulp van dit model19,20,21,22. Het voetpad inentingsmodel kan worden gebruikt als een mogelijk kosteneffectief instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Het kan bijvoorbeeld dienen als een platform om de werkzaamheid van ontstekingsremmende en antivirale geneesmiddelen te screenen en te testen die zijn ontworpen om virale geïnduceerde perifere neuropathieën te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Charles River laboratoria voor hun uitstekende technische ondersteuning bij het uitvoeren van de histopathologie analyses. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 en RO1 NS060699). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
