Summary
O modelo de inoculação do footpad é uma ferramenta valiosa para caracterizar respostas neuroinflamatórias invulgadas pelo viral in vivo. Em particular, fornece uma avaliação clara da cinética viral e processos imunopatológicos associados iniciados no sistema nervoso periférico.
Abstract
Este protocolo descreve um modelo de inoculação de footpad usado para estudar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alphaherpesvírus em camundongos. Como os alfaherpesvírus são os principais invasores do sistema nervoso periférico (PNS), este modelo é adequado para caracterizar a cinética da replicação viral, sua disseminação da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad permite que partículas de vírus se espalhem de um local de infecção primária no pênco epiderme para fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, glândulas sudoríparas e derme. A infecção se espalha através do nervo ciático para a gânglio raiz dorsal (DRG) e, finalmente, através da medula espinhal para o cérebro. Aqui, um footpad de rato é inoculado com o vírus pseudorabies (PRV), um alphaherpesvirus intimamente relacionado ao vírus herpes simplex (HSV) e ao vírus varicela-zoster (VZV). Este modelo demonstra que a infecção por PRV induz inflamação grave, caracterizada pela infiltração de neutrófilos no footpad e DRG. Altas concentrações de citocinas inflamatórias são posteriormente detectadas em tecidos homogeneizados pela ELISA. Além disso, observa-se uma forte correlação entre a expressão genética prv e proteína (via qPCR e se coloração) em DRG e a produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, o modelo de inoculação do footpad proporciona uma melhor compreensão dos processos subjacentes às neuropatias induzidas pelo alfaherpesvírus e pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Além disso, o modelo pode orientar pesquisas sobre neuropatias periféricas, como esclerose múltipla e danos induzidos por virais associados à PNS. Em última análise, pode servir como uma ferramenta in vivo econômica para o desenvolvimento de medicamentos.
Introduction
Este estudo descreve um modelo de inoculação de footpad para investigar a replicação e disseminação de vírus da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad tem sido intensamente utilizado para estudar a infecção por alfaherpesvírus nos neurônios1,,2,3. O principal objetivo deste modelo é permitir que os vírus neurotrópicos percorram uma distância máxima através da PNS antes de atingir o CNS. Aqui, este modelo é usado para obter novas percepções no desenvolvimento de uma neuropatia particular (coceira neuropática) em camundongos infectados com o vírus pseudorabies (PRV).
PRV é um alphaherpesvirus relacionado a vários patógenos conhecidos (ou seja, herpes simplex tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e vírus varicela-zoster [VZV]), que causam feridas frias, lesões genitais e catapora,respectivamente 4. Esses vírus são todos pantrópicos e capazes de infectar muitos tipos de células diferentes sem mostrar afinidade por um tipo específico de tecido. No entanto, todos eles exibem um neurotropismo característico invadindo a PNS (e ocasionalmente, o CNS) de espécies hospedeiras. O hospedeiro natural é o porco, mas o PRV pode infectar a maioria dos mamíferos. Nesses hospedeiros não naturais, o PRV infecta a PNS e induz um prurido grave chamado "coceira louca", seguido de morte peraguada5,6. O papel da resposta neuroimune no desfecho clínico e na patogênese da infecção pelo PRV tem sido mal compreendido.
O modelo de inoculação do footpad permite que o PRV inicie a infecção nas células epidérmicas do footpad. Em seguida, a infecção se espalha em fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, as glândulas sudoríparas e a derme. A infecção se espalha por partículas de vírus movendo-se através do nervo ciático para o DRG dentro de aproximadamente 60 h. A infecção se espalha pela medula espinhal, atingindo o cérebro traseiro quando os animais ficam moribundos (82 h pós-infecção). Durante esta janela de tempo, amostras de tecido podem ser coletadas, processadas e analisadas para replicação de vírus e marcadores da resposta imune. Por exemplo, o exame histológico e a quantificação da carga viral podem ser realizados em diferentes tecidos para estabelecer correlações entre o início e o desenvolvimento de processos clínicos, virológicos e neuroinflamatórios na patogênese prv.
Utilizando o modelo de inoculação do footpad, os mecanismos celulares e moleculares do prurido induzido pelo PRV em camundongos podem ser investigados. Além disso, este modelo pode fornecer uma nova visão sobre a iniciação e desenvolvimento da neuroinflamação induzida pelo vírus durante infecções por herpesvírus. Uma melhor compreensão dos processos subjacentes a neuropatias induzidas por alphaherpesvírus pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Por exemplo, este modelo é útil para investigar os mecanismos de coceira neuropática em pacientes com lesões pós-herpéticas (por exemplo, herpes zoster, telhas) e testar novos alvos terapêuticos em camundongos para as doenças humanas correspondentes.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo (número 2083-16 e 2083-19) revisado e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Instituição (IACUC) da Universidade de Princeton. Este trabalho foi feito seguindo rigorosamente os requisitos de nível 2 (BSL-2) de biossegurança, aos quais temos um laboratório totalmente equipado aprovado pelo comitê de biossegurança da Universidade de Princeton. Os procedimentos, incluindo abrasão do pé do rato, inoculação viral, dissecção de camundongos e coleta de tecidos foram realizados em um gabinete de segurança biológica (BSC) na sala de biocontenção de animais da Universidade de Princeton. Os que realizaram o procedimento usavam vestidos descartáveis, cobertura da cabeça, proteção ocular, luvas estéreis, máscaras cirúrgicas e capas de sapato.
1. Abrasão do footpad do mouse
- Anestesia um rato C57BL/6 (5-7 semanas de idade) com anestésico de gás isoflurane, entregue a uma dosagem de 3% através de um pequeno sistema de anestesia (câmara).
- Coloque o rato no plano cirúrgico da anestesia nas costas, antes da inoculação, no fundo do pé traseiro. Conecte um cone de nariz com um diafragma (uma fenda suficientemente dimensionada para caber a focinheira do animal) ao rato e entregue anestésico de gás isoflurane a uma dose constante de 1,5%-2,0%.
- Monitore de perto o mouse para uma resposta a estímulos dolorosos criados por beliscões forçadas do dedo do dedo do dedo com fórceps.
- Segure levemente um footpad traseiro com fórceps planos.
- Abrade suavemente a pele glabrous do footpad traseiro aproximadamente 20x, entre o calcanhar e as almofadas de caminhada, com uma placa emery (100-180 grão). Não induza o sangramento por abradas com muita frequência ou aplicando muita pressão.
- Usando fórceps finos, retire lentamente o estrato corneum destacado pela abrasão para expor o basale estrato.
2. Inoculação do bloco de rodas PRV
- Prepare o vírus inóculo diluído ao titer desejado em mídia DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina(Tabela de Materiais).
- Quantita o número de unidades formadoras de placas (PFU) no estoque de vírus em células PK15 para calcular e padronizar a dose viral e diluir o inóculo viral em conformidade.
NOTA: Neste estudo, foi utilizada cepa virulenta de PRV-Becker (PRV-Becker) em dose de 8 x 106 PFU. Esta dose foi otimizada em um experimento preliminar anterior para garantir que todos os animais vacinados apresentassem sintomas clínicos em 82 h pós-inoculação (hpi). - Mantenha o vírus inóculo no gelo e misture suavemente antes de usar.
- Quantita o número de unidades formadoras de placas (PFU) no estoque de vírus em células PK15 para calcular e padronizar a dose viral e diluir o inóculo viral em conformidade.
- Adicione uma gotícula de 20 μL de inóculo do vírus (8 x 106 PFU) no footpad abraded (administração tópica). Realizar inoculações simuladas (somente médias) em paralelo.
- Esfregue suavemente 10x com o eixo de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus. Evite coçar com o ponto da agulha. Repita este passo a cada 10 minutos.
- Mantenha o rato sob anestesia por 30 minutos até que o bloco de pés abrasado esteja seco.
- Depois de parar a anestesia, monitore o camundongo até que ele possa manter a recumbência severa e colocá-lo em uma gaiola individual para acompanhamento clínico e amostragem.
3. Dissecção de ratos e coleta de tecidos
- Em momentos apropriados após a infecção, eutanize o camundongo pelo método de asfixia (CO2).
NOTA: Neste estudo, o ponto final humano (quando os animais começam a apresentar sintomas terminais) para camundongos infectados pelo PRV-Becker é de 82 hpi. Eutanize animais de controle em paralelo. - Coloque o lado ventral do mouse voltado para cima em um tapete cirúrgico usando agulhas/pinos. Fixar os membros do rato com pinos em uma placa de espuma cirúrgica. Molhe o lado ventral do mouse com 70% de etanol para minimizar a contaminação da pele.
- Aperte a camada externa de pele e pele usando fórceps e faça uma pequena incisão inicial usando uma tesoura fina perto da abertura uretral.
- A partir desta abertura, continue a incisão no lado ventral médio até o queixo.
- Estenda duas incisões laterais em direção às extremidades dos membros dianteiros e traseiros.
- Separe a pele da camada muscular subjacente e fixe para baixo para o lado.
- Abra a cavidade abdominal e incise até a base do tórax. Complete a abertura da cavidade abdominal fazendo duas incisões transversais.
- Abra a cavidade torácica cortando o diafragma e as costelas em ambos os lados laterais.
NOTA: Cortar as laterais da caixa torácica evita o risco de cortar o coração. - Coletar órgãos expostos, incluindo coração, pulmões, baço, pâncreas, fígado, rins e bexiga em microtubos de 1,5 mL. Mantenha os tubos no gelo.
- Corte o bloco de pé abrasado entre o calcanhar e as almofadas de caminhada e coloque o pedaço de tecido em um tubo, conforme descrito na etapa 3.3.6.
- Coloque o lado dorsal do rato para cima e molhe a pele com 70% de etanol. Corte a camada da pele para expor a coluna vertebral.
- Faça uma pequena incisão na região da pélvis. Retire a pele dos membros traseiros em direção à cabeça.
- Remova as pernas e braços cortando com uma tesoura paralela e próxima à coluna vertebral de ambos os lados.
- Corte a cabeça na base do crânio (nível C1-C2).
- Abra o crânio com uma tesoura do forame magnum até o osso frontal.
- Puxe o crânio em direções laterais usando fórceps.
- Retire suavemente o cérebro usando fórceps e prossiga como descrito na etapa 3.3.6.
- Limpe a coluna vertebral cortando músculos, gorduras e tecidos moles usando tesouras curvas. Corte a cauda. Coloque a coluna vertebral intacta em um tubo de 15 mL contendo soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS). Mantenha os tubos no gelo até uma dissecção adicional da medula espinhal e drg.
4. Extração da medula espinhal e DRG
NOTA: Extrair medula espinhal e DRG da coluna vertebral após a dissecção do rato. O protocolo para extração da medula espinhal e DRG foi adaptado de uma publicação anterior7.
- Remova a coluna de vértebras do tubo PBS gelado e remova os tecidos moles restantes, o que se torna mais fácil após a refrigeração.
- Faça três cortes transversais na coluna através das vértebras (níveis T1, L1 e S2) usando uma lâmina de barbear. Coloque as três peças em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS estéril e gelada. Acompanhe e marque a origem dos segmentos para análise posterior.
- Pegue um segmento e fixe-o entre fórceps, lado dorsal voltado para cima. Faça um único corte longitudinal através da linha média usando uma lâmina de barbear, dividindo a coluna em duas metades iguais.
- Coloque ambas as metades em uma nova placa de Petri contendo novo PBS gelado estéril. Certifique-se de que a orientação correta do segmento seja capaz de distinguir os lados esquerdo e direito.
- Sob um microscópio dissecando, retire suavemente a medula espinhal da coluna vertebral de cada metade em uma direção rostral para caudal usando fórceps finos.
- Colete as duas metades da medula espinhal em microtubos de 1,5 mL contendo 500 μL de PBS gelado estéril. Mantenha os tubos no gelo.
- Remova suavemente as meninges de um lado da coluna vertebral para o outro para expor o DRG.
- Remova cada DRG individualmente, agarrando o nervo espinhal exposto e puxe-o suavemente para fora da coluna vertebral. Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS gelada. Colher todos os DRG ipsilaterais e contralaterais separadamente do segmento da coluna vertebral e proceder conforme descrito na etapa 4.5.
NOTA: O DRG é visível como uma estrutura transparente redonda ao longo do nervo espinhal branco. - Repetir as etapas 4.3-4.7 usando os dois outros segmentos da coluna vertebral dentro de 30-45 min.
- Centrifugar todos os tubos em alta velocidade (17.900 x g) por 3 min a 4 °C.
- Aspirar tubos supernascidas e flash-freeze em nitrogênio líquido. Armazene tubos a -80 °C para maior homogeneização tecidual.
- Alternativamente, fixe e se sectionia os tecidos drg limpos e outros camundongos para análises histopatológicas e/ou coloração de imunofluorescência após a etapa 4.9.
5. Homogeneização de tecidos
- Descongele os tubos contendo amostras de tecido congelado no gelo.
- Pesar 100 mg de tecido e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo uma conta de aço estéril e 500 μL de tampão RIPA contendo 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS, e comprimidos inibidores de coquetel de protease.
- Interrompa os tecidos à temperatura ambiente (RT) usando um homogeneizador a 20 ciclos/s por 2 minutos, seguido por um período de espera de 1 min, depois 20 ciclos/s por 2 min.
- Centrifugar o tubo em alta velocidade (17.900 x g) por 10 min no RT.
- Colete supernasal (500 μL) em um novo tubo e armazene-o a -20 °C até realizar ELISA e qPCR para quantificar marcadores inflamatórios e cargas virais, respectivamente.
NOTA: Para qPCR, colete todas as amostras com material livre de RNase (ou seja, contas, tubos, etc.) e interrompa tecidos com tampão de lla lysis de RNA contendo 1% de betamercaptoetanol(Tabela de Materiais).
6. Preparação e coloração de imunofluorescência de seções de DRG congelados
- Processamento de tecidos
- Fixar o DRG dissecado e limpo em 1% de paraformaldeído (PFA) por 2 h no RT.
- Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 10% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 20% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 30% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Incorpore tecidos em OUTUBRO usando uma criomold e coloque blocos em gelo seco para congelamento rápido.
- Armazene as amostras a -80 °C até usar.
- Preparação de criosectioning
- Remova o bloco congelado a partir de -80 °C e deixe-o equilibrar na temperatura da câmara criostat por 30 minutos.
- Criosection o DRG a uma espessura de 15 μm e montar as seções em slides.
- Use uma caneta para desenhar um círculo hidrofóbico em torno do tecido montado em slides.
- Mantenha os slides a 4 °C até coloração.
- Coloração de imunofluorescência
- Lave as seções DRG 3x em PBS por 10 minutos no RT.
- Incubar as seções com 100 μL de anticorpo primário desejado (por exemplo, anticorpo do rato contra glicoproteína PRV B) por 1 h a 37 °C. Diluir o anticorpo primário em PBS contendo soro de cabra 10% negativo.
- Repita o passo 6.3.1.
- Incubar as seções com 100 μL de anticorpo secundário desejado (anti-rato de cabra Alexa Fluor 488) por 50 min a 37 °C. Diluir anticorpo secundário apenas na PBS.
- Adicione 100 μL de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) diluído em PBS na seção. Incubar ainda amostras 10 min a 37 °C.
- Repita o passo 6.3.1.
- Monte as amostras usando um meio de montagem de fluorescência em lâminas de vidro e proteja e cubra com tampa.
7. Preparação e coloração de H&E de seções de tecido embarcadas parafina
- Fixar o tecido em 10% de formalina por 24 h a 4 °C.
- Realize o cronograma de processamento padrão para incorporação e secção de tecidos fixos. Transferir tecidos fixos para 70% de etanol e processar através de álcoois atualizados para xileno seguido de parafina, como descrito anteriormente8.
NOTA: Use esponjas de poliéster para manter pequenas amostras de tecido, como DRG dentro de fitas. - Realizar a desparafinação padrão seguida de coloração de H&E de seções teciduais, como descrito anteriormente9.
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Representative Results
O modelo de inoculação do pé do mouse permite a caracterização da imunopagênese da infecção alfaherpesvírus in vivo, incluindo a replicação e disseminação da infecção do bloco de pés inoculado para o sistema nervoso e a indução de respostas neuroinflamatórias específicas.
Neste estudo, primeiro abrasamos o pé traseiro do rato e, seja simulado ou inoculado na região abradada, com uma cepa virulenta de PRV-Becker. O local de abrasão era visível no bloco de controle. Uma crosta foi formada no local da abrasão como parte do processo de cura (Figura 1, seta preta). Em contraste, camundongos inoculados com PRV apresentaram inflamação grave no ponto final humano (82 hpi), caracterizado pelo inchaço do footpad e vermelhidão.
Após a inoculação do footpad com a cepa virulenta PRV-Becker, os camundongos começaram a apresentar sinais clínicos a 72 hpi, caracterizados pelo inchaço do footpad inoculado e tremores cada vez mais frequentes. Por 82 hpi, camundongos infectados pelo PRV-Becker apresentaram tremores constantes na perna inoculada e sintomas distintos de PRV, incluindo arranhões intensos e mordidas no pé. Também foi observada inflamação grave no footpad. A resposta inflamatória induzida durante a infecção pelo PRV foi então caracterizada, incluindo a infiltração de células imunes em tecidos.
Foi realizado exame histopatológico de vários tecidos, incluindo o footpad inoculado e drg, seguido de mancha de H&E de seções de tecido embarcado em parafina. Necrose epidérmica e inflamação dérmica grave (edema e fibrina) foram observadas em seções de pé infectadas pelo PRV(Figura 2A, painel b). A epiderme, a derme e os tecidos conjuntivos de camundongos infectados mostraram uma infiltração maciça de neutrófilos (identificados por núcleos multiloados) marcados com setas negras. Os footpads dos ratos de controle estavam normais(Figura 2A, painel a). DRG infectado pelo PRV mostrou necrose neuronal mínima e inflamação mista em camundongos infectados, enquanto o DRG dos camundongos de controle estava normal(Figura 2B, painéis a e b). O infiltrado de inflamação mista consistia principalmente de neutrófilos e linfócitos.
Em seguida, foram estabelecidas a cinética da produção inflamatória de citocinas no tecido do rato após a inoculação do footpad PRV. Os níveis de citocinas inflamatórias específicas foram quantificados (ou seja, interleucina-6 [IL-6] e fator estimulante da colônia granulócito [G-CSF]) de vários tecidos coletados e homogeneizados a partir do controle e camundongos infectados pelo PRV. Os resultados demonstraram um aumento significativo dos níveis de G-CSF no footpad e DRG em comparação com os controles de 7 cvi e 82 cvi(Figura 3A). Níveis significativos de G-CSF foram observados a 82 hpi na medula espinhal, cérebro, coração e tecido hepático de camundongos infectados por PRV em comparação com os controles. Além disso, níveis significativos de IL-6 foram detectados em todos os tecidos de camundongos infectados pelo PRV em comparação com os controles a partir de 24 hpi (Figura 3B).
O modelo de inoculação do bloco de pés foi ainda utilizado para investigar a replicação do PRV e a propagação do bloco de pés inoculado para o PNS e CNS e possíveis correlações com o desenvolvimento de resposta neuroinflamatória. As cargas de PRV foram quantificadas em vários tecidos homogeneizados por qPCR para amplificar o DNA PRV. A concentração de DNA foi então convertida em PFU, como descrito anteriormente10. As cargas de PRV foram detectadas no footpad a partir de 24 hpi (~1 x 104 PFU/mg de tecido) e em DRG a partir de 60 hpi (~1 x 103 PFU/mg de tecido; dados não mostrados).
Em estado moribundo (82 hpi), o PRV foi detectado no footpad, DRG, medula espinhal e cérebro, com a maior concentração de PRV em DRG (~1 x 105 PFU/mg de tecido; Figura 4). A infecção por RV de DRG foi confirmada pela coloração indireta da imunofluorescência das crioseções drg. A infecção por PRV foi detectada em neurônios DRG usando anticorpos anti-PRV gB. PrV glycoproteína gB foi expressa durante estágios tardios de infecção no citoplasma de células infectadas. Como esperado, a expressão citoplasmática de PRV gB (verde) foi confirmada em DRG infectado, enquanto nenhuma gB foi expressa em amostras de controle(Figura 5). Núcleos celulares foram identificados com coloração da DAPI (azul).
Figura 1: Imagens representativas das patas traseiras direitas do rato após a inoculação prv. Os ratos são simulados ou inoculados com PRV no bloco traseiro direito abradado. O footpad inoculado PRV apresenta sinais de inflamação, incluindo vermelhidão e inchaço no ponto final humano (82 hpi). O bloco de pés dos ratos de controle parece normal com uma crosta vermelha escura no local abraded, indicando que a ferida está cicatrizando. Flechas pretas indicam o local da abrasão. Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Achados histopatológicos no footpad e DRG após a inoculação do footpad PRV. Hematoxylin e eosina (H&E) de(A)footpads inoculados do mouse e(B) e DRG ipsilateral a partir do controle (painel a) e camundongos infectados por PRV (painel b) a 82 hpi. Manifestações histopatológicas observadas em tecidos infectados pelo PRV (necrose epidérmica e neuronal e infiltração de neutrófilos) estão ausentes de todos os camundongos simulados examinados. Os resultados são representativos de três réplicas biológicas para um determinado tipo de tecido. Setas negras indicam áreas representativas de inflamação com infiltração de células imunes. As barras de escala (50 μm) são indicadas para cada imagem. Este número foi modificado a partir de11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cinética da produção de citocinas inflamatórias em tecidos de camundongos homogeneizados após a inoculação do bloco de pés PRV. (A) G-CSF e (B) níveis de proteína IL-6 detectados em tecidos homogeneizados de camundongos infectados por PRV (vermelho) e controle (preto) em diferentes hpi. Os níveis proteicos são quantificados por ELISA e expressos como picograma (pg) por miligrama (mg) de tecido homogeneizado (n = 5 por grupo, *p < 0,05, ns = não significativo). Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação do genoma PRV em tecidos homogeneizados de camundongos. O DNA PRV é quantificado em tecidos de camundongos homogeneizados por qPCR usando primers PRV UL54. As cargas de PRV são expressas como unidades de formação de placa (PFU) por mg de tecido. O DNA PRV é detectado apenas no pé, DRG, medula espinhal e cérebro (e não em outros tecidos), n = 10 por grupo. A linha pontilhada mostra o limite de detecção. Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação da infecção por PRV nos neurônios DRG por coloração de imunofluorescência. Imagens de pilha Z confocal de neurônios DRG infectados por simulação e PRV após a coloração da imunofluorescência usando um anticorpo de rato específico para PRV gB (verde). Os núcleos celulares estão manchados com DAPI (azul, painéis a e c). O painel d mostra vários neurônios infectados por PRV expressando gB (setas brancas). Nenhuma expressão gB é detectada nas seções DRG de controle (painel b). As barras de escala (50 μm) são indicadas para cada imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo de inoculação do footpad descrito aqui é útil para investigar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alfaherpesvírus. Além disso, este modelo in vivo é usado para estabelecer a cinética da replicação e disseminação do alphaherpesvirus da PNS para o CNS. Trata-se de um alternado para outros modelos de inoculação, como o modelo de inoculação da pele flanco, que conta com arranhões dérmicos profundos13, ou a rota intracraniana, que introduz diretamente o vírus no CNS14,,15,16. Como resultado, com o modelo de footpad, é possível obter uma avaliação mais detalhada da cinética viral da replicação e disseminação com processos imunopatológicos locais e distantes associados no sistema nervoso11,12.
Neste protocolo, a abrasão do footpad e a subsequente inoculação viral são passos cruciais. De fato, o estrato corneum precisa ser completamente removido após abrasão adequada, a fim de expor o basale estrato ao inóculo viral para infecção bem sucedida. No entanto, a abrasão deve ser suave e não induzir sangramento, pois isso ajuda a prevenir a infecção da circulação sanguínea. O cânênio estrato destacado pode ser visualizado pela coloração de H&E sob microscopia leve. Os corneócitos presentes no estrato corneum são células eosinofílicas planas que não possuem núcleos. O volume do inóculo viral (gotícula de 20 μL) foi otimizado para garantir que a gota permaneça no footpad e cubra o local abraded. Esfregar suavemente a gotícula do inóculo no bloco de pés abradado é essencial para uma penetração viral eficiente. Recomenda-se esperar até que o bloco esteja completamente seco para parar a anestesia e colocar o animal em uma nova gaiola. Esta etapa evitará que o mouse lamba o inóculo viral do bloco de rodas abradado. Recomenda-se processar no máximo três camundongos ao mesmo tempo, usando um cone de nariz que é definido para expô-los simultaneamente à anestesia.
Ao realizar a dissecção do camundongo, é importante fazer cortes paralelos à coluna das vértebras, o que evita danos à medula espinhal e DRG associados. Também é sugerido remover o máximo de gordura, músculo e tecido mole possível para reduzir o corte acidental na coluna vertebral e facilitar uma melhor aderência no segmento da coluna com fórceps antes de cortar a linha média.
Também é recomendado realizar cortes transversais através da coluna de vértebras entre os discos, a fim de produzir segmentos de colunas limpas e limitar o risco de danificar pares DRG. As meninges ao redor da medula espinhal e a cobertura do DRG devem ser completamente removidas para facilitar a identificação e extração do DRG. O DRG deve ser removido cuidadosamente da coluna vertebral sem danos causados pelos fórceps. É importante que o DRG permaneça intacto para a coloração de H&E e imunofluorescência. O tempo é fundamental para a eficiência deste experimento in vivo, e a dissecção do rato e a extração da medula espinhal/DRG devem ser realizadas consecutivamente para coletar tecido o mais fresco possível.
O método de homogeneização tecidual descrito aqui foi otimizado para garantir a interrupção eficiente de um grande número de amostras de tecido heterogêneo. É primordial padronizar a quantidade de tecido utilizado, o que permite a comparação direta dos resultados elisa e qPCR entre as amostras. Por exemplo, sugere-se pesar 100 mg de tecido para cada procedimento de homogeneização. Cada amostra de tecido deve ser homogeneizada em sua totalidade, e as sobras não devem ser descongeladas. É importante autoclave as contas de aço e fórceps antes de usar para evitar qualquer contaminação durante a homogeneização. Um volume de 500 μL é ideal para garantir a homogeneização completa de uma amostra de tecido de 100 mg. É importante notar que esse volume limitado permite apenas o processamento de três a quatro kits ELISA por amostra.
Utilizando o modelo de inoculação do footpad, foi demonstrado que a infecção por PRV em camundongos induz inflamação grave, caracterizada pela infiltração de neutrófilo no footpad e DRG. Altas concentrações de citocinas inflamatórias G-CSF e IL-6 também foram detectadas em muitos tecidos homogeneizados utilizando ELISA. Além disso, foi encontrada forte correlação entre a expressão genética prv e proteína (por qPCR e manchas de IF) em DRG e a produção de ambas as citocinas pró-inflamatórias.
Este modelo é adequado para comparar a cinética da replicação/propagação viral, bem como respostas neuroinflamatórias entre diferentes infecções alfaherpesvírus. Por exemplo, em relação ao VZV, a especificidade restrita do hospedeiro e a falta de doença clínica limitaram o uso de modelos animais17. Portanto, o modelo de inoculação prv do pé do mouse pode representar um novo modelo animal para o estudo dos mecanismos celulares e moleculares responsáveis pelo prurido neuropático em pacientes com lesões pós-herpéticas. Com base nas semelhanças em sinais clínicos, patogênese e genomas entre VZV e PRV, acredita-se que este modelo de camundongos irá melhorar a compreensão da patogênese VZV e levar aos desenvolvimentos em estratégias terapêuticas inovadoras.
Por fim, o modelo orientará pesquisas sobre neuropatias periféricas, como esclerose múltipla e danos induzidos por virais associados à PNS18. A patogênese de vários vírus neurotrópicos (ou seja, vírus da raiva, poliovírus, vírus do Nilo Ocidental, zika vírus), que são conhecidos por infectar a PNS, também pode ser estudada usando este modelo19,,20,,21,22. O modelo de inoculação do footpad pode ser usado como uma possível ferramenta econômica para o desenvolvimento de medicamentos. Por exemplo, pode servir como uma plataforma para testar e testar a eficácia de drogas anti-inflamatórias e antivirais projetadas para prevenir neuropatias periféricas induzidas pelo viral.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem os laboratórios de Charles River por seu excelente apoio técnico executando as análises histopatologias. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) (RO1 NS033506 e RO1 NS060699). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
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