Summary
Das Footpad-Impfmodell ist ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung viral-induzierter neuroentzündlicher Reaktionen in vivo. Insbesondere bietet es eine klare Bewertung der viralen Kinetik und der damit verbundenen immunpathologischen Prozesse, die im peripheren Nervensystem eingeleitet wurden.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Footpad-Impfmodell, das verwendet wird, um die Initiierung und Entwicklung neuroentzündlicher Reaktionen während einer Alphaherpesvirus-Infektion bei Mäusen zu untersuchen. Da Alphaherpesviren Haupteindringlinge des peripheren Nervensystems (PNS) sind, eignet sich dieses Modell, um die Kinetik der Virusreplikation, ihre Ausbreitung von PNS auf ZNS und die damit verbundenen neuroentzündlichen Reaktionen zu charakterisieren. Das Footpad-Impfmodell ermöglicht die Ausbreitung von Viruspartikeln von einer primären Infektionsstelle in der Fußpolsterepidermis auf sensorische und sympathische Nervenfasern, die die Epidermis, Schweißdrüsen und Dermis innervierend beleben. Die Infektion breitet sich über den Ischiasnerv auf die Rückenwurzelganglien (DRG) und schließlich über das Rückenmark zum Gehirn aus. Hier wird ein Maus-Fußpad mit dem Pseudorabivirus (PRV) geimpft, einem Alphaherpesvirus, das eng mit dem Herpes-Simplex-Virus (HSV) und dem Varicella-Zoster-Virus (VZV) verwandt ist. Dieses Modell zeigt, dass PRV-Infektion schwere Entzündungen induziert, gekennzeichnet durch neutrophile Infiltration im Fußpad und DRG. Hohe Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen werden anschließend in homogenisierten Geweben per ELISA nachgewiesen. Darüber hinaus wird eine starke Korrelation zwischen PRV-Gen und Proteinexpression (über qPCR und IF-Färbung) in DRG und der Produktion von proinflammatorischen Zytokinen beobachtet. Daher bietet das Footpad-Impfmodell ein besseres Verständnis der Prozesse, die Alphaherpesvirus-induzierten Neuropathien zugrunde liegen, und kann zur Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien führen. Darüber hinaus kann das Modell die Forschung zu peripheren Neuropathien, wie Multiple Sklerose und damit verbundenen viral-induzierten Schäden an der PNS, leiten. Letztlich kann es als kostengünstiges In-vivo-Tool für die Arzneimittelentwicklung dienen.
Introduction
Diese Studie beschreibt ein Footpad-Impfmodell, um die Replikation und Ausbreitung von Viren vom PNS auf ZNS und die damit verbundenen neuroinflammatorischen Reaktionen zu untersuchen. Das Footpad-Impfmodell wurde intensiv verwendet, um Alphaherpesvirus-Infektionen in neuronen1,2,3zu untersuchen. Das Hauptziel dieses Modells ist es, neurotrope Viren zu ermöglichen, eine maximale Entfernung durch das PNS zu reisen, bevor sie das ZNS erreichen. Hier wird dieses Modell verwendet, um neue Erkenntnisse über die Entwicklung einer bestimmten Neuropathie (neuropathischer Schreiz) bei Mäusen zu erhalten, die mit dem Pseudorabivirus (PRV) infiziert sind.
PRV ist ein Alphaherpesvirus im Zusammenhang mit mehreren bekannten Krankheitserregern (d. h. Herpes simplex Typ 1 und 2 [HSV1 und HSV2] und Varicella-Zoster-Virus [VZV]), die Erkältungsgeschoren, Genitalläsionen und Windpocken verursachen, bzw.4. Diese Viren sind alle pantrop und in der Lage, viele verschiedene Zelltypen zu infizieren, ohne Affinität für einen bestimmten Gewebetyp zu zeigen. Sie alle weisen jedoch einen charakteristischen Neurotropismus auf, indem sie in die PNS (und gelegentlich auch in die ZNS) der Wirtsarten eindringen. Der natürliche Wirt ist das Schwein, aber PRV kann die meisten Säugetiere infizieren. Bei diesen nicht-natürlichen Wirten infiziert PRV die PNS und induziert einen schweren Pruritus, den "wahnsinnigen Juckreiz", gefolgt von perakutem Tod5,6. Die Rolle der Neuroimmunantwort im klinischen Ergebnis und der Pathogenese einer PRV-Infektion ist schlecht verstanden worden.
Das Footpad-Impfmodell ermöglicht PRV, infektionen in den epidermalen Zellen des Footpads zu initiieren. Dann breitet sich die Infektion in sensorische und sympathische Nervenfasern aus, die die Epidermis, Schweißdrüsen und Dermis innervierend beleben. Die Infektion breitet sich durch Viruspartikel aus, die sich innerhalb von ca. 60 h über den Ischiasnerv zum DRG bewegen. Die Infektion breitet sich über das Rückenmark aus und erreicht schließlich das Hinterhirn, wenn Tiere moribund werden (82 h nach der Infektion). Während dieses Zeitfensters können Gewebeproben gesammelt, verarbeitet und auf Virusreplikation und Marker der Immunantwort analysiert werden. Beispielsweise können histologische Untersuchungen und virale Lastquantifizierungen in verschiedenen Geweben durchgeführt werden, um Korrelationen zwischen der Einleitung und Entwicklung klinischer, virologischer und neuroinflammatorischer Prozesse bei der PRV-Pathogenese herzustellen.
Mit Hilfe des Footpad-Impfmodells können die zellulären und molekularen Mechanismen des PRV-induzierten Pruritus bei Mäusen untersucht werden. Darüber hinaus kann dieses Modell neue Einblicke in die Initiierung und Entwicklung von virusinduzierten Neuroinflammationen bei Herpesvirus-Infektionen liefern. Ein besseres Verständnis der Prozesse, die Alphaherpesvirus-induzierten Neuropathien zugrunde liegen, kann zur Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien führen. Beispielsweise ist dieses Modell nützlich, um die Mechanismen des neuropathischen Schreizes bei Patienten mit postherpetischen Läsionen (z. B. Herpes zoster, Schindeln) zu untersuchen und neuartige therapeutische Ziele bei Mäusen auf die entsprechenden menschlichen Krankheiten zu testen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll (Nummer 2083-16 und 2083-19) durchgeführt, das vom Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) der Princeton University überprüft und genehmigt wurde. Diese Arbeit wurde unter strikter Befolgung der Biosicherheitsanforderungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt, für die wir ein voll ausgestattetes Labor haben, das vom Biosicherheitsausschuss der Princeton University genehmigt wurde. Die Verfahren wie Maus-Fußpolsterabrieb, virale Impfung, Maussektion und Gewebesammlung wurden in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) im Biocontainment-Tierraum der Princeton University durchgeführt. Die Verfahrensbeteiligten trugen Einwegkleider, Kopfbedeckungen, Augenschutz, sterile Handschuhe, chirurgische Masken und Schuhbezüge.
1. Mouse Footpad Abrieb
- Anästhetisieren Sie eine C57BL/6-Maus (5–7 Wochen alt) mit Isofluran-Gasanästhetikum, das in einer Dosierung von 3% über ein kleines Anästhesiesystem (Kammer) geliefert wird.
- Legen Sie die Maus in der chirurgischen Ebene der Anästhesie auf dem Rücken, vor der Impfung, in das Hinterfußpolster. Befestigen Sie einen Nasenkegel mit einem Zwerchfell (ein Schlitz, der so groß ist, dass er an die Schnauze des Tieres passt) an der Maus und liefern Sie Isoflurangasanästhetikum bei einer konstanten Dosierung von 1,5 %–2,0 %.
- Beobachten Sie die Maus genau auf eine Reaktion auf schmerzhafte Reize, die durch das kräftige Kneifen der Zehen mit Zange erzeugt werden.
- Greifen Sie leicht ein Hinterfußpad mit flachen Zangen.
- Abschleifen Sie die glabrous Haut des Hinterfußpolsters etwa 20x, zwischen Ferse und Gehpolster, mit einem Schärenbrett (100–180 Körnung). Nicht durch zu häufiges Abschleifen oder zu viel Druck zu bluten.
- Mit feinen Zangen, langsam schälen Sie die Stratum corneum durch Abrieb gelöst, um die Stratum Basale auszusetzen.
2. PRV Fußpolster-Impfung
- Bereiten Sie das Virus Inoculum verdünnt auf den gewünschten Titer in DMEM-Medien mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin(Materialtabelle) vor.
- Quantitieren Sie die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) im Virusbestand auf PK15-Zellen, um die Virusdosis zu berechnen und zu standardisieren und das virale Inokulum entsprechend zu verdünnen.
HINWEIS: In dieser Studie wurde der virulente PRV-Stamm (PRV-Becker) in einer Dosis von 8 x 106 PFU verwendet. Diese Dosis wurde in einem früheren Vorversuch optimiert, um sicherzustellen, dass alle geimpften Tiere bei 82 h nach der Inokulation (hpi) klinische Symptome zeigten. - Halten Sie das Virus inoculum auf Eis und mischen Sie sanft vor dem Gebrauch.
- Quantitieren Sie die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) im Virusbestand auf PK15-Zellen, um die Virusdosis zu berechnen und zu standardisieren und das virale Inokulum entsprechend zu verdünnen.
- Fügen Sie ein 20-L-Tröpfchen Virus-Inokulum (8 x 106 PFU) auf das abgeriebene Fußpolster (topische Verabreichung) ein. Führen Sie Mock-Impfungen (nur Medium) parallel durch.
- Reiben Sie 10x vorsichtig mit der Welle einer Nadel, um die Adsorption des Virus zu erleichtern. Vermeiden Sie Kratzer mit dem Nadelpunkt. Wiederholen Sie diesen Schritt alle 10 min.
- Halten Sie die Maus 30 min unter Anästhesie, bis das abgesätte Fußpolster trocken ist.
- Nach Beendigung der Anästhesie, überwachen Sie die Maus, bis sie die Brustbehebung aufrecht erhalten kann, und legen Sie sie in einen individuellen Käfig für die klinische Nachbeobachtung und Probenahme.
3. Maussektion und Gewebesammlung
- Zu geeigneten Zeiten nach der Infektion, euthanisieren Sie die Maus durch die Erstickungsmethode (CO2).
HINWEIS: In dieser Studie beträgt der humane Endpunkt (wenn Tiere beginnen, endige Symptome zu zeigen) für PRV-Becker-infizierte Mäuse 82 PSi. Euthanisieren Sie Kontrolltiere parallel. - Legen Sie die Maus-Ventralseite mit Nadeln/Pins auf eine chirurgische Matte. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus mit Stiften an einem chirurgischen Schaumstoffbrett. Befeuchten Sie die ventrale Seite der Maus mit 70% Ethanol, um die Fellkontamination zu minimieren.
- Kneifen Sie die äußere Fell- und Hautschicht mit Zangen und machen Sie einen kleinen Erstenschnitt mit einer feinen Schere in der Nähe der Harnröhrenöffnung.
- Von dieser Öffnung aus den Einschnitt auf der mittleren ventralen Seite bis zum Kinn fortsetzen.
- Erweitern Sie zwei seitliche Einschnitte zu den Extremitäten der Vorderbeine und hinteren Gliedmaßen.
- Trennen Sie die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht und heften Sie sich zur Seite.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle und Incise bis zur Basis des Thorax. Vervollständigen Sie die Öffnung der Bauchhöhle, indem Sie zwei transversale Schnitte machen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie die Membran und die Rippen auf beiden Seiten schneiden.
HINWEIS: Das Schneiden der Seiten des Brustkorbs verhindert das Risiko, das Herz zu schneiden. - Sammeln Sie exponierte Organe, einschließlich Herz, Lunge, Milz, Bauchspeicheldrüse, Leber, Nieren und Blase in 1,5 ml Mikroröhren. Halten Sie die Rohre auf Eis.
- Schneiden Sie das abgesätte Fußpolster zwischen Ferse und Gehpolster und legen Sie das Stück Gewebe in ein Rohr, wie in Schritt 3.3.6 beschrieben.
- Legen Sie die Maus dorsale Seite nach oben und befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Hautschicht ab, um die Wirbelsäule freizulegen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt im Bereich des Beckens. Entfernen Sie die Haut von den Hinterbeinen zum Kopf.
- Entfernen Sie die Beine und Arme, indem Sie mit einer Schere parallel zur Wirbelsäule auf beiden Seiten schneiden.
- Schneiden Sie den Kopf an der Schädelbasis ab (C1-C2-Niveau).
- Den Schädel mit einer Schere vom Foramen magnum bis zum Frontalknochen aufschneiden.
- Ziehen Sie den Schädel in seitlicher Richtung mit Zangen auf.
- Schaufeln Sie das Gehirn vorsichtig mit Zangen aus und gehen Sie wie in Schritt 3.3.6 beschrieben vor.
- Reinigen Sie die Wirbelsäule, indem Sie Mit einer gekrümmten Schere Muskel-, Fett- und Weichgewebe schneiden. Schneiden Sie den Schwanz. Legen Sie die intakte Wirbelsäule in ein 15 ml-Rohr mit steriler eiskalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Halten Sie die Röhren auf Eis bis zur weiteren Zerlegung des Rückenmarks und des DRG.
4. Rückenmarks- und DRG-Extraktion
HINWEIS: Extrahieren Sie Rückenmark und DRG aus der Wirbelsäule direkt nach der Maussektion. Das Protokoll zur Rückenmarks- und DRG-Extraktion wurde aus einer früheren Publikation7angepasst.
- Entfernen Sie die Wirbelsäule aus dem eiskalten PBS-Rohr und entfernen Sie die restlichen Weichgewebe, was nach der Kühlung einfacher wird.
- Machen Sie drei Querschnitte in der Säule durch die Wirbel (T1, L1 und S2-Stufen) mit einer Rasierklinge. Legen Sie die drei Stücke in eine 15 mm Petrischale mit sterilem eiskaltem PBS. Verfolgen und markieren Sie den Ursprung von Segmenten für eine spätere Analyse.
- Nehmen Sie ein Segment und sichern Sie es zwischen Zangen, dorsale Seite nach oben. Machen Sie eine einzelne, längs geschnitten durch die Mittellinie mit einer Rasierklinge, die Spalter der Säule in zwei gleiche Hälften.
- Legen Sie beide Hälften in eine neue Petrischale mit neuen sterilen eiskalten PBS. Stellen Sie die richtige Ausrichtung des Segments sicher, um die linke und rechte Seite unterscheiden zu können.
- Schälen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop das Rückenmark vorsichtig aus der Wirbelsäule aus jeder Hälfte in einer rostralen bis kaudalen Richtung mit feinen Zangen.
- Sammeln Sie beide Rückenmarkshälften in 1,5 ml Mikroröhren, die 500 l steriles eiskaltes PBS enthalten. Halten Sie die Rohre auf Eis.
- Entfernen Sie vorsichtig die Meningen von einer Seite der Wirbelsäule zur anderen, um das DRG freizulegen.
- Entfernen Sie jedes DRG einzeln, indem Sie den exponierten Spinalnerv erfassen und sanft aus der Wirbelsäule ziehen. Legen Sie das gesammelte DRG in eine 15 mm Petrischale mit eiskaltem PBS. Ernten Sie alle ipsilateralen und kontralateralen DRG getrennt vom Wirbelsäulensegment und fahren Sie wie in Schritt 4.5 beschrieben fort.
HINWEIS: Das DRG ist als runde transparente Struktur entlang des weißen Spinalnervs sichtbar. - Wiederholen Sie die Schritte 4.3–4.7 mit den beiden anderen Wirbelsäulensegmenten innerhalb von 30–45 min.
- Zentrifugieren Sie alle Rohre mit hoher Geschwindigkeit (17.900 x g) für 3 min bei 4 °C.
- Aspirate Überstand und Flash-Freeze-Rohre in flüssigem Stickstoff. Rohre bei -80 °C lagern, um die Gewebe homogenisieren zu können.
- Alternativ können Sie das gereinigte DRG und andere Mausgewebe für histopathologische Analysen und/oder Immunfluoreszenzfärbung nach Schritt 4.9 fixieren und abschnitten.
5. Gewebehomogenisierung
- Die Rohre mit gefrorenen Gewebeproben auf Eis auftauen.
- Wiegen Sie 100 mg Gewebe und legen Sie es in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer sterilen Stahlperle und 500 l RIPA-Puffer mit 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS und Protease-Cocktail-Hemmertabletten.
- Gewebe bei Raumtemperatur (RT) mit einem Homogenisator bei 20 Zyklen/s für 2 min, gefolgt von einer Wartezeit von 1 min, dann 20 Zyklen/s für 2 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit (17.900 x g) für 10 min bei RT.
- Überstand (500 l) in einem neuen Rohr sammeln und bei -20 °C lagern, bis ELISA und qPCR durchgeführt werden, um Entzündungsmarker bzw. Viruslasten zu quantifizieren.
HINWEIS: Für qPCR alle Proben mit RNase-freiem Material (z. B. Perlen, Tuben usw.) sammeln und Gewebe mit RNA-Lysepuffer mit 1% Betamercaptoethanol(Materialtabelle)stören.
6. Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von gefrorenen DRG-Abschnitten
- Gewebeverarbeitung
- Fixieren Sie das sezierte und gereinigte DRG in 1% Paraformaldehyd (PFA) für 2 h bei RT.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 15 ml-Rohr mit 10% Saccharose in PBS. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 15 ml-Rohr mit 20% Saccharose in PBS. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Übertragen Sie das Gewebe in ein 15 ml-Rohr mit 30% Saccharose in PBS. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Gewebe in OCT mit einem Kryomold einbetten und Blöcke in Trockeneis für schnelles Einfrieren legen.
- Bewahren Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung auf.
- Kryosektionsvorbereitung
- Entfernen Sie den gefrorenen Block von -80 °C und lassen Sie ihn in der Kryostatkammertemperatur für 30 min ausgrenzen.
- Kryosektion des DRG bei einer Dicke von 15 m und Montieren Sie die Abschnitte auf Dias.
- Verwenden Sie einen Stift, um einen hydrophoben Kreis um das am Schlitten montierte Gewebe zu zeichnen.
- Halten Sie die Dias bei 4 °C bis zur Färbung.
- Immunfluoreszenzfärbung
- Waschen Sie die DRG-Abschnitte 3x in PBS für 10 min bei RT.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit 100 l des gewünschten Primärantikörpers (z. B. Mausantikörper gegen PRV-Glykoprotein B) für 1 h bei 37 °C. Verdünnen Sie den primären Antikörper in PBS, der 10% negatives Ziegenserum enthält.
- Wiederholen Sie Schritt 6.3.1.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit 100 l des gewünschten Sekundärantikörpers (Ziegenanti-Maus Alexa Fluor 488) für 50 min bei 37 °C. Nur sekundären Antikörper in PBS verdünnen.
- Fügen Sie 100 L DAPI-Farbstoff (4,6-Diamidino-2-Phenylindole) in PBS verdünnt auf den Abschnitt. Weitere Inkubationsproben 10 min bei 37 °C.
- Wiederholen Sie Schritt 6.3.1.
- Montieren Sie die Proben mit einem Fluoreszenz-Montagemedium auf Glasschlitten und sichern und decken Sie sie mit Deckel.
7. Vorbereitung und H&E-Färbung von Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten
- Fixieren Sie das Gewebe in 10% Formalin für 24 h bei 4 °C.
- Führen Sie einen Standardverarbeitungszeitplan für die Paraffineinbettung und -schnittung von festem Gewebe durch. Übertragen Sie festes Gewebe auf 70% Ethanol und verarbeiten Sie durch verbesserte Alkohole zu Xylol gefolgt von Paraffin, wie zuvor beschrieben8.
HINWEIS: Verwenden Sie Polyesterschwämme, um kleine Gewebeproben wie DRG in Kassetten zu halten. - Führen Sie eine Standard-Deparaffinisierung durch, gefolgt von H&E-Färbung von Gewebeabschnitten, wie zuvor beschrieben9.
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Representative Results
Das Maus-Fußpad-Impfmodell ermöglicht die Charakterisierung der Immunpathogenese der Alphaherpesvirus-Infektion in vivo, einschließlich replikation und Ausbreitung der Infektion vom geimpften Fußpolster auf das Nervensystem und die Induktion spezifischer neuroinflammatorische Reaktionen.
In dieser Studie haben wir zunächst das Hinterfußpad der Maus abgerieben und entweder verspottet oder die abgeriebene Region mit einem virulenten PRV-Stamm (PRV-Becker) geimpft. Der Abriebort war im Steuerfußpolster sichtbar. Im Rahmen des Heilungsprozesses wurde an der Abriebstelle eine Kruste gebildet(Abbildung 1,schwarzer Pfeil). Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit PRV geimpft wurden, eine schwere Entzündung am humanen Endpunkt (82 PSi), die durch Schwellung des Fußpolsters und Rötung gekennzeichnet war.
Nach der Fußpolsterimpfung mit dem virulenten PRV-Becker-Stamm zeigten Mäuse klinische Symptome bei 72 PSi, die sich durch Schwellungen des geimpften Fußpolsters und immer häufigeres Zittern auszeichneten. Mit 82 PSi zeigten PRV-Becker-infizierte Mäuse ständiges Zittern im geimpften Bein und ausgeprägte PRV-Symptome, einschließlich intensivem Kratzen und Beißen des Fußes. Schwere Entzündungen wurden auch im Fußpolster beobachtet. Die entzündliche Reaktion, die während der PRV-Infektion induziert wurde, wurde dann weiter charakterisiert, einschließlich der Infiltration von Immunzellen in Gewebe.
Es wurde eine histopathologische Untersuchung mehrerer Gewebe durchgeführt, darunter das geimpfte Fußpolster und die DRG, gefolgt von der H&E-Färbung von Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten. Epidermale Nekrose und schwere dermale Entzündung (Ödeme und Fibrin) wurden in PRV-infizierten Fußabschnitten beobachtet (Abbildung 2A, Panel b). Die Epidermis, Dermis und Bindegewebe infizierter Mäuse zeigten eine massive Infiltration von Neutrophilen (identifiziert durch mehrfarbige Kerne), die mit schwarzen Pfeilen markiert waren. Fußpolster von Steuermäusen waren normal (Abbildung 2A, Panel a). PRV-infizierte DRG zeigte minimale neuronale Nekrose und gemischte Entzündungen bei infizierten Mäusen, während die DRG von Kontrollmäusen normal waren (Abbildung 2B, Panels a und b). Die gemischte Entzündung infiltrat hauptsächlich aus Neutrophilen und Lymphozyten.
Als nächstes wurde die Kinetik der entzündlichen Zytokinproduktion im Mausgewebe nach PRV-Fußpad-Impfung festgestellt. Der Gehalt an spezifischen entzündlichen Zytokinen wurde (d. h. Interleukin-6 [IL-6] und Granulozytkolonie stimulierender Faktor [G-CSF]) aus mehreren Geweben quantifiziert, die von Kontroll- und PRV-infizierten Mäusen gesammelt und homogenisiert wurden. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der G-CSF-Werte im Footpad und DRG im Vergleich zu Steuerungen mit 7 PSi und 82 PSi (Abbildung 3A). Signifikante G-CSF-Spiegel wurden bei 82 PSi im Rückenmark, Gehirn, Herz und Lebergewebe von PRV-infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen beobachtet. Darüber hinaus wurden signifikante IL-6-Spiegel in allen Geweben von PRV-infizierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen ab 24 PSi nachgewiesen (Abbildung 3B).
Das Footpad-Impfmodell wurde weiter verwendet, um die PRV-Replikation zu untersuchen und sich vom geimpften Fußpad auf das PNS und ZNS und mögliche Korrelationen mit der Entwicklung neuroentzündlicher Reaktionen auszubreiten. PRV-Lasten wurden in mehreren homogenisierten Geweben durch qPCR quantifiziert, um PRV-DNA zu verstärken. Die DNA-Konzentration wurde dann in PFU umgewandelt, wie zuvorbeschrieben 10. PRV-Lasten wurden im Fußpolster ab 24 PSi (1 x 104 PFU/mg Gewebe) und in DRG ab 60 PSi (1 x 103 PFU/mg Gewebe; nicht gezeigte Daten) festgestellt.
In einem moribunden Zustand (82 PSi) wurde PRV im Fußpolster, DRG, Rückenmark und Gehirn mit der höchsten Konzentration von PRV in DRG (1 x 105 PFU/mg Gewebe; Abbildung 4). Die PRV-Infektion von DRG wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung von DRG-Kryosektionen bestätigt. PRV-Infektion wurde in DRG-Neuronen mit Anti-PRV gB-Antikörper n. PRV Glykoprotein gB wurde in späten Stadien der Infektion im Zytoplasma infizierter Zellen exprimiert. Wie erwartet wurde die zytoplasmatische Expression von PRV gB (grün) in infizierten DRG bestätigt, während kein gB in Kontrollproben exprimiert wurde (Abbildung 5). Zellkerne wurden mit DAPI-Färbung (blau) identifiziert.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Mausrechten Hinterpfoten nach PRV-Impfung. Mäuse werden entweder verspottet oder mit PRV im abgeriebenen rechten Hinterfußpad geimpft. PRV-geimpftes Fußpolster zeigt Anzeichen von Entzündungen, einschließlich Rötungen und Schwellungen am humanen Endpunkt (82 PSi). Das Fußpolster der Kontrollmäuse erscheint normal mit einer dunkelroten Kruste an der abgeriebenen Stelle, was darauf hinweist, dass die Wunde heilt. Schwarze Pfeile zeigen den Abriebort an. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histopathologische Befunde in Footpad und DRG nach PRV-Fußpad-Impfung. Hematoxylin und Eosin (H&E) Färbung von (A) Maus geimpften Fußpolstern und (B) und ipsilateralen DRG von Kontroll- (Panel a) und PRV-infizierten (Panel b) Mäusen mit 82 PSi. Histopathologische Manifestationen, die in PRV-infizierten Geweben beobachtet werden (epidermale und neuronale Nekrose und neutrophile Infiltration), fehlen bei allen untersuchten Mock-infizierten Mäusen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei biologische Replikationen für eine bestimmte Art von Gewebe. Schwarze Pfeile zeigen repräsentative Entzündungsbereiche mit Immunzellinfiltration an. Für jedes Bild sind Skalenbalken (50 m) angezeigt. Diese Zahl wurde von11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kinetik der entzündlichen Zytokinproduktion in homogenisiertem Mausgewebe nach PRV-Fußpad-Impfung. (A) G-CSF und (B) IL-6-Proteinspiegel, die bei PRV-infizierten (roten) und kontrollierten (schwarzen) Maus-homogenisierten Geweben bei verschiedenen HPi nachgewiesen wurden. Der Proteingehalt wird durch ELISA quantifiziert und als Piktogramm (pg) pro Milligramm (mg) homogenisiertem Gewebe ausgedrückt (n = 5 pro Gruppe, *p < 0,05, ns = nicht signifikant). Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung des PRV-Genoms in maushomogenisierten Geweben. PRV-DNA wird in homogenisierten Mausgeweben durch qPCR mit PRV UL54 Primern quantifiziert. PRV-Lasten werden als Plaque-Bildeinheiten (PFU) pro mg Gewebe ausgedrückt. PRV-DNA wird nur im Fuß, DRG, Rückenmark und Gehirn (und nicht in anderen Geweben) nachgewiesen, n = 10 pro Gruppe. Gepunktete Linie zeigt die Erkennungsgrenze an. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bewertung der PRV-Infektion in DRG-Neuronen durch Immunfluoreszenzfärbung. Konfokale Z-Stack-Bilder von mock- und PRV-infizierten DRG-Neuronen nach Immunfluoreszenzfärbung mit einem Maus-Antikörper speziell für PRV gB (grün). Zellkerne sind mit DAPI (blau, Platten a und c) gebeizt. Panel d zeigt mehrere PRV-infizierte Neuronen, die gB (weiße Pfeile) exdrücken. In den DrG-Steuerelementabschnitten (Panel b) wird kein gB-Ausdruck erkannt. Für jedes Bild sind Skalenbalken (50 m) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier beschriebene Footpad-Impfmodell ist nützlich, um die Einleitung und Entwicklung neuroinflammatorischer Reaktionen während einer Alphaherpesvirus-Infektion zu untersuchen. Darüber hinaus wird dieses In-vivo-Modell verwendet, um die Kinetik der Replikation und Ausbreitung des Alphaherpesvirus vom PNS auf DasZ S zu ermitteln. Dies ist eine Alternative zu anderen Impfmodellen, wie dem Flankenhaut-Impfmodell, das auf tiefem dermalen Kratzen13beruht, oder der intrakraniellen Route, die das Virus direkt in das CNS14,,15,16einführt. Als Ergebnis, mit dem Footpad-Modell, ist es möglich, eine detailliertere Bewertung der viralen Kinetik der Replikation zu erhalten und mit den damit verbundenen lokalen und entfernten immunpathologischen Prozessen im Nervensystem11,12zu verbreiten.
In diesem Protokoll sind der Abrieb des Fußpolsters und die anschließende virale Impfung entscheidende Schritte. In der Tat muss das Stratum corneum nach ausreichendem Abrieb vollständig entfernt werden, um die Stratum basale viralem Inokulum für eine erfolgreiche Infektion auszusetzen. Der Abrieb muss jedoch schonend sein und keine Blutungen induzieren, da dies hilft, eine Infektion der Durchblutung zu verhindern. Das abgetrennte Stratum corneum kann durch H&E-Färbung unter Lichtmikroskopie visualisiert werden. Die im Stratum corneum vorhandenen Korneozyten sind flache, eosinophile Zellen, denen Eselfehlen sind. Das Volumen des viralen Inokulums (20 L Tröpfchen) wurde optimiert, um sicherzustellen, dass das Tröpfchen auf dem Fußpad bleibt und die abgesätte Stelle bedeckt. Das sanfte Reiben des Inokulumtröpfchens auf das abgeriebene Fußpolster ist für eine effiziente virale Penetration unerlässlich. Es wird empfohlen zu warten, bis das Fußpolster vollständig trocken ist, um die Anästhesie zu stoppen und das Tier in einen neuen Käfig zu legen. Dieser Schritt wird verhindern, dass die Maus das virale Inokulum vom abgeriebenen Fußpolster leckt. Es wird empfohlen, maximal drei Mäuse gleichzeitig zu verarbeiten, indem ein Nasenkegel verwendet wird, der sie gleichzeitig der Anästhesie aussetzt.
Bei der Maussektion ist es wichtig, Schnitte parallel zur Wirbelsäule zu machen, was Schäden am Rückenmark und der damit verbundenen DRG verhindert. Es wird auch vorgeschlagen, so viel Fett, Muskel und Weichgewebe wie möglich zu entfernen, um versehentliches Schneiden in die Wirbelsäule zu reduzieren und einen besseren Griff auf das Säulensegment mit Zangen zu erleichtern, bevor die Mittellinie zu schneiden.
Es wird auch empfohlen, Querschnitte durch die Wirbelsäule zwischen den Scheiben durchzuführen, um gereinigte Säulensegmente zu erzeugen und das Risiko von schädlichen DRG-Paaren zu begrenzen. Die Meningen rund um das Rückenmark und die Abdeckung des DRG müssen vollständig entfernt werden, um die Identifizierung und Extraktion von DRG zu erleichtern. Das DRG sollte sorgfältig aus der Wirbelsäule entfernt werden, ohne die Zange zu beschädigen. Es ist wichtig, dass die DRG für H&E und Immunfluoreszenzfärbung intakt bleibt. Das Timing ist entscheidend für die Effizienz dieses In-vivo-Experiments, und die Maussektion und die Rückenmarks-/DRG-Extraktion sollten nacheinander durchgeführt werden, um möglichst frisches Gewebe zu sammeln.
Die hier beschriebene Gewebehomogenisierungsmethode wurde optimiert, um eine effiziente Störung einer großen Anzahl heterogener Gewebeproben zu gewährleisten. Es ist von größter Bedeutung, die Menge des verwendeten Gewebes zu standardisieren, was einen direkten Vergleich der ELISA- und qPCR-Ergebnisse zwischen den Proben ermöglicht. Zum Beispiel, Es wird vorgeschlagen, 100 mg Gewebe für jedes Homogenisierungsverfahren wiegen. Jede Gewebeprobe muss vollständig homogenisiert werden, und Reste sollten nicht gefrieren. Es ist wichtig, die Stahlperlen und Zangen vor dem Gebrauch zu autoklavieren, um eine Kontamination während der Homogenisierung zu vermeiden. Ein Volumen von 500 l ist optimal, um eine vollständige Homogenisierung einer 100 mg Gewebeprobe zu gewährleisten. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses begrenzte Volumen nur die Verarbeitung von drei bis vier ELISA-Kits pro Probe erlaubt.
Mit Hilfe des Footpad-Inokulationsmodells wurde gezeigt, dass eine PRV-Infektion bei Mäusen schwere Entzündungen induziert, die durch neutrophile Infiltration im Fußpad und DRG gekennzeichnet sind. Hohe Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen G-CSF und IL-6 wurden auch in vielen homogenisierten Geweben mit ELISA nachgewiesen. Darüber hinaus wurde eine starke Korrelation zwischen PRV-Gen und Proteinexpression (durch qPCR- und IF-Färbung) in DRG und der Produktion beider pro-inflammatorischen Zytokine gefunden.
Dieses Modell eignet sich, um die Kinetik der Virusreplikation/-verbreitung sowie neuroinflammatorische Reaktionen bei verschiedenen Alphaherpesvirus-Infektionen zu vergleichen. Zum Beispiel, was VZV betrifft, haben die eingeschränkte Wirtsspezifität und der Mangel an klinischen Erkrankungen die Verwendung von Tiermodelleneingeschränkt 17. Daher kann das PrV-Impfmodell der Maus ein neues Tiermodell für die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen darstellen, die für neuropathische Pruritus bei Patienten mit postherpetischen Läsionen verantwortlich sind. Basierend auf den Ähnlichkeiten bei klinischen Symptomen, Pathogenese und Genomen zwischen VZV und PRV wird angenommen, dass dieses Mausmodell das Verständnis der VZV-Pathogenese verbessern und zu den Entwicklungen innovativer therapeutischer Strategien führen wird.
Schließlich wird das Modell die Forschung über periphere Neuropathien, wie Multiple Sklerose und damit verbundene viral-induzierte Schäden an der PNS18leiten. Die Pathogenese mehrerer neurotroper Viren (d.h. Tollwutvirus, Poliovirus, West-Nil-Virus, Zika-Virus), die bekanntermaßen das PNS infizieren, kann auch mit diesem Modell19,20,21,22untersucht werden. Das Footpad-Impfmodell kann als mögliches kostengünstiges Werkzeug für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden. Zum Beispiel, Es kann als Plattform dienen, um die Wirksamkeit von entzündungshemmenden und antiviralen Medikamenten zu überprüfen und zu testen, die virale periphere Neuropathien verhindern sollen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Laboratorien von Charles River für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung bei der Durchführung der histopathologischen Analysen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 und RO1 NS060699) finanziert. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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