Summary
Fotputeinokulasjonsmodellen er et verdifullt verktøy for å karakterisere virusinduserte nevroinflammatoriske responser in vivo. Spesielt gir det en klar vurdering av viral kinetikk og tilhørende immunopathological prosesser initiert i det perifere nervesystemet.
Abstract
Denne protokollen beskriver en fotputeinokulasjonsmodell som brukes til å studere initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon hos mus. Som alfaherpesvirus er hovedinntrengere i det perifere nervesystemet (PNS), er denne modellen egnet til å karakterisere kinetikkene til viral replikering, spredning fra PNS til CNS, og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen gjør at viruspartikler kan spre seg fra et primært infeksjonssted i fotputeeeepidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre som innervate epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg via isjiasnerven til dorsale rotgangene (DRG) og til slutt gjennom ryggmargen til hjernen. Her er en musefotpute inokulert med pseudorabies virus (PRV), et alfaherpesvirus nært relatert til herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne modellen viser at PRV-infeksjon induserer alvorlig betennelse, preget av nøytrofil infiltrasjon i fotblokken og DRG. Høye konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner oppdages senere i homogenisert vev av ELISA. I tillegg observeres en sterk korrelasjon mellom PRV-gen- og proteinuttrykk (via qPCR og IF-farging) i DRG og produksjon av proinflammatoriske cytokiner. Derfor gir fotputeinokulasjonsmodellen en bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier og kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. I tillegg kan modellen veilede forskning på perifere nevropatier, for eksempel multippel sklerose og tilhørende virusindusert skade på PNS. Til syvende og sist kan det tjene som et kostnadseffektivt in vivo-verktøy for narkotikautvikling.
Introduction
Denne studien beskriver en fotputeinokulasjonsmodell for å undersøke replikering og spredning av virus fra PNS til CNS og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen har blitt intensivt brukt til å studere alfaherpesvirusinfeksjon i nevroner1,,2,3. Hovedmålet med denne modellen er å tillate nevrotropiske virus å reise en maksimal avstand gjennom PNS før du når CNS. Her brukes denne modellen til å få ny innsikt i utviklingen av en bestemt nevropati (nevropatisk kløe) hos mus infisert med pseudorabies virus (PRV).
PRV er et alfaherpesvirus relatert til flere kjente patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsaker forkjølelsessår, genital lesjoner og kylling pox, henholdsvis4. Disse virusene er alle pantropiske og i stand til å infisere mange forskjellige celletyper uten å vise affinitet for en bestemt vevstype. Imidlertid viser de alle en karakteristisk nevrotropisme ved å invadere PNS (og av og til CNS) av vertsarter. Den naturlige verten er grisen, men PRV kan infisere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige vertene smitter PRV PNS og induserer en alvorlig kløe kalt "mad itch", etterfulgt av perakutt død5,6. Rollen til nevroimmun respons i det kliniske utfallet og patogenesen av PRV-infeksjon har blitt dårlig forstått.
Fotputeinokulasjonsmodellen gjør det mulig for PRV å starte infeksjon i fotputens epidermale celler. Deretter sprer infeksjonen seg inn i sensoriske og sympatiske nervefibre som innerverer epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg av viruspartikler som beveger seg via isjiasnerven til DRG innen ca. 60 timer. Infeksjonen sprer seg gjennom ryggmargen, og når til slutt bakhjernen når dyr blir moribund (82 t etter infeksjon). I løpet av dette tidsvinduet kan vevsprøver samles inn, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponsen. For eksempel kan histologisk undersøkelse og virusbelastning kvantifisering utføres i forskjellige vev for å etablere sammenhenger mellom initiering og utvikling av kliniske, virologiske og nevroinflammatoriske prosesser i PRV patogenese.
Ved hjelp av fotputeinkulasjonsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismene til PRV-indusert kløe hos mus undersøkes. Videre kan denne modellen gi ny innsikt i initiering og utvikling av virusinflammation under herpesvirusinfeksjoner. En bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne modellen nyttig å undersøke mekanismene for nevropatisk kløe hos pasienter med post-herpetic lesjoner (f.eks herpes zoster, helvetesild) og teste nye terapeutiske mål hos mus for tilsvarende menneskelige sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til en protokoll (nummer 2083-16 og 2083-19) gjennomgått og godkjent av Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Princeton University. Dette arbeidet ble gjort ved å følge kravene til biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2), som vi har et fullt utstyrt laboratorium godkjent av Princeton University biosikkerhetskomité. Prosedyrene inkludert mus footpad slitasje, viral inokulasjon, musedisseksjon, og vev samling ble utført i en biologisk sikkerhetsskap (BSC) i Princeton University biocontainment dyr anlegget rommet. De som utførte prosedyren hadde engangskjoler, hodedeksel, øyebeskyttelse, sterile hansker, kirurgiske masker og skodeksler.
1. Mus footpad slitasje
- Bedøve en C57BL/6 mus (5–7 uker gammel) med isoflurangassbedøvelse, levert med en dose på 3 % via et lite anestesisystem (kammer).
- Plasser musen i det kirurgiske planet av anestesi på ryggen, før inokulasjon, i bakfotputen. Fest en nesekjegle med en membran (en spalte som er tilstrekkelig dimensjonert til å passe dyrets snute) til musen og lever isoflurangassbedøvelse med en konstant dose på 1,5 %–2,0 %.
- Nøye overvåke musen for et svar på smertefull stimulans skapt ved kraftig klemming av tåen med tang.
- Ta lett tak i en bakfotpute med flate tang.
- Forsiktig slip glabrous huden på bakfoten ca 20x, mellom hælen og gå pads, med en emery bord (100-180 grus). Ikke induser blødning ved å slipe for ofte eller bruke for mye trykk.
- Ved hjelp av fine tang, sakte skrelle av stratum corneum løsrevet ved slitasje for å eksponere stratum basale.
2. PRV footpad inokulasjon
- Forbered viruset inoculum fortynnet til ønsket titer i DMEM media som inneholder 2% foster storfe serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (Tabell over materialer).
- Kvant antall plakkdannende enheter (PFU) i viruslageret på PK15-celler for å beregne og standardisere virusdosen og fortynne det virale inoculum tilsvarende.
MERK: I denne studien ble virulent stamme av PRV (PRV-Becker) brukt i en dose på 8 x 106 PFU. Denne dosen ble optimalisert i et tidligere foreløpig eksperiment for å sikre at alle vaksinerte dyr viste kliniske symptomer ved 82 t etter inokulasjon (hpi). - Hold viruset inoculum på is og bland forsiktig før bruk.
- Kvant antall plakkdannende enheter (PFU) i viruslageret på PK15-celler for å beregne og standardisere virusdosen og fortynne det virale inoculum tilsvarende.
- Legg til en 20 μL dråpe virusinkulum (8 x 106 PFU) på den slipte fotplaten (lokal administrasjon). Utfør mock inokulasjoner (bare middels) parallelt.
- Gni forsiktig 10x med akselen på en nål for å lette adsorpsjon av viruset. Unngå riper med nålepunktet. Gjenta dette trinnet hver 10.
- Hold musen under anestesi i 30 min til den slipte fotputen er tørr.
- Etter å ha stoppet anestesi, overvåk musen til den kan opprettholde sternal liggende og plassere den i et individuelt bur for klinisk oppfølging og prøvetaking.
3. Mus disseksjon og vev samling
- Til passende tider etter infeksjon, euthanize musen ved kvelningsmetoden (CO2).
MERK: I denne studien er humant endepunkt (når dyr begynner å vise terminale symptomer) for PRV-Becker-infiserte mus 82 hki. Euthanize kontrollere dyr parallelt. - Plasser musen ventral side vendt opp på en kirurgisk matte ved hjelp av nåler / pinner. Sikre musens lemmer med pinner til et kirurgisk skumbrett. Fukt den ventrale siden av musen med 70% etanol for å minimere pelsforurensning.
- Klyp det ytre laget av pels og hud ved hjelp av tang og gjør et lite innledende snitt ved hjelp av fin saks nær urinåpningen.
- Fra denne åpningen, fortsett snittet på midten ventral side opp til haken.
- Utvid to laterale snitt mot ekstremitetene i forbenene og baklemmene.
- Skill huden fra det underliggende muskellaget og pin ned til siden.
- Åpne bukhulen og incise opp til bunnen av thoraxen. Fullfør åpningen av bukhulen ved å lage to tverrgående snitt.
- Åpne thoraxhulen ved å kutte membranen og ribbeina på begge sidesidene.
MERK: Hvis du kutter sidene av brystkassen, forhindrer risikoen for å kutte hjertet. - Samle eksponerte organer, inkludert hjerte, lunger, milt, bukspyttkjertel, lever, nyrer og blære i 1,5 ml mikrorør. Hold rørene på is.
- Klipp den slipte fotplaten mellom hælen og gåputene og plasser vevsbiten i et rør som beskrevet i trinn 3.3.6.
- Plasser musen dorsal side opp og våt pelsen med 70% etanol. Skjær ned hudlaget for å eksponere vertebralkolonnen.
- Lag et lite snitt i bekkenets region. Fjern huden fra baklemmene mot hodet.
- Fjern bena og armene ved å kutte med saks parallelt med og nær ryggsøylen på begge sider.
- Klipp hodet av ved bunnen av skallen (C1-C2 nivå).
- Klipp opp skallen med saks fra foramen magnum til frontbenet.
- Trekk opp skallen i sideretninger ved hjelp av tang.
- Øse forsiktig ut hjernen ved hjelp av tang og fortsett som beskrevet i trinn 3.3.6.
- Rengjør ryggsøylen ved å kutte muskler, fett og bløtvev ved hjelp av buet saks. Skjær halen. Plasser den intakte ryggsøylen i et 15 ml rør som inneholder steril iskald fosfatbufret saltvann (PBS). Hold rørene på is inntil videre disseksjon av ryggmargen og DRG.
4. Ryggmarg og DRG-ekstraksjon
MERK: Trekk ut ryggmargen og DRG fra ryggvirvlene direkte etter musedisseksjon. Protokollen for ryggmarg og DRG-ekstraksjon er tilpasset fra en tidligere publikasjon7.
- Fjern ryggvirvlene fra iskaldt PBS-rør og fjern gjenværende bløtvev, som blir lettere etter kjøling.
- Lag tre tverrgående kutt i kolonnen gjennom ryggvirvlene (T1-, L1- og S2-nivåene) ved hjelp av et barberblad. Legg de tre bitene i en 15 mm petriskål som inneholder sterile iskalde PBS. Hold oversikt og merk opprinnelsen til segmenter for senere analyse.
- Ta ett segment og fest det mellom tang, dorsal side vendt opp. Lag en enkelt, langsgående kutt ned gjennom midtlinjen ved hjelp av et barberblad, splitting kolonnen i to like halvdeler.
- Plasser begge halvdelene i en ny petriskål som inneholder nye sterile iskalde PBS. Sørg for riktig orientering av segmentet for å kunne skille venstre og høyre side.
- Under et disseksjonsmikroskop, fjern forsiktig ryggmargen ut av ryggvirvlene fra hver halvdel i en rostral til caudal retning ved hjelp av fine tang.
- Samle begge ryggmargshalvdelene i 1,5 ml mikrorør som inneholder 500 μL sterile iskalde PBS. Hold rørene på is.
- Fjern forsiktig meningene fra den ene siden av ryggraden til den andre for å eksponere DRG.
- Fjern hver DRG individuelt ved å gripe den eksponerte spinalnerven og trekk den forsiktig ut av ryggsøylen. Plasser den oppsamlede DRG i en 15 mm petriskål som inneholder iskald pbs. Høst alle ipsilaterale og kontralaterale DRG separat fra ryggsøylesegmentet og fortsett som beskrevet i trinn 4.5.
MERK: DRG er synlig som en rund gjennomsiktig struktur langs den hvite spinalnerven. - Gjenta trinn 4.3–4.7 ved hjelp av de to andre ryggsøylesegmentene innen 30–45 min.
- Sentrifuger alle rør ved høy hastighet (17 900 x g)i 3 min ved 4 °C.
- Aspirere supernatant og flash-fryse rør i flytende nitrogen. Oppbevar rørene ved -80 °C for ytterligere vevs homogenisering.
- Alternativt, fikse og seksjoner renset DRG og andre musevev for histoppathological analyser og / eller immunofluorescens farging etter trinn 4.9.
5. Vev homogenisering
- Tin rørene som inneholder frosne vevsprøver på is.
- Vei 100 mg vev og plasser det i et 2 ml mikrosytrifugerrør som inneholder en steril stålperle og 500 μL RIPA-buffer som inneholder 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10 % SDS og protease cocktailhemmere.
- Forstyrre vev ved romtemperatur (RT) ved hjelp av en homogenisator ved 20 sykluser / s i 2 min, etterfulgt av en 1 min ventetid, deretter 20 sykluser / s i 2 min.
- Sentrifuger røret ved høy hastighet (17 900 x g)i 10 min ved RT.
- Samle supernatant (500 μL) i et nytt rør og oppbevar det ved -20 °C til elisa og qPCR skal kvantifisere inflammatoriske markører og virusbelastninger.
MERK: For qPCR samler du alle prøver med RNase-fritt materiale (dvs. perler, rør osv.) og forstyrrer vev med RNA-lysisbuffer som inneholder 1 % betamercaptoethanol (Tabell over materialer).
6. Forberedelse og immunfluorescens farging av frosne DRG seksjoner
- Vevsbehandling
- Fest dissekert og rengjort DRG i 1% paraformaldehyd (PFA) for 2 timer ved RT.
- Overfør vevet til et 15 ml rør med 10% sukrose i PBS. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Overfør vevet til et 15 ml rør med 20% sukrose i PBS. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Overfør vevet til et 15 ml rør med 30% sukrose i PBS. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Bygg inn vev i OCT ved hjelp av en kryogamme og legg blokker i tørris for rask frysing.
- Oppbevar prøvene ved -80 °C til bruk.
- Kryoseksjonspreparat
- Fjern den frosne blokken fra -80 °C og la den likevekte i kryostatkammertemperaturen i 30 min.
- Kryosection DRG med en tykkelse på 15 μm og monter seksjonene på lysbilder.
- Bruk en penn til å tegne en hydrofob sirkel rundt det lysbildemonterte vevet.
- Hold lysbildene ved 4 °C til flekker.
- Immunofluorescens farging
- Vask DRG-seksjonene 3x i PBS i 10 min ved RT.
- Inkuber seksjonene med 100 μL ønsket primær antistoff (f.eks. mus antistoff mot PRV glykoprotein B) i 1 time ved 37 °C. Fortynn det primære antistoffet i PBS som inneholder 10% negativt geitserum.
- Gjenta trinn 6.3.1.
- Inkuber seksjonene med 100 μL ønsket sekundært antistoff (geit anti-mus Alexa Fluor 488) i 50 min ved 37 °C. Fortynn sekundært antistoff i PBS bare.
- Tilsett 100 μL DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) fargestoff fortynnet i PBS på avsnittet. Ytterligere inkubere prøver 10 min ved 37 °C.
- Gjenta trinn 6.3.1.
- Monter prøvene ved hjelp av et fluorescensmonteringsmedium på glasslysbilder og fest og dekk med deksler.
7. Forberedelse og H&E farging av parafin-innebygde vevsseksjoner
- Fest vevet i 10% formalin i 24 timer ved 4 °C.
- Utfør standard behandlingsplan for parafin innebygging og snitting av fast vev. Overfør fast vev til 70% etanol og behandle gjennom oppgraderte alkoholer til xylen etterfulgt av parafin, som tidligere beskrevet8.
MERK: Bruk polyestersvamper til å holde små vevsprøver som DRG inne i kassetter. - Utfør standard deparaffinisering etterfulgt av H&E-farging av vevsseksjoner, som tidligere beskrevet9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus footpad inokulasjon modellen gjør det mulig for karakterisering av immunopathogenese av alfaherpesvirus infeksjon in vivo, inkludert replikering og spredning av infeksjonen fra inoculated footpad til nervesystemet og induksjon av spesifikke nevroinflammatoriske reaksjoner.
I denne studien, vi først slipt musen bak footpad og enten mock-inoculated eller inoculated den slipte regionen med en virulent stamme av PRV (PRV-Becker). Stedet for slitasje var synlig i kontrollfoten. En skorpe ble dannet på slitasjestedet som en del av helbredelsesprosessen (Figur 1, svart pil). I motsetning viste mus inokulert med PRV alvorlig betennelse ved humant endepunkt (82 hpi), preget av hevelse i fotputen og rødhet.
Etter fotputeinnløsning med virulent PRV-Becker-stammen, begynte musene å vise kliniske tegn ved 72 hpi, preget av hevelse i den inokulerte fotputen og stadig hyppigere skjelvinger. Ved 82 hki viste PRV-Becker-infiserte mus konstante skjelvinger i det inokulerte benet og karakteristiske PRV-symptomer, inkludert intens riper og biting av foten. Alvorlig betennelse ble også observert i fotblokken. Den inflammatoriske responsen som ble indusert under PRV-infeksjon ble deretter ytterligere karakterisert, inkludert infiltrasjon av immunceller i vev.
Histopodoologisk undersøkelse av flere vev ble utført, inkludert den inokulerte fotputen og DRG, etterfulgt av H&E-farging av parafininbygde vevsseksjoner. Epidermal nekrose og alvorlig dermal betennelse (ødem og fibrin) ble observert i PRV-infiserte fotseksjoner (figur 2A, panel b). Epidermis, dermis, og bindevev av infiserte mus viste en massiv infiltrasjon av nøytrofiler (identifisert av multilobed kjerner) merket med svarte piler. Fotkontroller av kontrollmus var normale (Figur 2A, panel a). PRV-infisert DRG viste minimal nevronal nekrose og blandet betennelse hos infiserte mus mens DRG av kontrollmus var normale (Figur 2B, paneler a og b). Blandet betennelse infiltrasjon besto hovedsakelig av nøytrofiler og lymfocytter.
Deretter ble kinetikken til inflammatorisk cytokinproduksjon i musevev etter ATV-fotputeinokulasjon etablert. Nivåer av spesifikke inflammatoriske cytokiner ble kvantifisert (dvs. interleukin-6 [IL-6] og granulocyttkolonistimulerende faktor [G-CSF]) fra flere vev samlet og homogenisert fra kontroll og PRV-infiserte mus. Resultatene viste en betydelig økning av G-CSF-nivåer i fotplaten og DRG sammenlignet med kontroller ved 7 hpi og 82 hpi (figur 3A). Signifikante G-CSF-nivåer ble observert ved 82 hki i ryggmargen, hjernen, hjertet og levervevet til PRV-infiserte mus sammenlignet med kontroller. Videre ble det påvist signifikante IL-6-nivåer i alle vev av PRV-infiserte mus sammenlignet med kontroller som starter på 24 hpi (figur 3B).
Fotputeinokulasjonsmodellen ble videre brukt til å undersøke PRV-replikering og spre seg fra den inokulerte fotblokken til PNS og CNS og potensielle korrelasjoner med nevroinflammatorisk responsutvikling. PRV-laster ble kvantifisert i flere homogeniserte vev av qPCR for å forsterke PRV DNA. DNA-konsentrasjon ble deretter konvertert til PFU, som tidligere beskrevet10. PRV-laster ble påvist i fotplaten fra 24 hki (~1 x 104 PFU/mg vev) og i DRG fra 60 hk (~1 x 103 PFU/mg vev; data som ikke er vist).
I en moribund tilstand (82 hpi) ble PRV påvist i fotputen, DRG, ryggmargen og hjernen, med den høyeste konsentrasjonen av PRV i DRG (~ 1 x 105 PFU/mg vev; Figur 4). PRV-infeksjon av DRG ble bekreftet ved indirekte immunofluorescensfarging av DRG-kryfoksjoner. PRV-infeksjon ble påvist hos DRG-nevroner ved bruk av anti-PRV gB-antistoff. PRV glykoprotein gB ble uttrykt i sene stadier av infeksjon i cytoplasma av infiserte celler. Som forventet ble det cytoplasmatiske uttrykket av PRV gB (grønn) bekreftet i infisert DRG, mens ingen gB ble uttrykt i kontrollprøver (figur 5). Cellekjerner ble identifisert med DAPI-farging (blå).
Figur 1: Representative bilder av musen høyre bakpoter etter PRV inokulasjon. Mus er enten mock-inoculated eller inoculated med PRV i den slipte høyre bakfoten. PRV-inokulert fotblokk viser tegn på betennelse, inkludert rødhet og hevelse ved humant endepunkt (82 hpi). Fotkontrollen av kontrollmus ser ut til å være normalt med en mørk rød skorpe på det slipte stedet, noe som indikerer at såret helbreder. Svarte piler indikerer stedet for slitasje. Dette tallet er endret fra en tidligerepublikasjon 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Histopathological funn i footpad og DRG etter PRV footpad inokulasjon. Hematoxylin og eosin (H&E) farging av (A) mus inokulert fotputer og (B) og ipsilateral DRG fra kontroll (panel a) og PRV-infiserte (panel b) mus på 82 hpi. Histopodologiske manifestasjoner observert i PRV-infiserte vev (epidermal og nevronal nekrose og nøytrofil infiltrasjon) er fraværende fra alle undersøkte mock-infiserte mus. Resultatene er representative for tre biologiske replikeringer for en gitt type vev. Svarte piler indikerer representative områder av betennelse med immuncelleinfiltrasjon. Vektstenger (50 μm) er angitt for hvert bilde. Dette tallet er endret fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kinetikk av inflammatorisk cytokinproduksjon i homogenisert musevev etter PRV-fotputeinokulasjon. (A) G-CSF og (B) IL-6 proteinnivåer oppdaget i PRV-infisert (rød) og kontroll (svart) mus homogenisert vev ved forskjellige hpi. Proteinnivåer kvantifiseres av ELISA og uttrykkes som pikgram (pg) per mg (mg) av homogenisert vev (n = 5 per gruppe, *p < 0,05, ns = ikke signifikant). Dette tallet er endret fra en tidligerepublikasjon 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvantifisering av PRV-genom i mus homogenisert vev. PRV DNA kvantifiseres i homogenisert musevev ved qPCR ved hjelp av PRV UL54 primere. PRV-laster uttrykkes som plakkdannende enheter (PFU) per mg vev. PRV DNA oppdages bare i foten, DRG, ryggmargen og hjernen (og ikke i andre vev), n = 10 per gruppe. Stiplet linje viser gjenkjenningsgrensen. Dette tallet er endret fra en tidligerepublikasjon 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Vurdering av PRV-infeksjon i DRG-nevroner ved immunofluorescensfarging. Confocal Z-stack bilder av mock- og PRV-infiserte DRG nevroner etter immunofluorescens farging ved hjelp av en mus antistoff spesifikk for PRV gB (grønn). Cellekjerner er farget med DAPI (blå, paneler a og c). Panel d viser flere PRV-infiserte nevroner som uttrykker gB (hvite piler). Det oppdages ingen gB-uttrykk i kontrollen DRG-seksjoner (panel b). Vektstenger (50 μm) er angitt for hvert bilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fotputeinokulasjonsmodellen som er beskrevet her, er nyttig for å undersøke initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon. Videre brukes denne in vivo-modellen til å etablere kinetikk av replikering og spredning av alfaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er et alternativ til andre inokulasjonsmodeller, for eksempel flankehudinokulasjonsmodellen, som er avhengig av dyp dermal riper13, eller intrakraniell rute, som direkte introduserer viruset i CNS14,15,16. Som et resultat, med fotputemodellen, er det mulig å få en mer detaljert vurdering av viral kinetikk av replikering og spre seg med tilhørende lokale og fjerne immunopathological prosesser i nervesystemet11,12.
I denne protokollen er slitasjen på fotblokken og påfølgende viral inokulasjon avgjørende trinn. Faktisk må stratum corneum fjernes helt etter tilstrekkelig slitasje for å utsette stratum basale til viral inoculum for vellykket infeksjon. Imidlertid må slitasjen være mild og ikke indusere blødning, da dette bidrar til å forhindre infeksjon i blodsirkulasjonen. Den frittliggende stratum corneum kan visualiseres ved H & E farging under lys mikroskopi. Hornhinnene som finnes i stratum corneum er flate, eosinofile celler som mangler kjerner. Volumet av det virale inoculum (20 μL dråpe) er optimalisert for å sikre at dråpen forblir på fotplaten og dekker det slipte området. Forsiktig gni inoculum dråpe på den slipte footpad er avgjørende for effektiv viral penetrasjon. Det anbefales å vente til fotplaten er helt tørr for å stoppe anestesi og plassere dyret i et nytt bur. Dette trinnet vil unngå musen fra å slikke viral inoculum av den slipte footpad. Det anbefales å behandle maksimalt tre mus samtidig, ved hjelp av en nesekjegle som er satt til å utsette dem samtidig for anestesi.
Mens du utfører musedisseksjonen, er det viktig å gjøre kutt parallelt med ryggvirvlene, noe som forhindrer skade på ryggmargen og tilhørende DRG. Det er også foreslått å fjerne så mye fett, muskel, og bløtvev som mulig for å redusere utilsiktet skjæring i ryggsøylen og lette et bedre grep på kolonnesegmentet med tang før du kutter ned midtlinjen.
Det anbefales også å utføre tverrgående kutt gjennom ryggvirvlene mellom plater for å produsere rensede kolonnesegmenter og begrense risikoen for å skade DRG-par. Meningene rundt ryggmargen og dekker DRG må fjernes helt for å lette identifisering og ekstraksjon av DRG. DRG bør fjernes forsiktig fra ryggsøylen uten skade fra tang. Det er viktig at DRG forblir intakt for H&E og immunofluorescensfarging. Timing er avgjørende for effektiviteten av dette in vivo-eksperimentet, og musedisseksjonen og ryggmargen/DRG-ekstraksjonen bør utføres fortløpende for å samle vev som er så friskt som mulig.
Vevhomogeniseringsmetoden som er beskrevet her, er optimalisert for å sikre effektiv forstyrrelse av et stort antall heterogene vevsprøver. Det er avgjørende å standardisere mengden vev som brukes, noe som gjør det mulig å sammenligne ELISA- og qPCR-resultater mellom prøver. For eksempel er det foreslått å veie 100 mg vev for hver homogeniseringsprosedyre. Hver vevsprøve må homogeniseres i sin helhet, og rester bør ikke fryse tines. Det er viktig å autoklavere stålperlene og tangene før bruk for å unngå forurensning under homogenisering. Et volum på 500 μL er optimalt for å sikre fullstendig homogenisering av en 100 mg vevsprøve. Det er viktig å merke seg at dette begrensede volumet kun tillater behandling av tre til fire ELISA-sett per prøve.
Ved hjelp av fotputeinkulasjonsmodellen ble det vist at PRV-infeksjon hos mus induserer alvorlig betennelse, preget av nøytrofil infil infil infiltrasjon i fotputen og DRG. Høye konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner G-CSF og IL-6 ble også påvist i mange homogeniserte vev ved hjelp av ELISA. I tillegg ble det funnet en sterk korrelasjon mellom PRV-gen- og proteinuttrykk (ved qPCR og IF-farging) i DRG og produksjon av begge proinflammatoriske cytokiner.
Denne modellen er egnet til å sammenligne kinetikk av viral replikering / spredning samt nevroinflammatoriske responser blant forskjellige alfaherpesvirusinfeksjoner. For eksempel, når det gjelder VZV, har den begrensede vertsspesifisiteten og mangelen på klinisk sykdom begrenset bruken av dyremodeller17. Derfor kan musefotpaden PRV inokulasjonsmodellen representere en ny dyremodell for studiet av cellulære og molekylære mekanismer som er ansvarlige for nevropatisk kløe hos pasienter med post-herpetic lesjoner. Basert på likhetene i kliniske tegn, patogenese og genomer mellom VZV og PRV, antas det at denne musemodellen vil forbedre forståelsen av VZV patogenese og føre til utviklingen i innovative terapeutiske strategier.
Til slutt vil modellen veilede forskning på perifere nevropatier, for eksempel multippel sklerose og tilhørende virusindusert skade på PNS18. Patogenesen av flere nevrotropiske virus (dvs. rabiesvirus, poliovirus, West Nile virus, Zika virus), som er kjent for å infisere PNS, kan også studeres ved hjelp av denne modellen19,20,21,22. Fotputeinnløsningsmodellen kan brukes som et mulig kostnadseffektivt verktøy for legemiddelutvikling. For eksempel kan det tjene som en plattform for å screene og teste effekten av antiinflammatoriske og antivirale legemidler designet for å forhindre viral-induserte perifere nevropatier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Charles laboratorier for deres utmerkede tekniske støtte som utfører histopatologianalyser. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
- Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
