Summary
脚垫接种模型是描述体内病毒引起的神经炎反应的宝贵工具。特别是，它提供了病毒动力学和相关免疫病理过程在周围神经系统启动的明确评估。
Abstract
该协议描述了一种脚垫接种模型，用于研究小鼠α疱疹病毒感染期间神经炎症反应的启动和发展。由于αherpes病毒是周围神经系统（PNS）的主要入侵者，该模型适用于病毒复制的动力学、从PNS到CNS的传播以及相关的神经炎症反应。脚垫接种模型允许病毒颗粒从脚垫表皮的主要感染部位传播到内层、汗腺和真皮的感官和同情神经纤维。感染通过坐骨神经传播到背根神经（DRG），并最终通过脊髓传播到大脑。在这里，鼠标脚垫接种了伪狂犬病病毒（PRV），一种与单纯疱疹病毒（HSV）和水痘-佐斯特病毒（VZV）密切相关的α疱疹病毒。该模型表明，PRV感染诱发严重炎症，其特点是中性粒细胞渗透和DRG。ELISA随后在同质组织中检测到高浓度的炎症细胞因子。此外，观察到DRG中的PRV基因和蛋白质表达（通过qPCR和IF染色）与亲炎细胞因子的产生之间有很强的相关性。因此，脚垫接种模型提供了更好地了解αherpes病毒引起的神经病变背后的过程，并可能导致创新治疗策略的发展。此外，该模型可以指导对周围神经病变的研究，如多发性硬化症和相关的病毒引起的对PNS的损害。最终，它可以作为药物开发具有成本效益的体内工具。
Introduction
这项研究描述了一个脚垫接种模型，以调查病毒从PNS到CNS的复制和传播以及相关的神经炎症反应。脚垫接种模型已被密集用于研究神经元,1、2、32中的αherpes病毒感染。13该模型的主要目标是允许神经热带病毒在到达CNS之前通过PNS到达最大距离。在这里，这个模型被用来获得新的见解，在感染伪狂犬病病毒（PRV）的小鼠中发展一种特定的神经病变（神经病变瘙痒）。
PRV是一种与几种众所周知的病原体（即单纯疱疹1型和2型[HSV1和HSV2]和水痘-佐斯特病毒[VZV]）相关的α疱疹病毒，分别引起冷疮、生殖器病变和水痘4。这些病毒都是泛异性的，能够感染许多不同的细胞类型，而不表现出对特定组织类型的亲和力。然而，它们都表现出一种典型的神经营养，入侵宿主物种的PNS（偶尔还有CNS）。自然宿主是猪，但PRV可以感染大多数哺乳动物。在这些非自然宿主中，PRV感染PNS并诱发一种称为"疯痒"的严重瘙痒，然后是急性死亡55，6。6神经免疫反应在PRV感染的临床结果和发病机制中的作用一直知之甚少。
脚垫接种模型允许PRV在脚垫的表皮细胞中启动感染。然后，感染扩散到感觉和同情神经纤维，内生表皮，汗腺，和真皮。感染通过通过坐骨神经向DRG移动的病毒颗粒在大约60小时内传播。感染通过脊髓传播，当动物垂死（感染后82小时）时，最终到达后脑。在此期间，可以收集、处理和分析组织样本，以进行病毒复制和免疫反应标记。例如，组织学检查和病毒载量定量可以在不同的组织中进行，以确定PRV发病机制中临床、病毒学和神经炎过程的启动和发展之间的相关性。
利用脚垫接种模型，可以研究小鼠PRV诱导瘙痒的细胞和分子机制。此外，该模型可以提供新的见解，在疱疹病毒感染期间病毒引起的神经炎症的启动和发展。更好地了解αherpes病毒引起的神经病变背后的过程，可能导致创新治疗策略的发展。例如，该模型有助于研究疱疹后病变患者（如疱疹、带状疱疹）的神经病变机制，并测试小鼠中针对相应人类疾病的新治疗靶点。
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Protocol
所有动物实验均按照一项议定书（编号2083-16和2083-19）进行，该议定书由普林斯顿大学动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。这项工作是严格按照生物安全等级2（BSL-2）的要求进行的，我们拥有一个设备齐全的实验室，得到普林斯顿大学生物安全委员会的批准。包括小鼠脚垫磨损、病毒接种、小鼠解剖和组织收集在内的程序在普林斯顿大学生物防护动物设施室的生物安全柜（BSC）中执行。执行手术的人穿着一次性礼服、头罩、护目带、无菌手套、外科口罩和鞋套。
1. 鼠标脚垫磨损
- 用异物菌气体麻醉剂麻醉C57BL/6小鼠（5~7周大），通过小型麻醉系统（室）以3%的剂量提供。
- 在接种前，将鼠标放在麻醉外科的背上，放在后脚垫中。将带有隔膜（大小足以适合动物的枪口）的鼻锥连接到小鼠，以1.5%~2.0%的固定剂量提供异物菌气体麻醉剂。
- 密切监控鼠标，以刺激用钳子用力捏住脚趾，从而对痛苦的刺激反应。
- 轻轻抓住一个带扁平钳子的后脚垫。
- 轻轻磨擦后脚垫的玻璃皮约 20 倍，在脚跟和步行垫之间，用砂板 （100~180 砂砾）。不要因磨蚀太频繁或施加过大压力而引起出血。
- 使用细钳子，慢慢剥去由磨损分离的地层角膜，露出地层。
2. PRV 脚垫接种
- 在含有2%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（材料表）的DMEM介质中，将病毒稀释到所需的山丁体中。
- 量化PK15细胞上病毒储存中的斑块形成单位（PFU）的数量，以计算和标准化病毒剂量，并相应地稀释病毒内皮。
注：在这项研究中，以8 x 106 PFU的剂量使用PRV（PRV-Becker）的毒性菌株。在以前的初步实验中，这种剂量得到了优化，以确保所有接种的动物在接种后82小时（hpi）出现临床症状。 - 将病毒在冰上保持，并在使用前轻轻混合。
- 量化PK15细胞上病毒储存中的斑块形成单位（PFU）的数量，以计算和标准化病毒剂量，并相应地稀释病毒内皮。
- 在磨损的脚垫（局部管理）上添加 20 μL 病毒内库（8 x 106 PFU）。并行执行模拟接种（仅限中等）。
- 用针头的轴轻轻擦10倍，以方便吸附病毒。避免用针尖划伤。每 10 分钟重复此步骤。
- 将鼠标麻醉30分钟，直到磨碎的脚垫干燥。
- 停止麻醉后，监测小鼠，直到它能保持胸骨再生，并将其放在单独的笼子里进行临床跟踪和取样。
3. 小鼠解剖和组织收集
- 感染后的适当时间，通过窒息法（CO2）对小鼠进行安乐死。
注：在这项研究中，PRV-Becker感染小鼠的人道终点（当动物开始表现出终端症状时）是82 hpi。同时安乐死控制动物。 - 使用针头/针将鼠标腹腔侧朝上放在手术垫上。用针固定鼠标的四肢到手术泡沫板。用70%乙醇对小鼠的腹腔进行湿润，以尽量减少毛皮污染。
- 使用钳子捏住毛皮和皮肤的外部层，并使用细剪刀在尿道开口附近进行一个小的初始切口。
- 从这个开口，继续切口在中间腹侧到下巴。
- 向前肢和后肢延伸两个侧切口。
- 将皮肤与底层肌肉层分开，并固定到侧面。
- 打开腹腔，切开到胸部底部。通过做两个横向切口完成腹腔的开口。
- 通过切割两侧隔膜和肋骨打开胸腔。
注：切割肋骨的侧面可防止心脏切开的风险。 - 在1.5mL微管中收集暴露的器官，包括心脏、肺、脾脏、胰腺、肝脏、肾脏和膀胱。把管子放在冰上。
- 在脚跟和走垫之间切开磨损的脚垫，并将一块纸巾放在管子中，如步骤 3.3.6 所述。
- 将鼠标背侧向上放置，用 70% 乙醇润湿毛皮。剪切皮肤层以露出椎骨柱。
- 在骨盆区域做一个小切口。将皮肤从后肢剥到头部。
- 用剪刀与两侧并靠近脊柱平行切割，取出腿部和手臂。
- 在头骨底部（C1+C2 水平）砍掉头部。
- 用剪刀把头骨从前臂切开到前骨。
- 使用钳子以横向方向拉开头骨。
- 使用钳子轻轻挖出大脑，按照步骤3.3.6所述进行。
- 使用弯曲的剪刀切割肌肉、脂肪和软组织，清洁脊柱。切尾巴将完整的脊柱放在含有无菌冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的15 mL管中。将管子放在冰上，直到进一步解剖脊髓和DRG。
4. 脊髓和DRG提取
注：在小鼠解剖后直接从椎骨柱中提取脊髓和DRG。脊髓和DRG提取的规程是从以前的出版物7中改编的。
- 从冰冷的PBS管中取出椎骨柱，并去除剩余的软组织，在冷藏后更容易。
- 使用剃刀刀片在柱中穿过椎骨（T1、L1 和 S2 级别）进行三个横向切割。将三块放入含有无菌冰冷PBS的 15 mm 培养皿中。跟踪和标记段的源，以便以后进行分析。
- 取一个段，并将其固定在钳子之间，背侧朝上。使用剃刀刀片在中线进行单个纵向切割，将柱子分成两个相等的两半。
- 将两半放入包含新无菌冰冷 PBS 的新培养皿中。确保线段的正确方向能够区分左右两侧。
- 在解剖显微镜下，用细钳子轻轻地将脊髓从椎骨柱中剥离出每半根，以向方向倾斜。
- 将两个脊髓半部分收集在含有 500 μL 无菌冰冷 PBS 的 1.5 mL 微管中。把管子放在冰上。
- 轻轻地从脊柱的一侧取出脑膜到另一侧，露出DRG。
- 通过抓住暴露的脊髓神经，将其轻轻地从脊柱中拉出，单独取出每个DRG。将收集的 DRG 放入包含冰冷 PBS 的 15 mm 培养皿中。从脊柱部分单独收获所有ipsi边和反向DRG，按照步骤4.5所述进行。
注：DRG 是沿着白色脊柱神经的圆形透明结构可见的。 - 在 30–45 分钟内使用另外两个脊柱段重复步骤 4.3_4.7。
- 在4°C下，以高速（17，900 x g）将所有管离心 3 分钟。
- 液氮中吸气上清和闪冻管。将管储存在-80°C，以进一步组织均质化。
- 或者，修复和截面清洁的DRG和其他小鼠组织，用于组织病理学分析和/或免疫荧光染色后步骤4.9。
5. 组织均质化
- 解冻含有冰上冷冻组织样本的管子。
- 称量100毫克纸巾，并将其放入含有无菌钢珠和500 μL的RIPA缓冲液的2 mL中，该缓冲液含有0.5 M EDTA（pH = 8.0）、1 M Tris-HCl（pH = 8.0）、5 M NaCl、10%SDS和蛋白酶鸡尾酒抑制剂片剂。
- 在室温 （RT） 下使用均匀器在 20 周期/s 下破坏组织 2 分钟，然后等待 1 分钟，然后 20 个周期/秒中断 2 分钟。
- 在 RT 时，在高速（17，900 x g）处将管离心 10 分钟。
- 将上清液（500 μL）收集到新管中，并将其储存在-20°C，直到执行ELISA和qPCR，分别量化炎症标记和病毒载量。
注：对于qPCR，用无RNase材料（即珠子、管等）收集所有样品，用含有1%βmercapto乙醇的RNA乳液缓冲液破坏组织（材料表）。
6. 冷冻DRG部分的制备和免疫荧光染色
- 组织处理
- 在 RT 时将解剖和清洁的 DRG 固定在 1% 甲醛 （PFA） 中 2 小时。
- 将组织转移到15 mL管与10%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
- 将组织转移到15 mL管与20%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
- 将组织转移到15 mL管与30%蔗糖在PBS。在4°C孵育过夜。
- 在 OCT 中嵌入组织，使用低温，并将块放置在干冰中，以便快速冻结。
- 将样品存放在-80°C，直到使用。
- 冷冻科制备
- 从-80°C中取出冷冻块，使其在低温室温度中平衡30分钟。
- 以 15 μm 的厚度对 DRG 进行冷冻，并将部分安装到滑轨上。
- 使用笔在滑动式组织周围绘制疏水圈。
- 将幻灯片保持在 4°C，直到染色。
- 免疫荧光染色
- 在 RT 中将 DRG 部分 3x 洗涤 10 分钟。
- 在37°C下，用100μL的所需原抗体（例如，小鼠抗体对PRV糖蛋白B）孵育1小时。稀释含有10%阴性山羊血清的PBS中的主要抗体。
- 重复步骤 6.3.1。
- 在37°C下，用100μL的所需二次抗体（山羊抗小鼠Alexa Fluor 488）孵育部分50分钟。仅在 PBS 中稀释二次抗体。
- 在PBS中稀释的100μLDAPI（4°，6-二胺酰胺-2-苯胺醇）染料稀释到该部分。在37°C下进一步孵育样品10分钟。
- 重复步骤 6.3.1。
- 使用荧光安装介质将样品安装到玻璃滑轨上，并用盖玻片固定和盖板。
7. 石蜡嵌入组织部分的制备和H&E染色
- 在4°C下将组织固定在10%形式内，24小时。
- 执行固定组织的石蜡嵌入和切片的标准处理计划。将固定组织转移到70%乙醇，并通过升级的酒精加工到二甲苯，然后石蜡，如前所述8。
注：使用聚酯海绵将小组织样本（如 DRG）保存在盒式磁带内。 - 执行标准去石蜡化，然后进行组织部分的 H&E 染色，如前所述9。
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Representative Results
小鼠脚垫接种模型允许对体内αherpes病毒感染的免疫发病机制进行表征，包括将感染从接种的脚垫复制和扩散到神经系统，以及诱导特定的神经炎症反应。
在这项研究中，我们首先对鼠标后脚垫进行了磨蚀，或者用PRV（PRV-Becker）的毒性菌株对磨损区域进行模拟接种或接种。在控制脚垫中可以看到磨损部位。作为愈合过程的一部分，在磨损部位形成地壳（图1，黑色箭头）。相比之下，接种PRV的小鼠在人道终点（82 hpi）处出现严重炎症，其特征是脚垫肿胀和发红。
在用毒性PRV-Becker菌株接种脚垫后，小鼠开始出现72 hpi的临床症状，其特点是接种的脚垫肿胀和越来越频繁的震颤。到82 hpi，PRV-Becker感染小鼠在接种过的腿部出现持续震颤和明显的PRV症状，包括剧烈的划伤和脚的咬。脚垫中也观察到严重炎症。然后进一步特征了PRV感染期间引起的炎症反应，包括免疫细胞渗透到组织中。
对几个组织进行了组织病理学检查，包括接种的足垫和DRG，然后是石蜡嵌入组织部分的H&E染色。在受PRV感染的脚部观察到皮皮坏死和严重皮肤炎症（水肿和纤维蛋白）（图2A，面板b）。受感染小鼠的表皮、真皮和结缔组织显示，中性粒细胞（由多叶核识别）大量渗透，并标有黑色箭头。控制鼠标的脚垫是正常的（图2A，面板a）。受PRV感染的DRG在受感染小鼠中表现出最小的神经元坏死和混合炎症，而对照小鼠的DRG正常（图2B，面板a和b）。混合炎症渗透主要由嗜中性粒细胞和淋巴细胞组成。
其次，建立了PRV脚垫接种后小鼠组织中炎症细胞因子产生的动力学。从从对照小鼠和受PRV感染的小鼠收集并均质的几种组织中量化了特定炎症细胞因子的水平（即白细胞介-6[IL-6]和粒细胞-聚粒体-聚位刺激因子[G-CSF]）。结果显示，与7 hpi和82 hpi的对照组相比，脚垫和DRG中的G-CSF水平显著增加（图3A）。与对照组相比，在感染PRV小鼠的脊髓、大脑、心脏和肝脏组织中观察到82 hpi的G-CSF水平。此外，与24 hpi开始的对照组相比，在受PRV感染小鼠的所有组织中检测到明显的IL-6水平（图3B）。
脚垫接种模型进一步用于研究PRV复制，并从接种的脚垫传播到PNS和CNS，以及神经炎反应发展的潜在相关性。通过qPCR在多个均质组织中量化PRV载荷，以放大PRV DNA。DNA浓度随后转化为PFU，如先前所述的10。在脚垫中检测到 PRV 载荷，起始速度为 24 hpi（+1 x 104 PFU/mg 组织），在 DRG 中，从 60 hpi 开始（+1 x 103 PFU/mg 组织;未显示数据）。
在垂死状态（82 hpi）中，在足垫、DRG、脊髓和大脑中检测到PRV，DRG中PRV浓度最高（+1 x 105 PFU/mg组织）;图4。DRG的PRV感染通过DRG冷冻科的间接免疫荧光染色得到确认。使用抗PRV gB抗体在DRG神经元中检测到PRV感染。PRV糖蛋白gB在受感染细胞质感染的晚期表达。正如预期的那样，在受感染的DRG中确认了PRV gB（绿色）的细胞质表达，而对照样本中没有gB（图5）。细胞核被识别与DAPI染色（蓝色）。
图1：PRV接种后鼠标右后爪的代表性图像。老鼠要么在磨过的右后脚垫中用PRV进行模拟接种，要么用PRV接种。PRV 接种的脚垫显示炎症的迹象，包括发红和肿胀在人道终点 （82 hpi）.控制小鼠的脚垫看起来正常，在磨损部位有一个深红色的结壳，表明伤口正在愈合。黑色箭头表示磨损部位。此图已由上一出版物11修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：PRV脚垫接种后脚垫和DRG中组织病理学的发现。Hematoxylin 和 eosin （H&E） 染色 （A） 小鼠接种的脚印和 （B） 和 ipsi边 DRG 从控制 （面板 a） 和 PRV 感染 （面板 b） 小鼠在 82 hpi.在PRV感染组织（表皮和神经元坏死和中性粒细胞渗透）中观察到的病理学表现在所有被检查的模拟感染小鼠中都不存在。结果代表给定类型的组织的三种生物复制。黑色箭头表示免疫细胞渗透的炎症代表区域。每张图片都标出刻度条 （50 μm）。这个数字从11修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：PRV脚垫接种后，同质小鼠组织中炎症细胞因子产生的动力学。（A） G-CSF 和 （B） IL-6 蛋白水平检测在 PRV 感染 （红色） 和控制 （黑色） 小鼠均质组织在不同的 hpi.蛋白质水平由ELISA量化，并表示为每毫克同质组织（n = 每组5，[p < 0.05，ns = 不显著）的皮量图（pg）。这个数字是从以前的出版物12修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：小鼠同质化组织中PRV基因组的定量化。使用PRV UL54底漆的qPCR在均质小鼠组织中定量PRV DNA。PRV 载荷表示为每毫克组织斑块形成单位 （PFU）。PRV DNA 仅在足部、DRG、脊髓和大脑（而不是其他组织）中检测到，n = 每组 10。虚线显示检测限制。此图已由上一出版物11修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：通过免疫荧光染色对DRG神经元PRV感染的评估。使用PRV gB（绿色）特有的小鼠抗体染色后，模拟和PRV感染DRG神经元的共聚焦Z堆栈图像。细胞核被DAPI（蓝色，面板a和c）染色。面板 d 显示了几个受 PRV 感染的神经元，表示 gB（白色箭头）。在控制 DRG 部分（面板 b）中未检测到 gB 表达式。每张图片都标出刻度条 （50 μm）。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
此处描述的脚垫接种模型有助于调查在αherpes病毒感染期间神经炎反应的启动和发展。此外，这个体内模型用于建立从PNS到CNS复制和传播的αherpes病毒的动力学。这是其他接种模型的替代，如侧翼皮肤接种模型，它依赖于深皮肤划痕13，或颅内路线，直接将病毒引入CNS 14，15，16。14,15,16因此，使用脚垫模型，可以获得更详细的评估病毒动力学复制和传播与相关的局部和遥远的免疫病理过程在神经系统11，12。11,
在此协议中，脚垫的磨损和随后的病毒接种是关键步骤。事实上，在充分磨损后，需要完全切除地层角膜，以便将地层包膜暴露给病毒性宫内膜，以成功感染。然而，磨损必须是温和的，而不是诱导出血，因为这有助于防止血液循环的感染。分离的地层角膜可以在光显微镜下通过H&E染色来可视化。在地层角膜中的角膜是缺乏核的扁平的嗜酸性细胞。病毒内库（20 μL液滴）的体积经过优化，以确保液滴留在脚垫上并覆盖磨损部位。轻轻将无毛液滴擦到磨损的脚垫上，对于有效的病毒渗透至关重要。建议等到脚垫完全干燥以停止麻醉，并将动物放入新的笼子。此步骤将避免鼠标舔掉被磨破了脚垫的病毒。建议一次处理最多三只小鼠，使用鼻锥，将它们同时暴露在麻醉中。
执行小鼠解剖时，必须将切口平行于椎骨柱，以防止脊髓和相关 DRG 受损。还建议去除尽可能多的脂肪，肌肉和软组织，以减少意外切割到脊柱，并促进更好地抓住柱段与钳子之前削减中线。
还建议在圆盘之间对椎骨柱进行横向切割，以便生成清洁的柱段并限制损坏 DRG 对的风险。必须完全去除脊髓周围的脑膜和覆盖DRG，以方便DRG的识别和提取。DRG 应小心地从脊柱上取出，而不会受到钳子的伤害。DRG 在 H&E 和免疫荧光染色方面保持完整非常重要。定时对于这种体内实验的效率至关重要，小鼠解剖和脊髓/DRG提取应连续进行，以便收集尽可能新鲜的组织。
此处描述的组织均质化方法经过优化，以确保有效破坏大量异质组织样本。标准化所使用的组织量至关重要，这允许直接比较样品之间的ELISA和qPCR结果。例如，建议为每个均质化过程称量100毫克的组织。每个组织样本必须全部均质化，剩物不应冻结解冻。在使用前高压钢珠和钳子非常重要，以避免在均匀化过程中受到任何污染。500 μL 的体积是确保 100 mg 组织样本完全均质的最佳值。需要注意的是，此有限卷只允许处理每个样本的 3 到 4 个 ELISA 套件。
使用脚垫接种模型，证明小鼠的PRV感染会引起严重的炎症，其特点是脚垫和DRG中嗜中性粒细胞渗透。使用ELISA的许多同质组织中也检测到高浓度的炎症细胞因子G-CSF和IL-6。此外，在DRG中的PRV基因和蛋白质表达（通过qPCR和IF染色）与两种亲炎细胞因子的产生之间，也发现了很强的相关性。
该模型适用于比较不同αherpes病毒感染之间的病毒复制/传播以及神经炎反应的动力学。例如，关于VZV，宿主特异性的限制和缺乏临床疾病限制了动物模型17的使用。因此，小鼠脚垫PRV接种模型可能代表一种新的动物模型，用于研究负责后疱疹病变患者神经病变的细胞和分子机制。基于VZV和PRV在临床体征、发病机制和基因组方面的相似性，相信这种小鼠模型将增进对VZV发病机制的理解，并导致创新治疗策略的发展。
最后，该模型将指导对周围神经病变的研究，如多发性硬化症和相关的病毒引起的PNS18损伤。已知感染PNS的几种神经病毒（即狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒）的发病机制也可使用该模型19、20、21、2220,21,22进行研究。19脚垫接种模型可用作药物开发可能具有成本效益的工具。例如，它可以作为一个平台来筛选和测试抗炎和抗病毒药物的疗效，旨在预防病毒引起的周围神经病变。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认查尔斯河实验室的出色技术支持，执行组织病理学分析。这项工作由国家神经疾病和中风研究所（RO1 NS033506和RO1 NS060699）资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
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