Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA’yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.
Genom üzerindeki spesifik protein-DNA etkileşimlerinin tanımlanması gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Kromatin immünorektasyon, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, DNA bağlayıcı proteinlerin genom çapındaki bağlayıcı konumlarını tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, sonicated DNA parçalarının ve spesifik olmayan arka plan DNA’larının uzunluğundaki heterojenliği ile sınırlıdır ve bu da düşük haritalama çözünürlüğü ve DNA bağlayıcı bölgelerde belirsizlik ile sonuçlanır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ChIP’nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, heterojen olarak boyutlandırılmış immün önyüklenmiş DNA’yı protein-DNA çapraz bağlantı bölgesine kırpmak için 5 ila 3′ exonuclease sindirimini kullanır. Exonuclease tedavisi spesifik olmayan arka plan DNA’larını da ortadan kaldırır. Kütüphane tarafından hazırlanan ve exonuclease sindirilen DNA, yüksek verimli sıralama için gönderilebilir. ChIP-exo yöntemi, daha fazla algılama hassasiyeti ve azaltılmış arka plan sinyali ile neredeyse taban çifti eşleme çözünürlüğü sağlar. Memeli hücreleri ve yeni nesil dizileme için optimize edilmiş bir ChIP-exo protokolü aşağıda açıklanmıştır.
Protein-DNA etkileşimlerinin yerleri gen düzenleme mekanizmaları hakkında fikir sağlar. Kromatin immünorepitasyonu, yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştiğinde, canlı hücrelerde genom çapındaki protein-DNA etkileşimlerini incelemek için on yıldır1,2. Bununla birlikte, ChIP-seq yöntemi, düşük haritalama çözünürlüğüne, yanlış pozitiflere, cevapsız çağrılara ve spesifik olmayan arka plan sinyaline yol açan DNA parçalanması ve ilişkisiz DNA kirlenmesinde heterojenlik ile sınırlıdır. ChIP’nin exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ile kombinasyonu, ChIP DNA’sını protein-DNA çapraz bağlantı noktalarına kırparak, taban çifti çözünürlüğü ve düşük arka plan sinyali 3 ,4,5sağlayarak ChIP-seq yönteminde gelişir. ChIP-exo tarafından sağlanan büyük ölçüde geliştirilmiş haritalama çözünürlüğü ve düşük arka plan, genom genelinde doğru ve kapsamlı protein-DNA bağlama konumlarının belirlenmesini sağlar. ChIP-exo, fonksiyonel olarak farklı DNA bağlayıcı motifleri, transkripsiyon faktörleri (TF) arasındaki işbirliği etkileşimlerini ve belirli bir genomik bağlama konumundaki çoklu protein-DNA çapraz bağlantı alanlarını ortaya çıkarabilir, diğer genomik haritalamayöntemleriyletespit edilemez 3,4,6,7.
ChIP-exo başlangıçta tomurcuklanan mayada TF’lerin diziye özgü DNA bağlamasını incelemek, transkripsiyon öncesi başlatma kompleksinin kesin organizasyonunu ve genom4,8,9boyunca bireysel histonların nükleozomal yapısını incelemek için kullanılmıştır. 2011 yılında piyasaya sürülmesinden bu yana4, ChIP-exo, bakteriler, fareler ve insan hücreleri 7 , 10 , 11 ,12,13,14,15,16,17dahil olmak üzere diğer birçok organizmada başarıyla kullanılmıştır. 2016 yılında Rhee ve ark.14, başka bir programlama TF Isl1 ile heterodimer kompleksi oluşturan TF Lhx3 programlamasının küçültülmesi sonrasında nöronal gen ekspresyonunun nasıl sürdürüldüğünü anlamak için ilk kez memeli nöronlarında ChIP-exo kullandı. Bu çalışma, Lhx3’ün yokluğunda, Isl1’in nöronal efektör genlerin gen ekspresyonunun sürdürülmesi için Onecut1 TF’ye bağlı yeni nöronal arttırıcılara işe alındığını göstermiştir. Bu çalışmada ChIP-exo, birden fazla TF’nin hücre tiplerini ve hücre aşamasına özgü DNA düzenleyici elementleri neredeyse nükleotid haritalama çözünürlüğünde kombinatoryal bir şekilde nasıl dinamik olarak tanıdığını ortaya koydu. Diğer çalışmalar ayrıca diğer memeli hücre hatlarındaki proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi anlamak için ChIP-exo yöntemini kullandı. Han ve ark.7, ChIP-exo kullanarak fare eritroid hücrelerinde GATA1 ve TAL1 TF’lerin genom çapındaki organizasyonunu incelemek için ChIP-exo’yu kullandı. Bu çalışma, TAL1’in eritroid farklılaşması boyunca GATA1 ile protein-protein etkileşimleri yoluyla dolaylı olarak değil, doğrudan DNA’ya işe alındığı bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca, insan hücre hatlarındaki epigenomik ve transkripsiyonel mekanizmaları incelemek için CTCF, RNA Polymerase II ve histone izlerinin genom çapındaki bağlama konumlarının profilini çıkarmak için ChIP-exo’yu kullanmıştır18,19.
ChIP-exo protokolünün çeşitli sürümleri vardır3,5,20. Ancak, bu ChIP-exo protokollerini, yeni nesil sıralama kütüphanesi hazırlığına aşina olmayan araştırmalar için takip etmek zordur. ChIP-exo protokolünün mükemmel bir sürümü, takip edilmesi kolay talimatlar ve bir video21ile yayınlandı, ancak tamamlanması için önemli miktarda zaman gerektiren birçok enzymatic adım içeriyordu. Burada chip-exo protokolünün yeni bir sürümünü bildiriyoruz azaltılmış enzymatic adımlar ve kuluçka süreleri ve her enzymatic adım21için açıklamalar . Uç onarımı ve dA-tailing reaksiyonları, uç hazırlık enzimi kullanılarak tek bir adımda birleştirilir. Dizin ve evrensel bağdaştırıcı ligasyon adımları için kuluçka süreleri, ligasyon arttırıcı kullanılarak 2 h’den 15 dakikaya düşürülür. Önceki ChIP-exo protokolünde açıklanan dizin bağdaştırıcısı ligasyon adımından sonraki kinaz reaksiyonu kaldırılır. Bunun yerine, lambda exonuclease sindirim adımı için kullanılacak olan indeks adaptörünün 5′ uçlarından birine(Tablo 1)oligo DNA sentezi sırasında bir fosfat grubu eklenir. Önceki ChIP-exo protokolü, tek iplikli DNA kirleticilerini ortadan kaldırmak için RecJf exonuclease sindirimi kullanırken, bu sindirim adımı chIP-exo kütüphanesinin kalitesi için kritik olmadığı için burada kaldırılır. Ek olarak, ChIP işleminden sonra ters çapraz bağlı DNA’yı arındırmak için fenol:kloroform:izoamil alkol (PCIA) ekstraksiyon yöntemi yerine manyetik boncuk temizleme yöntemi kullanılır. Bu, DNA ekstraksiyonunun kuluçka süresini azaltır. Daha da önemlisi, dizin bağdaştırıcısı ligasyonu sırasında oluşan bağdaştırıcı solukluklarının çoğunu kaldırır ve bu da ligasyon aracılı PCR’nin verimliliğini etkileyebilir.
Burada sunulan ChIP-exo protokolü, fare embriyonik sapı (ES) hücrelerinden farklılaştırılmış memeli nöronlarında kesin protein-DNA etkileşimlerinin tespiti için optimize edilmiştir. Kısaca, hasat edilen ve çapraz bağlı nöronal hücreler, kromatin sonikasyona maruz kalmasını sağlamak için yutulur, daha sonra uygun boyutta DNA parçaları elde edilecek şekilde sonicated (Şekil 1). Antikor kaplı boncuklar daha sonra parçalanmış, çözünür kromatinleri ilgi proteinine seçici olarak immün önseçimli hale getirmek için kullanılır. İmmün olarak kesinleşmemiş DNA hala boncuklardayken, son onarım, dizileme adaptörlerinin ligasyonu, dolgu reaksiyonu ve 5′ ila 3′ lambda exonuclease sindirim adımları gerçekleştirilir. Exonuclease sindirim adımı, ChIP-exo’ya ultra yüksek çözünürlüğünü ve yüksek sinyal-gürültü oranını veren şeydir. Lambda exonuclease, immün önyüklenmiş DNA’yı çapraz bağlama bölgesinden birkaç baz çifti (bp) keser, böylece kontamine DNA’nın bozulmasına neden olur. Exonuclease ile tedavi edilen ChIP DNA’sı antikor kaplı boncuklardan elde edilir, protein-DNA çapraz bağlantıları tersine çevrilir ve proteinler bozulur. DNA çıkarılır ve tek iplikli ChIP DNA’sına denatüre edilir, ardından çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için astar tavlama ve uzatma yapılır. Daha sonra, evrensel bir bağdaştırıcının exonuclease ile işlenmiş uçlara ligasyonu gerçekleştirilir. Elde edilen DNA saflaştırılır, daha sonra PCR yükseltilir, jel arındırılır ve yeni nesil sıralamaya tabi tutulur.
ChIP-exo protokolü ChIP-seq protokolünden daha uzundur, ancak teknik olarak çok zor değildir. Başarılı bir şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış herhangi bir ChIP DNA’sı, birkaç ek enzymatik adımla ChIP-exo’ya tabi tutulabilir. ChIP-exo’nun ultra yüksek haritalama çözünürlüğü, azaltılmış arka plan sinyali ve genomik bağlama alanlarıyla ilgili yanlış pozitif ve negatiflerin azalması gibi önemli avantajları zaman maliyetinden daha ağır basmaktadır.
Bu protokolde ChIP ve ardından exonuclease sindirimi, memeli hücrelerindeki protein-DNA etkileşimlerinin ultra yüksek haritalama çözünürlüğünde tanımlanması için DNA kütüphaneleri elde etmek için kullanılır. Birçok değişken ChIP-exo deneyinin kalitesine katkıda bulunur. Kritik deneysel parametreler antikorların kalitesini, sonication optimizasyonunu ve LM-PCR döngülerinin sayısını içerir. Bu kritik deneysel parametreler aynı zamanda ChIP-exo deneylerini sınırlayabilir ve aşağıda tartı…
The authors have nothing to disclose.
Yayınlanmamış verileri ve değerli tartışmaları paylaştığı için Rhee laboratuvarı üyesine teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) hibe RGPIN-2018-06404 (H.R.) tarafından desteklendi.
Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |