Summary
ومن المهم تحديد المواقع التي تربط البروتينات عبر الجينوم بدقة لفهم تنظيم الجينات. هنا نصف طريقة رسم الخرائط الجينومية التي تعالج الحمض النووي المنامونة مناعية الكروماتين مع الهضم exonuclease (ChIP-exo) تليها تسلسل عالية الإنتاجية. هذه الطريقة بالكشف عن البروتين والحمض النووي التفاعلات مع قرب قاعدة زوج قرار رسم الخرائط وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الخلايا العصبية الثديية.
Abstract
تحديد تفاعلات محددة البروتين والحمض النووي على الجينوم مهم لفهم تنظيم الجينات. يستخدم على نطاق واسع Chromatin المناعية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (ChIP-seq) لتحديد مواقع الربط على نطاق الجينوم من البروتينات التي تُربط الحمض النووي. ومع ذلك، فإن أسلوب ChIP-seq محدود من خلال عدم تجانسه في طول شظايا الحمض النووي سونيكاتيد والحمض النووي الخلفية غير محددة، مما يؤدي إلى انخفاض دقة رسم الخرائط وعدم اليقين في مواقع ربط الحمض النووي. للتغلب على هذه القيود ، فإن الجمع بين ChIP مع الهضم exonuclease (ChIP -exo) يستخدم 5 'إلى 3' هضم exonuclease لتقليم الحمض النووي غير المتجانسة الحجم المناعي إلى موقع الربط عبر الحمض النووي البروتين. العلاج exonuclease يزيل أيضا الحمض النووي الخلفية غير محددة. ويمكن إرسال الحمض النووي المعد للمكتبة والمهضم من قبل المكتبات لتسلسل عالي الإنتاجية. يسمح أسلوب ChIP-exo بدقة تعيين زوج قاعدة قريبة مع حساسية الكشف أكبر وإشارة خلفية مخفضة. ويرد أدناه وصف لبروتوكول ChIP-exo الأمثل لخلايا الثدييات وتسلسل الجيل التالي.
Introduction
توفر مواقع تفاعلات البروتين والحمض النووي نظرة ثاقبة على آليات تنظيم الجينات. وقد استخدمت كروماتين المناعي إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (ChIP-eq) لعقد من الزمن لدراسة التفاعلات على نطاق الجينوم البروتين والحمض النووي في الخلايا الحية1,2. ومع ذلك، فإن طريقة ChIP-seq محدودة بسبب التغايرية في تجزئة الحمض النووي وتلوث الحمض النووي غير المقيد الذي يؤدي إلى دقة رسم خرائط منخفضة، وإيجابيات كاذبة، ومكالمات لم يتم الحصول عليها، وإشارة خلفية غير محددة. مزيج من ChIP مع الهضم exonuclease (ChIP-exo) يحسن على طريقة ChIP-seq عن طريق تقليم الحمض النووي ChIP إلى نقاط الربط بين البروتين والحمض النووي، وتوفير قرب قاعدة القرار زوج وإشارة خلفية منخفضة3،4،5. قرار رسم الخرائط المحسن بشكل كبير والخلفية المنخفضة التي يوفرها ChIP-exo تسمح بتحديد مواقع ربط البروتين والحمض النووي الدقيقة والشاملة عبر الجينوم. ChIP-exo قادرة على الكشف عن زخارف متميزة وظيفيا الحمض النووي ملزمة، والتفاعلات التعاونية بين عوامل النسخ (TF)، ومتعددة مواقع ربط البروتين والحمض النووي في موقع معين ملزم الجينوم، لا يمكن الكشف عنها من قبل طرق أخرى لرسم الخرائط الجينومية3،4،6،7.
تم استخدام ChIP-exo في البداية في الخميرة الناشئة لفحص ربط الحمض النووي للتسلسل المحدد من TFs ، لدراسة التنظيم الدقيق لمجمع النسخ قبل البدء ، وبنية النوية الفرعية للستونات الفردية عبر الجينوم4،8،9. منذ إدخالها في 20114، تم استخدام ChIP-exo بنجاح في العديد من الكائنات الحية الأخرى بما في ذلك البكتيريا والفئران والخلايا البشرية7،10،11،12،13،14،15،16،17. في عام 2016 ، استخدم Rhee etal. 14 ChIP-exo في الخلايا العصبية الثديية لأول مرة لفهم كيفية الحفاظ على التعبير الجيني العصبي بعد التنظيم الهابط للبرمجة TF Lhx3 ، والتي تشكل مجمع heterodimer مع برمجة أخرى TF Isl1. وأظهرت هذه الدراسة أنه في غياب Lhx3، Isl1 يتم تجنيدها إلى معززات الخلايا العصبية الجديدة ملزمة Onecut1 TF للحفاظ على التعبير الجيني للجينات أثر الخلايا العصبية. في هذه الدراسة، كشف ChIP-exo كيف أن العديد من TFs تتعرف بشكل حيوي على نوع الخلية والعناصر التنظيمية للحمض النووي الخاصة بالمرحلة الخاصة بالخلايا بطريقة الجمع بين النوكليوتيدات القريبة من دقة رسم الخرائط. واستخدمت دراسات أخرى أيضا طريقة ChIP-exo لفهم التفاعل بين البروتينات والحمض النووي في خطوط خلايا الثدييات الأخرى. استخدم Han etal. 7 ChIP-exo لفحص تنظيم على نطاق الجينوم لـ GATA1 و TAL1 TFs في خلايا erythroid الماوس باستخدام ChIP-exo. وجدت هذه الدراسة أن TAL1 يتم تجنيده مباشرة إلى الحمض النووي بدلا من غير مباشر من خلال التفاعلات البروتين البروتينية مع GATA1 في جميع أنحاء التمايز erythroid. كما استخدمت الدراسات الحديثة ChIP-exo لتحديد مواقع الربط على نطاق الجينوم من مركز الـ CTCF، RNA Polymerase II، وعلامات Histone لدراسة الآليات الجينومية والنسخية في خطوط الخلايا البشرية18،19.
هناك عدة إصدارات من بروتوكول ChIP-exo متاح3،5،20. ومع ذلك، هذه البروتوكولات ChIP-exo يصعب متابعة للأبحاث الذين ليسوا على دراية إعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي. تم نشر نسخة ممتازة من بروتوكول ChIP-exo مع تعليمات سهلة المتابعة والفيديو21، ولكنها تضمنت العديد من الخطوات الأنزيمية التي تتطلب قدرا كبيرا من الوقت لإكمال. هنا نقوم بالإبلاغ عن نسخة جديدة من بروتوكول ChIP-exo يحتوي على خطوات انزيمية مخفضة وأوقات حضانة، وتفسيرات لكل خطوة انزيمية21. يتم الجمع بين إصلاح نهاية وdA-الذيل التفاعلات في خطوة واحدة باستخدام نهاية الإنزيم الإعدادية. يتم تقليل أوقات الحضانة لمؤشر والخطوات الربط محول عالمي من 2 ساعة إلى 15 دقيقة باستخدام محسن الربط. يتم إزالة رد فعل kinase بعد الخطوة ربط محول الفهرس الموضحة في بروتوكول ChIP-exo السابقة. بدلا من ذلك، يتم إضافة مجموعة الفوسفات أثناء تخليق الحمض النووي القلوي إلى واحدة من 5 'نهايات من محول مؤشر (الجدول 1) ، والتي سوف تستخدم لخطوة الهضم exonuclease لامدا. في حين أن بروتوكول ChIP-exo السابق استخدم هضم RecJf exonuclease للقضاء على ملوثات الحمض النووي التي تقطعت بها السبل واحدة ، تتم إزالة خطوة الهضم هذه هنا لأنها ليست حاسمة لجودة مكتبة ChIP-exo. وبالإضافة إلى ذلك، لتنقية الحمض النووي العكسي crosslinked بعد elution ChIP، يتم استخدام طريقة تنقية الخرز المغناطيسي بدلا من طريقة استخراج الفينول: الكلوروفورم:ايساميل الكحول (PCIA). وهذا يقلل من وقت حضانة استخراج الحمض النووي. الأهم من ذلك، فإنه يزيل غالبية خافمات محول شكلت أثناء ربط محول مؤشر، والتي قد تؤثر على كفاءة PCR بوساطة الربط.
تم تحسين بروتوكول ChIP-exo المعروض هنا للكشف عن تفاعلات دقيقة للبروتين والحمض النووي في الخلايا العصبية الثديية المتمايزة عن خلايا الجذع الجنينية الفأر (ES). لفترة وجيزة، يتم حصادها والخلايا العصبية crosslinked lysed، للسماح chromatin أن يتعرض ل sonication، ثم سونيكاتيد بحيث يتم الحصول على شظايا الحمض النووي الحجم المناسب (الشكل 1). ثم يتم استخدام الخرز المغلفة بالأجسام المضادة للتشخيط المناعي بشكل انتقائي مجزأ ، الكروماتين القابل للذوبان إلى البروتين الذي يثير الاهتمام. في حين أن الحمض النووي المناعي لا يزال على الخرز ، يتم تنفيذ الإصلاح النهائي ، وربط محولات التسلسل ، رد فعل التعبئة و 5 ' إلى 3 ' لامدا خطوات الهضم exonuclease. خطوة الهضم exonuclease هو ما يعطي ChIP-exo لها دقة عالية جدا وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لامدا exonuclease تقليم الحمض النووي المناعي عدد قليل من أزواج قاعدة (bp) من موقع crosslinking، مما تسبب في تحلل الحمض النووي الملوث. يتم استخلاص الحمض النووي ChIP المعالج من الخرز المغلف بالأجسام المضادة ، ويتم عكس الروابط المتقاطعة بين البروتين والحمض النووي ، ويتم تحلل البروتينات. يتم استخراج الحمض النووي وتحريفه إلى الحمض النووي ChIP الذي تقطعت به السبل، يليه الوَحن التمهيدي والامتداد لصنع الحمض النووي المزدوج (DsDNA). بعد ذلك، يتم تنفيذ ربط محول عالمي إلى نهايات المعالجة exonuclease. يتم تنقية الحمض النووي الناتج، ثم تضخيم PCR، هلام تنقية، وتخضع لتسلسل الجيل القادم.
بروتوكول ChIP-exo أطول من بروتوكول ChIP-seq، ولكن لا يشكل تحدياً تقنياً للغاية. يمكن إخضاع أي الحمض النووي ChIP المثبط المناعي بنجاح لـ ChIP-exo ، مع العديد من الخطوات الأنزيمية الإضافية. المزايا البارزة لـ ChIP-exo، مثل دقة رسم الخرائط العالية للغاية، وإشارة الخلفية المنخفضة، وانخفاض الإيجابيات والسلبيات الكاذبة، فيما يتعلق بمواقع الربط الجينومي، تفوق التكلفة الزمنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: ينصح بالماء المقطر أوتومكسيد و deionized (ddH2O) لصنع المخازن المؤقتة وخلطات رد الفعل الرئيسية. تصف الأقسام 1-4 تحلل الخلايا و sonication، وتصف الأقسام 5−7 التحلل المناعي للكروماتين (ChIP)، وتصف الأقسام 8−11 التفاعلات الأنزيمية على الخرز، ويصف القسمان 12 و13 elution ChIP وتنقية الحمض النووي، وتصف الأقسام 14-19 إعداد المكتبة.
1- حصاد الخلايا وتقاطعها
- بعد التمييز بين الخلايا ES الماوس في الخلايا العصبية ما بعد الديمومتوية، إضافة 11٪ الفورمالديهايد إلى الخلايا المحصودة إلى تركيز نهائي من 1٪ (v/v). الخلايا الصخرية على منصة هزازة (الروك، شاكر، أو الدوار) لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 درجة مئوية).
ملاحظة: اعتمادا على البروتين المستهدف أن تكون عبر الربط، أقل الفورمالديهايد الربط (على سبيل المثال، تركيز النهائي من 0.5٪) أو مزدوجة crossing مع disuccinimidyl الجلواتات (DSG) يمكن استخدامها. - أضف 2.5 م الجليسين إلى تركيز نهائي من 150 mM لوقف التفاعل عبر. خلايا صخرية على منصة هزاز في RT، لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي الخلايا المتداخلة في أنابيب مخروطية 15 مل في RT، لمدة 6 دقائق، في 1350 x ز. استلهم الحل، ثم إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من 1x الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
ملاحظة: يمكن تخزين كريات الخلايا ذات الصلصال في -80 درجة مئوية بعد تجميد الفلاش مع النيتروجين السائل.
2. خلية تحلل
ملاحظة: الخطوات التالية في هذا البروتوكول لـ 2 x 7 الخلايا العصبية7 2 تقريباً مميزة من الخلايا ES الماوس. لكسر الخلايا المفتوحة، سيتم استخدام مخازن التحلل التي تحتوي على المنظفات المختلفة. إضافة 50 ميكرولتر من 1000x مثبطات protease كاملة (CPI) المخزون إلى 50 مل من المخزن المؤقت فقط قبل الاستخدام.
- إعداد المخازن المؤقتة 1−3 كما هو موضح في الجدول 2.
- ذوبان الكريات خلية عبر الربط على الجليد، ثم الكريات خلية resuspend بدقة في 3 مل من العازلة تحلل 1 في أنابيب مخروطية 15 مل. صخرة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على منصة هزاز. جهاز طرد مركزي عند 1,350 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 °C وpernatate.
- بدقة خلايا بيليت resuspend في 3 مل من تحلل العازلة 2. صخرة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على منصة هزاز. جهاز طرد مركزي عند 1,350 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 °C وpernatate.
- إضافة 1 مل من تحلل العازلة 3 إلى كل بيليه، ثم تبقى على الجليد. المضي قدما على الفور إلى سونيكيشن.
3. سونيكاتينج كروماتين
ملاحظة: إبقاء العينات على الجليد أو في 4 درجة مئوية خلال هذا الإجراء sonication للحد من انعكاس عبر.
- باستخدام ملعقة معقمة، إضافة حبات سونيكيشن(جدول المواد)تصل إلى علامة التخرج 0.2 مل على 15 مل أنابيب البوليسترين. غسل حبات sonication عن طريق دوامة في 600 ميكرولتر من 1X برنامج تلفزيوني حتى لا تكون هناك بقع جافة مرئية. أجهزة الطرد المركزي أنابيب لمدة 5 s في 30 س ز وpirate 1X PBS.
ملاحظة: سونيكيشن في أنابيب البوليسترين هو أكثر كفاءة من سونيكيشن في أنابيب البولي بروبلين. إذا كان عدد أقل من الخلايا (على سبيل المثال، <10 6 الخلايا) هو سونيكاتيد، استخدم 1.5 مل أنابيب البوليسترين دون إضافة حبات sonication. - بدقة resuspend lysates النووية في 1 مل من تحلل العازلة 3 (من الخطوة 2.4)، ثم نقل إلى أنابيب البوليسترين 15 مل التي تحتوي على حبات سونيكيشن. دوامة لفترة وجيزة أنابيب البوليسترين.
- لتجزئة الحمض النووي الكروماتين عبر لينكيد، سونيكات النووية في 4 درجة مئوية لعدد الأمثل من دورات، مع سعة السلطة في 30 W، ودورات sonication تعيين إلى 30 s on/30 s off.
ملاحظة: سوف تحسين سونيكيشن لكل نوع الخلية ودفعة يؤدي إلى أفضل ChIP-exo العائد. بالنسبة لـ 2 × 107 خلايا عصبية ماوس، فإن دورات صوتنة 20-30 في الإعدادات المذكورة سوف تجزئ الكروماتين في نطاق 100−500 بريتيش كلبت. - بعد سونيكيشن كاملة، نقل جميع supernatant (lysates سونيكاتيد)، من كل عينة، إلى 1.5 أنابيب مل. إضافة 10٪ 2-[4-(2,4,4-تريميثيلبنتان-2-yl)phenoxy]الإيثانول) إلى كل عينة بتركيز نهائي من 1٪. مزيج عن طريق الأنابيب.
- إلى بيليه خلية الحطام، عينات الطرد المركزي في 13500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل جميع lysates سونيكاتيد (سوبرناتانت) من كل عينة إلى أنابيب جديدة 1.5 مل.
- اتخاذ 30 μL من lysate سونيكاتيد من كل عينة (~ 3٪ من lysate sonicated) وإضافة إلى أنابيب جديدة 1.5 مل للتحقق من سونيكيشن. تخزين lysates سونيكاتيد المتبقية في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للاحتضان مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة.
4. التحقق من سونيكيشن
- جعل 20 مل من 2x البروتين K العازلة بإضافة 2 مل من 0.5 M تريس-HCl (pH 8.0)، 2 مل من 0.5 M EDTA، 10 مل من 10٪ كبريتات دوديكيل الصوديوم (SDS) و 6 مل من ddH autoclaved2O. لا تقم بإضافة CPI إلى هذا المخزن المؤقت. تخزين في أنبوب 50 مل في RT.
- لعكس وصلة مشتركة البروتين والحمض النووي، عن طريق إزالة البروتينات، واتخاذ 30 ميكرولتر من كروماتين سونيكاتيد من كل عينة (من الخطوة 3.6)، إضافة 166 μL من ddH autoclaved2O، 200 ميكرولتر من 2x بروتين K العازلة و 4 ميكرولتر من 20 ملغ / مل البروتينات K. دوامة لفترة وجيزة العينات، ومن ثم احتضان في 65 درجة مئوية ل1−3 ح في 24 × ز.
- ملاحظة: يمكن أن يكون عكس lysates سونيكاتيد في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- استخراج الحمض النووي باستخدام PCIA (25:24:1) وطريقة هطول الإيثانول على النحو التالي.
تنبيه: PCIA سامة. استخدم تحت غطاء أبخرة مع معدات حماية شخصية قياسية (PPE).- إضافة 400 μL من PCIA لكل عينة في أنابيب 1.5 مل، تعيين دوامة إلى السرعة القصوى وعينات دوامة لمدة 20 s. جهاز طرد مركزي عند 18,400 x ز لمدة 6 دقائق في RT. وسيتم رصد مرحلتين. نقل بعناية الطبقة العليا مائي (مرحلة واضحة) من كل عينة إلى أنابيب جديدة 1.5 مل.
- إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغم / مل RNase A. عينات احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 1 ميكرولتر من 20 ملغم / مل الجليكوجين لكل عينة، ثم تترسب مع 1 مل من الجليد الباردة 100٪ الإيثانول (المخزنة في -20 درجة مئوية الفريزر). مزيج لفترة وجيزة، ثم احتضان العينات في -80 درجة مئوية الفريزر لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. عينات أجهزة الطرد المركزي في 18400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتصب بعناية من الايثانول 100٪.
- غسل الكريات مع 500 ميكرولتر من الجليد الباردة 70٪ الإيثانول (المخزنة في -20 درجة مئوية الفريزر). أجهزة الطرد المركزي عند 18,400 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية. صب بعناية من 70٪ الإيثانول.
- تُنَسِّن العينات في أنابيب 1.5 مل عند 50 درجة مئوية حتى يتبخر الإيثانول المتبقي. الكريات الحمض النووي resuspend في 15 ميكرولتر من ddH2O أو النيوكلاسي خالية منDdH 2O.
- تشغيل عينات الحمض النووي المستخرجة، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي، في هلام agarose 1.5٪ في 120-180 V والتحقق من حجم الحمض النووي سونيكاتيد.
5. حضانة الأجسام المضادة مع الخرز
ملاحظة: الخطوات التالية في هذا البروتوكول لـ 2 x 7 الخلايا العصبية7 2 تقريباً مميزة من الخلايا ES الماوس. لا تجميد وذوبان الخرز المغناطيسي في أي لحظة خلال بروتوكول ChIP-exo كما قد الكراك الخرز تسبب تلوث العينة أو قد يتعرض للخطر أداء الأجسام المضادة.
- بعد تحلل الخلية و sonication، إعداد البروتين G الخرز المغناطيسي(جدول المواد)لChIP، مزيج الخرز المغناطيسي حتى متجانسة، ثم إضافة 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى 2 مل أنابيب البروتين الربط المنخفض.
ملاحظة: نوع الخرز المغناطيسي المستخدم يعتمد على أنواع الأجسام المضادة. - غسل الخرز مع 1 مل من حل حظر (الجدول 2)،اخلط جيدا، ثم ضع على رف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. بينما لا يزال على رف المغناطيسي، وإزالة supernatant مرة واحدة هو واضح.
- إضافة 1 مل من حل حظر إلى الخرز المغناطيسي. أنابيب الصخور لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية على منصة هزاز. تدور لفترة وجيزة، ثم وضع الأنابيب على رف المغناطيسي وإزالة افرنح.
- كرر الخطوة 5.3 مرتين أكثر.
- إضافة 500 μL من حل حظر إلى الخرز المغناطيسي. لفترة وجيزة تدور الأجسام المضادة ضد Isl1 (0.04 ميكروغرام / ميكرولتر، جدول المواد)،ثم إضافة 4 ميكروغرام من الأجسام المضادة إلى المقابلة 2 مل أنابيب البروتين الربط منخفضة التي تحتوي على الخرز المغناطيسي في محلول الحجب.
- كرر الخطوة 5.5 بدون الأجسام المضادة (أي، أي التحكم في الأجسام المضادة لـ ChIP).
ملاحظة: يمكن تحديد كمية الأجسام المضادة التي يجب إضافتها تجريبيًا من خلال مراعاة جودة الجسم المضاد وعدد الخلايا المستخدمة في ChIP. - عينات الصخور في 4 درجة مئوية ل 6−24 ساعة على منصة هزاز.
6. كروماتين المناعي (ChIP)
- غسل حبات المغلفة بالجسم من الخطوة 5.8 مع 1 مل من حظر الحل. ضع العينات على منصة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة 6.1 مرتين أكثر.
- Resuspend المضادة المغلفة بالأجسام الخرز في 50 ميكرولتر من حظر الحل، ثم نقل إلى أنابيب جديدة البروتين 2 مل الربط منخفضة. لكل عينة ChIP، إضافة lysates سونيكات (~ 1.0 مل من الخطوة 3.6) إلى حبات المغلفة المضادة للأجسام في 2 مل أنابيب البروتين الربط المنخفض.
- احتضان كل عينة على منصة هزاز بين عشية وضحاها في 4 °C.
7. ChIP يغسل
ملاحظة: احتفظ بالعينات على الثلج أو عند 4 درجات مئوية للحفاظ على ربط البروتين والحمض النووي أثناء غسل ChIP.
- جعل ارتفاع العازلة غسل الملح، LiCl العازلة غسل و 10 mM تريس-HCl العازلة (درجة ح H 7.4) كما هو موضح في الجدول 3. يخزن في أنابيب 50 مل عند 4 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزون CPI 1000x إلى جميع المخازن المؤقتة قبل الاستخدام.
- تدور عينات لفترة وجيزة في أنابيب الربط المنخفض البروتين 2 مل لجمع السائل من القبعات، ثم وضع على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة فائقة بعناية مع ماصة.
- لغسل ChIP، إضافة 1 مل من تحلل العازلة 3 (في 4 درجة مئوية) إلى كل أنبوب. مزيج على منصة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تدور عينات لفترة وجيزة، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المابسة بالماصة.
- إضافة 1 مل من الباردة عالية غسل الملح العازلة لكل أنبوب. مزيج على منصة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تدور عينات لفترة وجيزة، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المابسة بالماصة.
- إضافة 1 مل من عازلة غسل LiCl الباردة إلى كل أنبوب. مزيج على منصة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تدور عينات لفترة وجيزة، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المابسة بالماصة.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت البارد 10 mM Tris-HCl (7.4 pH) لكل أنبوب. مزيج على منصة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تدور عينات لفترة وجيزة، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المابسة بالماصة.
ملاحظة: يمكن استخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA (8.0 pH) بدلاً من المخزن المؤقت Tris-HCl (7.4 pH). - كرر الخطوات 7.4−7.6 ثلاث مرات.
- نقل حبات عينة مع 500 ميكرولتر من تريس HCl العازلة (pH 7.4) إلى أنابيب 1.5 مل الطازجة. تدور عينات لفترة وجيزة، ثم ضعها على رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المابسة بالماصة.
8. إصلاح نهاية وdA- رد فعل المخلفات على الخرز
ملاحظة: صوتنة غالبا ما يولد غير حادة انتهت dsDNA. مطلوب رد فعل إصلاح نهاية لجعل الحمض النووي غير حادة نهاية قبل رد فعل dA-ذيل متبوعة بخطوة ربط محول مؤشر. للصقة نهاية الحمض النووي مع الحمض النووي محول مؤشر، يضاف dATP إلى نهاية 3 'من حادة، dsDNA جزء من رد فعل dA-ذيل. نهاية مزيج التفاعل الإعدادية يحتوي على dATP.
- بعد غسل ChIP، إضافة 38 ميكرولتر من ddH2O autoclaved إلى الخرز عينة في أنابيب 1.5 مل لإصلاح نهاية وdA-الذيل التفاعل.
- إضافة 5.6 μL من نهاية مزيج رد الفعل الإعدادية و 2.4 μL من نهاية مزيج انزيم الإعدادية(جدول المواد)إلى كل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 46 ميكرولتر). عينات احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخرز كما هو موضح في السابق خطوات غسيل ChIP 7.4−7.6.
9. مؤشر ربط محول على الخرز
ملاحظة: يحتوي محول الفهرس على 6−10 قواعد من تسلسلات الفهرس المفهرس، والتي تكون خاصة بعينة معينة تستخدم في تعدد العينات المتعددة في تسلسل عالي الإنتاجية. يتم وصف تسلسلات الحمض النووي محول الفهرس في الجدول 1.
- بالنسبة لـ ربط محول المؤشر، أضف 27 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) إلى الخرز العينة. إضافة 2 ميكرولتر من 15 μM محول مؤشر، 0.5 ميكرولتر من محسن الربط، و 15 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الرباط(جدول المواد)إلى كل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 44.5 ميكرولتر).
- عينات احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. غسل الخرز كما هو موضح في الخطوات 7.4−7.6.
10. ملء في رد فعل على الخرز
ملاحظة: بعد ربط المحول، لا يوجد أي phosphodiester السندات بين نهاية 5 'من المحول و 3 ' نهاية DNA ChIP. يمكن إصلاح من قبل رد فعل ملء في.
- أضف 47 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد 10 mM Tris-HCl (7.4) إلى حبات العينة.
- جعل مزيج رد فعل ملء في (الجدول 4 وجدول المواد) على الجليد.
- إضافة 11.1 μL من التعبئة في مزيج لكل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 58.1 μL). عينات احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. غسل الخرز كما هو موضح في الخطوات 7.4−7.6.
11. لامبدا exonuclease الهضم على الخرز
- بعد ملء في رد فعل على الخرز، إضافة 50 ميكرولتر من ديتشود الباردة2O إلى حبات العينة.
- لهضم الحمض النووي ChIP في اتجاه 5 'إلى 3'، إضافة 6 ميكرولتر من 10x لامدا العازلة exonuclease و 2 ميكرولتر من 5 U/μL لامدا exonuclease(جدول المواد،إجمالي حجم التفاعل: 58 ميكرولتر). عينات احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. غسل الخرز كما هو موضح في الخطوات 7.4−7.6.
12. Elution وعكس الربط عبر
- جعل المخزن المؤقت elution ChIP كما هو موضح في الجدول 5.
ملاحظة: لا تقم بإضافة CPI إلى مخزن ChIP elution المؤقت. - إلى عينات ChIP elute من الخرز، عينات resuspend في 75 ميكرولتر من العازلة ChIP elution واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 130 × ز.
- إضافة 2.5 μL من 20 ملغ / مل البروتينات K(جدول المواد)إلى العينات. دوامة لفترة وجيزة، ثم احتضان العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
13. استخراج الحمض النووي
- بعد أن تحضن العينات بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية، تدور لفترة وجيزة العينات، مكان على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة، ثم نقل ناظر من كل عينة إلى أنابيب جديدة 1.5 مل.
- إضافة 1 μL من 10 ملغم / مل RNase A إلى العينات. دوامة لفترة وجيزة، ثم احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة ~ 25 ميكرولتر من ddH2O autoclaved إلى حجم يصل إلى 100 ميكرولتر.
- تنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد). الحمض النووي المائل مع 16 ميكرولتر من ddH2O أو ddH خالية من النوى2O.
14. Denaturing ، التمهيدي الصلب وارشاد تمديد
- بعد elution ChIP وعكس crossing، نقل 16 ميكرولتر من عينات الحمض النووي المستخرجة من الخطوة 13.3 إلى أنابيب PCR.
- جعل denaturing واخلط التمهيدي الصلب(الجدول 6 وجدول المواد)على الجليد. إضافة 1.2 μL من denaturing واخلطة الدمج التمهيدي لكل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 17.2 ميكرولتر). تشغيل العينات باستخدام البرنامج الموصوف في الجدول 6 إلى التشويه والتهيّم التمهيدية للـ DNA القالب.
- جعل مزيج تمديد التمهيدي (الجدول 7 وجدول المواد) على الجليد.
- مرة واحدة في البرنامج إلى التشويه والصدر التمهيدية كاملة، إضافة 3 ميكرولتر من مزيج تمديد التمهيدي للعينات (إجمالي حجم التفاعل: 20.2 μL). تشغيل العينات باستخدام البرنامج لتمديد التمهيدي الموضحة في الجدول 7.
- المضي قدما على الفور إلى dA-ذيل التفاعل.
15. dA- ذات المخلفات رد فعل
ملاحظة: بالنسبة لـ ربط الحمض النووي للوثنية مع الحمض النووي للمحول العالمي، يضاف dATP إلى نهاية 3 من الوثنية، dsDNA بواسطة رد فعل dA-tailing.
- جعل dA- المخلفات مزيج (الجدول 8 وجدول المواد) على الجليد.
- إضافة 4.1 μL من مزيج dA-ذيل لكل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 24.3 μL). تشغيل عينات باستخدام البرنامج لdA-ذيل (الجدول 8).
- انتقل فوراً إلى ربط المحول العالمي.
16. الربط محول عالمي
ملاحظة: يتضمن المحول العالمي تسلسلات ذات تسلسل تسلسل عالي الإنتاجية للتعرف على عينة الحمض النووي من أجل تسلسل الكيمياء. يتم وصف تسلسل الحمض النووي محول عالمي في الجدول 1.
- بعد dA-tailing التفاعل، وجعل مزيج الربط محول عالمي(الجدول 9 وجدول المواد)لل ربط محول عالمي.
- إضافة 21.5 ميكرولتر لكل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 45.8 ميكرولتر) وعينات احتضان لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
17. تنظيف الحمض النووي
- تنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد). الحمض النووي المائل مع 21 ميكرولتر من ddH2O أو ddH خالية من النوى2O.
- تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة لأداء PCR بوساطة الربط (LM-PCR) وتنقية PCR.
18 - PCR بوساطة الربط
ملاحظة: يتم وصف تسلسلات التمهيدي LM-PCR في الجدول 1.
- بعد تنظيف الحمض النووي، وجعل LM-PCR مزيج(الجدول 10 وجدول المواد)على الجليد.
- إضافة 29 ميكرولتر من مزيج LM-PCR لكل عينة (إجمالي حجم التفاعل: 50 ميكرولتر) وتشغيل عينات باستخدام البرنامج لLM-PCR(الجدول 10).
- الشروع فورا في تنقية هلام الحمض النووي المكبر PCR، تليها تنقية الحمض النووي لتسلسل عالي الإنتاجية.
19- البصمة الدنا Pللحمض النووي المُضخم LM-PCR
- تشغيل عينات الحمض النووي LM-PCR تضخيم, جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي, في 1.5٪ agarose هلام في 120-180 V والمكوس 200-400 بريتيش بتروليوم العصابات.
- تنقية الحمض النووي من هلام مختات باستخدام مجموعة استخراج هلام (جدول المواد).
- بعد تنقية الحمض النووي، تحقق من التركيز (جدول المواد) لكل عينة مكتبة ChIP-exo. إرسال نماذج لتسلسل عالي الإنتاجية لتسلسل القراءة المفردة.
ملاحظة: طول القراءة المفضل للتسلسل قراءة واحدة هو على الأقل 35 bp، وهو يكفي لمحاذاة بشكل فريد عمليات القراءة تسلسل إلى الجينوم مرجع في الماوس أو الخلايا البشرية. بالنسبة لمعظم عوامل النسخ في الماوس أو الخلايا البشرية، فإن 10-20 مليون قراءة لكل عينة من طراز ChIP-exo كافية لتحديد مواقع الربط الجينومي. هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 30 مليون قراءة لكل عينة لرسم خريطة للمناطق الجينومية المخصبة في علامات هيستون في خلايا الثدييات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 2A يوضح نتائج سونيكيشن بعد تحلل الخلية و sonication، مع دورات مختلفة، من الخلايا العصبية الحركية التي تختلف عن خلايا ES الماوس. العدد الأمثل لدورات سونيكيشن (على سبيل المثال، 12 دورة في الشكل 2A)ولدت كثافة الحمض النووي قوية في 100-400 شظايا الحمض النووي BP. تعتمد مكتبات ChIP-exo عالية الجودة على حجم وكمية الحمض النووي الكروماتين المجزأ. وهكذا، ويوصى الأمثل من سونيكيشن لكل نوع الخلية ودفعة من الخلايا قبل بدء ChIP-exo.
ويبين الشكل 2ب منتجات PCR (LM-PCR) بوساطة الربط من عينات الحمض النووي من نوع ChIP-exo التي تم تضخيمها من خلال 18-21 دورة PCR. LM-PCR تضخيم شظايا الحمض النووي ChIP-exo التي يتم ربطها مع محولات الحمض النووي لتسلسل الجيل القادم. PCR التمهيدي هو جزء من تسلسل محول الحمض النووي. حجم شظايا الحمض النووي سونيكاتيد حوالي 100-400 bp (الشكل 2A). بعد هضم لامدا، سيصبح حجم شظايا الحمض النووي نصف حجم المادة الأولية (50-200 بريتيش كلبي). تم ربط حوالي 125 bp من محولات الحمض النووي إلى شظايا الحمض النووي ChIP-exo وبالتالي، فإن الحجم المتوقع لمنتجات LM-PCR هو 175−325 bp. يتم تنفيذ العدد الأدنى من دورات PCRc بينما لا يزال كافيا لتضخيم مكتبة ChIP-exo، لتجنب الإفراط في تضخيم الحمض النووي CHIP-exo.
هنا، تم تنفيذ ChIP-exo لـ Isl1 في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا ES الماوس. Isl1 هو عامل نسخ البرمجة الخلايا العصبية الحركية, التي أعرب عنها على وجه التحديد في الخلايا العصبية الحركية ما بعد الحركة. تظهر نتائج Isl1 ChIP-exo كميات كبيرة من 200−400 bp LM-PCR تضخيم ChIP-EXO DNA (الشكل 2B). الفرقة حول 100 BP يشير إلى القطع الأثرية PCR من المحولات واBR التمهيدي. تشغيل أي سيطرة على الأجسام المضادة جنبا إلى جنب مع عينة تجريبية مهم أيضا لضمان غير محددة، والحمض النووي الخلفية تم هضمها من قبل العلاج exonuclease لامدا. كمثال, حددنا Isl1 مواقع ملزمة في ماوس الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا ES باستخدام ChIP-exo و ChIP-seq (الشكل 3). كانت إشارة ChIP-exo مركزة للغاية في مواقع الربط Isl1، حيث اكتشفت أنماط ربط عامل نسخ Isl1 متعددة متفاوتة المسافات. عرض إشارة ChIP-seq إشارات أوسع، تشير إلى أن ChIP-exo Isl1 دقة تعيين أعلى من ChIP-seq من Isl1.
الشكل 1: تخطيط بروتوكول ChIP-exo. بعد ChIP (الخطوات 1-7)، فإن تفاعلات الإصلاح النهائي ومخلفات dA تجعل حمض Dna ChIP غير حاد بإضافة مجموعة فوسفات إلى نهاية 5 من الحمض النووي وإضافة dATP إلى نهاية 3 'من الحمض النووي (الخطوة 8). سونيكاتيد ينتهي من الحمض النووي ChIP، على الخرز هي ligated مع محول مؤشر (الخطوة 9). بعد التعبئة في رد فعل، يصبح الحمض النووي محول مع 5 'التراكم غير حادة (الخطوة 10). لامبدا exonuclease يهضم الحمض النووي سونيكاتيد 5 'إلى 3' تصل إلى البروتين (TF) - نقاط الحمض النووي عبر الربط (الخطوة 11). بعد elution، عكس crossing واستخراج الحمض النووي (الخطوتين 12 و 13)، يتم إجراء الحمض النووي الذي تقطعت به السبل واحد مزدوجة تقطعت بهم السبل من قبل مؤشر تمديد التمهيدي PCR (الخطوة 14)، تليها dA-الذيل (الخطوة 15). ثم يتم ربط المحول العالمي إلى نهاية exonuclease-المعالجة (الخطوة 16). يتم تنظيف المكتبة الناتجة، وتضخيم PCR، وتخضع لتسلسل الجيل التالي (الخطوات 17-19). رسم خرائط نهايات 5 ' من العلامات التسلسل الناتجة إلى الجينوم المرجعي يرسم حاجز exonuclease وبالتالي الموقع الدقيق للبروتين DNA الربط.
الشكل 2: سونيكيشن وLM-PCR تضخيم مكتبة ChIP-exo. (أ) 1.5٪ agarose هلام من الحمض النووي سونيكاتيد كهربائي. 12، 18، و 24 دورات سونيكيشن أجريت للعثور على دورات سونيكيشن الأمثل ل 2 × 107 الخلايا من الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا ES الماوس. بعد سونيكيشن، كان عكس عينة الحمض النووي crosslinked، واستخراج باستخدام PCIA والايثانول هطول الأمطار. كل عينة تحتوي على 4 × 105 مكافئ الخلية، وهو 2٪ من الخلايا سونيكاتيد. أنتجت 12 دورة من سونيكيشن عائد أكبر من الحمض النووي سونيكاتيد مع الحجم المطلوب (100-500 BP). (B) 1.5٪ agarose هلام من المكتبات ChIP-exo الكهربائية بعد 18-21 دورات من LM-PCR لعدم وجود التحكم في الأجسام المضادة (لا أب) و Isl1 في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا ES الماوس. كل عينة تحتوي على 10 × 106 خلية مكافئة من الخلايا العصبية الحركية الماوس. أي جسم مضاد ChIP-exo النتيجة (حارة 2) يدل على أن غير محددة، والحمض النووي الملوث يتم القضاء عليها من قبل exonuclease لامدا. تُظهر مكتبات ChIP-exo لـ Isl1 (الممر 3) مكتبات الحمض النووي المُضخمة حول 200-400 نقطة أساس، مما يشير إلى أن مكتبات ChIP-exo تم تضخيمها بنجاح بواسطة PCR بوساطة محول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين ChIP-exo و ChIP-seq لـ Isl1 في مكان معين. تظهر المؤامرات الزرقاء والحمراء المملوءة توزيع علامات التسلسل للمواقع المضمّنة لـ ChIP-seq وChIP-exo Isl1 ، على التوالي ، بشكل قريب إلى جين Slit3 و Fgfr1 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية الوليدة المتمايزة عن خلايا ماوس ES.
الجدول 1: Oligonucleotides المستخدمة في هذا البروتوكول.
| اسم أوليغو | الطول (غير محدد) | تسلسل | ملاحظه | |||||
| مؤشر محول إلى الأمام* | 66 | 5'/فوس/ CAAGCAGAAGACGCATACGAGATXXXXXXXXGACTACTGAGAGGGCAGACGTGTGCTCCCGATCT 3' | 5' الفوسفات، ومؤشر (XXXXXXXX)، 3 'T-ا شنق | |||||
| مؤشر محول عكس* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| محول الربط إلى الأمام* | 58 | 5 'AATGATACGGCGACCACCGAACCTCTTTCCCACACGAGACGCGACGCTCCT 3' | ||||||
| محول الربط العكسي* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGAAAGAGTAG 3' | ||||||
| مؤشر PCR التمهيدي * | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3 ' | ||||||
| التمهيدي العالمي PCR* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *تم تصميم محولات التسلسل أعلاه والتصاميم التمهيدية PCR لمنصات تسلسل Illumina HiSeq و NextSeq. | ||||||||
الجدول 2: وصفات للمخازن المؤقتة 1-3 وسد العازلة. يخزن في أنابيب 50 مل عند 4 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من 1000x CPI (مثبطات protease كاملة) إلى جميع المخازن المؤقتة قبل الاستخدام.
| Lysis العازلة 1 | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 م ناول | 1.4 | 140 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 50٪ غليسيرول | 10 | 10% |
| 10٪ أوكلبينول ethoxylate | 2.5 | 0.50% |
| 10٪ 2-[4-(2،4،4-تريميثيلبنتان-2-yl)phenoxy]الإيثانول | 1.25 | 0.25% |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
| Lysis العازلة 2 | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 0.5 M تريس-HCl (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 5 م ناول | 2 | 200 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
| Lysis العازلة 3 | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 1 م تريس-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 م ناول | 1 | 100 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10٪ حمض ديوكسيكوليك | 0.5 | 0.10% |
| 30٪ N-Lauroylsarcosine محلول ملح الصوديوم | 0.83 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
| حظر الحل | ||
| الكاشف | المبلغ | [النهائي] |
| بولفين المصل الألبومين (BSA) | 250 ملغ | 0.50% |
| مثبطات Protease كاملة (CPI، 1000x) | 50 ميكرولتر | 1 x |
| الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) | املأ إلى 50 مل | |
الجدول 3: وصفات لغسل ChIP: ارتفاع الملح غسل العازلة، LiCl غسل العازلة و10 mM تريس-HCl العازلة (pH 7.4). يخزن في أنابيب 50 مل عند 4 درجة مئوية. أضف 50 ميكرولتر من مخزون CPI 1000x إلى جميع المخازن المؤقتة قبل الاستخدام.
| ارتفاع الملح غسل العازلة | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 م ناول | 5 | 500 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10٪ 2-[4-(2،4،4-تريميثيلبنتان-2-yl)phenoxy]الإيثانول | 5 | 1% |
| 5٪ حمض ديوكسيكوليك | 1 | 0.10% |
| 5٪ من الـDD | 1 | 0.10% |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
| LiCl غسل العازلة | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 0.5 M تريس-HCl (pH 8.0) | 2 | 20 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 م لى كل | 12.5 | 250 mM |
| 10٪ أوكلبينول ethoxylate | 2.5 | 0.50% |
| 5٪ حمض ديوكسيكوليك | 5 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
| 10 mM تريس-HCl العازلة | ||
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 1 M تريس-HCl (7.4 pH) | 0.5 | 10 mM |
| Autoclaved ddH2O | املأ إلى 50 | |
الجدول 4: ملء في مزيج ماجستير رد الفعل.
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| 20 ملغم / مل BSA | 0.6 | 0.2 ملغم / مل |
| 10x phi29 الحمض النووي البوليمرات العازلة | 6 | 1 x |
| 3 mM dNTPs | 2.5 | 150 ميكرومتر |
| 10 U/μL phi29 بوليميراز الحمض النووي | 2 | 10 ش |
| حجم مزيج رد الفعل | 11.1 |
الجدول 5: وصفة لمخزن ChIP Elution المؤقت. تخزين في أنابيب 50 مل في RT.
| الكاشف | حجم الصوت (مل) | [النهائي] |
| 0.5 M تريس-HCl (pH 8.0) | 5 | 50 mM |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 10٪ من الـ SD | 5 | 1% |
| Autoclaved ddH2O | حتى 50 مل |
الجدول 6: Denaturing والخلط التمهيدي رد فعل الصلب ماجستير والبرنامج.
| Denaturing واخلطة المزيج الصلب | ||
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| 20 ملغم / مل BSA | 0.2 | 0.2 ملغم / مل |
| 3 mM dNTPs | 0.5 | 75 ميكرومتر |
| 10 μM مؤشر PCR التمهيدي | 0.5 | 0.25 ميكرومتر |
| حجم مزيج رد الفعل | 1.2 | |
| برنامج Denaturing و التمهيدي الصلب | ||
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت | |
| 95 | 5 دقائق | |
| 65 | 3 دقائق | |
| 60 | 3 دقائق | |
| 57 | 3 دقائق | |
| 54 | 3 دقائق | |
| 51 | 3 دقائق | |
| 30 | إلى الأبد | |
الجدول 7: التمهيدي ملحق التفاعل ماجستير مزيج والبرنامج.
| مزيج تمديد التمهيدي | ||
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| 10x phi29 الحمض النووي البوليمرات العازلة | 2 | 1 x |
| 10 U/μL phi29 بوليميراز الحمض النووي | 1 | 75 ميكرومتر |
| حجم مزيج رد الفعل | 3 | |
| برنامج تمديد التمهيدي | ||
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت | |
| 30 | 20 دقيقة | |
| 65 | 10 دقيقة | |
| 4 | إلى الأبد | |
الجدول 8: dA-Tailing مزيج ماجستير وبرنامج.
| dA-ذيل مزيج | ||
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 ميكرومتر |
| مخزن تجزئة كلينو المؤقت | 2.4 | 1 x |
| 5 U / μL كلينو جزء | 1 | 5 ش |
| حجم مزيج رد الفعل | 4.1 | |
| برنامج dA-Tailing | ||
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت | |
| 37 | 30 دقيقة | |
| 75 | 20 دقيقة | |
| 4 | إلى الأبد | |
الجدول 9: العالمي محول تفاعل التفاعل مزيج ماجستير.
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| المياه المُقلَّدَة ذاتيًا | 5 | |
| محول 15 ميكرومتر عالمي* | 1 | 320 nM |
| محسن الربط | 0.5 | 1 x |
| مزيج رئيسي ليغايز | 15 | 1 x |
| حجم مزيج رد الفعل | 21.5 | |
| *يتم وصف تسلسل الحمض النووي محول عالمي في الجدول 1. | ||
الجدول 10: الربط-بوساطة PCR الماجستير مزيج والبرنامج.
| LM-PCR مزيج | ||
| الكاشف | 1x (ميكرولتر) | [النهائي] |
| 10 μM مؤشر PCR التمهيدي * | 2 | 0.2 ميكرومتر |
| 10 μM PCR العام التمهيدي * | 2 | 0.2 ميكرومتر |
| 2x طق الحمض النووي بوليميراز PCR ماجستير مزيج | 25 | 1 x |
| حجم مزيج رد الفعل | 29 | |
| *يتم وصف تسلسلات PCR التمهيدية في الجدول 1. | ||
| برنامج LM-PCR | ||
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت | دورات |
| 98 | 30 س | 1 |
| 98 | 10 س | 15-25 |
| 65 | 75 س | |
| 65 | 5 دقائق | 1 |
| 4 | عقد | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، يتم استخدام ChIP متبوعاً بعملية الهضم exonuclease للحصول على مكتبات الحمض النووي لتحديد التفاعلات البروتين والحمض النووي في خلايا الثدييات في دقة رسم الخرائط عالية جداً. العديد من المتغيرات تساهم في جودة تجربة ChIP-exo. المعلمات التجريبية الحرجة تشمل نوعية الأجسام المضادة، الأمثل من سونيكيشن، وعدد من دورات LM-PCR. هذه المعلمات التجريبية الحرجة هي أيضا ما يمكن أن يحد من التجارب ChIP-exo وسيتم مناقشتها أدناه.
في أي بروتوكول ChIP، جودة الأجسام المضادة هي واحدة من أهم الاعتبارات. ويوصى باستخدام الأجسام المضادة من الدرجة ChIP لChIP-exo. ويمكن التحقق من نوعية الأجسام المضادة قبل إجراء بروتوكول ChIP-exo. يمكن استخدام ChIP-seq أو ChIP-qPCR للتحقق من صحة الأجسام المضادة من الدرجة ChIP من خلال تأكيد مواقع محددة لربط الحمض النووي للبروتين من الفائدة. في وقت لاحق، وتحسين تركيز الأجسام المضادة المضافة إلى الخرز هو مثالي لضمان أن مجمعات البروتين DNA هيمناعية 22،23.
صوتنة كروماتين هو خطوة أخرى حاسمة في بروتوكول ChIP-exo. سونيكيشن أمر بالغ الأهمية ل القص غير محددة من الكروماتين، اللازمة للحصول على أفضل المناعة للبروتين من الفائدة24. حجم وكمية من الحمض النووي سونيكاتيد تعتمد على عدد من دورات sonication. من المهم وجود تركيز عالٍ من الحمض النووي المجزأ لضمان أن يكون الحمض النووي كافٍ مناعيًا للبروتين الذي يهم مكتبة الحمض النووي ChIP-exo التي سيتم إنشاؤها. الحصول على 100-500 BP تجزئة الحمض النووي مثالية لأن قرار ChIP-exo هو أفضل إذا كانت شظايا الكروماتين سونيكاتيد أحجام أصغر بدءا. لذلك، ينبغي تحديد صوتنة الكروماتين الأمثل لكل نوع ودفعة من الخلايا عن طريق تغيير عدد من دورات sonication ومخازن سونيكيشن.
المعلمة الحرجة النهائية هو الحصول على تضخيم الحمض النووي مكتبة ChIP-exo مع الحد الأدنى من دورات LM-PCR لتجنب الإفراط في تضخيم القطع الأثرية PCR. لتحديد العدد الأدنى من دورات PCR لتضخيم الحمض النووي CHIP-exo، يمكن استخدام جزء صغير من الحمض النووي CHIP-exo لتشغيل دورات PCR متعددة (على سبيل المثال، دورات 10 و 15 و 20) ومقارنة منتجات PCR.
ChIP-exo لديه العديد من الخطوات أكثر من ChIP التقليدية-seq، ونتيجة لذلك، ينبغي أن يتم تنفيذ كل خطوة بعناية ودقة لبروتوكول ChIP-exo للعمل. الأهم من ذلك، يجب أن تضاف إلى حجم الصحيح من كل كاشف في ردود الفعل الأنزيمية لكل مزيج ماجستير رد فعل21. وبالتالي ، إنشاء جدول بيانات لحساب حجم كل كاشف المطلوبة لكل مزيج الرئيسي ، ثم طباعة الجداول والتحقق من كل كاشف بعد إضافة إلى يمزج الرئيسي ينصح. الختان الدقيق للحمض النووي تضخيم مهم أيضا; شظايا أقل من 200 بريتيش بتروليوم غالبا ما تحتوي على الخافتات محول، والتي تحتاج إلى إزالتها قبل تسلسل الجيل القادم.
وتجدر الإشارة إلى أن معظم المعلمات والقيود الحرجة من ChIP-exo مماثلة لتلك التي ChIP-seq. ومع ذلك ، على عكس ChIP - seq ، يوفر ChIP-exo رسم خرائط جينوم عالي الدقة مع خلفية منخفضة. وهكذا، ChIP-exo هو الطريقة المثلى لتحديد التفاعلات الدقيقة البروتين والحمض النووي في مجموعة متنوعة من النظم والكائنات الحية، مما يساعد على الكشف عن الأدوار الهامة للبروتينات الحمض النووي الملزمة في الخلية. يمكن استخدام طريقة ChIP-exo المذكورة أعلاه لفحص عوامل النسخ وعلامات تعديل الحجر الهي والبروتينات التنظيمية الكروماتين في الخلايا الحية بدقة خرائط أعلى من ChIP-seq25،26،27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ChIP-exo الكشف عن مواقع ملزمة الفردية للبروتينات DNA ملزمة داخل الكتلة، في حين ChIP-seq لا يمكن بسبب قرار رسم الخرائط. الأهم من ذلك، ChIP-exo يعرض نسبة إشارة إلى الضوضاء أعلى مقارنة مع ChIP-seq. هذه المزايا من ChIP-exo تسمح لنا بتحديد مجموعة شاملة من المواقع المقيدة عبر الجينوم. وسيوفر هذا البروتوكول أساسا للباحثين المهتمين بدراسة المواقع الملزمة للحمض النووي لمختلف البروتينات عبر الجينوم عند دقة الزوج الأساسي القريب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر عضو مختبر ري على تبادل البيانات غير المنشورة والمناقشات القيمة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبيعية والهندسية في كندا (NSERC) منحة RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
