Summary
קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.
Abstract
זיהוי אינטראקציות ספציפיות בין חלבון לדנ"א על הגנום חשוב להבנת ויסות הגנים. כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף תפוקה גבוהה (ChIP-seq) נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות מיקומים מחייבים גנום רחב של חלבונים מחייבי DNA. עם זאת, שיטת ChIP-seq מוגבלת על ידי ההטרוגניות שלה באורך של שברי DNA sonicated ו- DNA רקע לא ספציפי, וכתוצאה מכך רזולוציית מיפוי נמוכה וחוסר ודאות באתרים מחייבי DNA. כדי להתגבר על מגבלות אלה, השילוב של ChIP עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) מנצל 5 ' עד 3 ' עיכול exonuclease לקצץ את ה-DNA immunoprecipitated בגודל הטרוגנית לאתר חלבון-DNA crosslinking. טיפול Exonuclease גם מבטל DNA רקע לא ספציפי. ניתן לשלוח את הדנ"א שהוכן על ידי הספרייה ומתעכל מחוץ לתפוקה גבוהה. שיטת ChIP-exo מאפשרת רזולוציית מיפוי קרובה לזוג בסיס עם רגישות גבוהה יותר לזיהוי ואות רקע מופחת. פרוטוקול ChIP-exo ממוטב לתאי יונקים ולרצף הדור הבא מתואר להלן.
Introduction
מיקומן של אינטראקציות בין חלבונים לדנ"א מספק תובנה לגבי המנגנונים של ויסות הגנים. כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף תפוקה גבוהה (ChIP-seq) שימש במשך עשור כדי לבחון גנום רחב חלבון-DNA אינטראקציות בתאיםחיים 1,2. עם זאת, שיטת ChIP-seq מוגבלת על ידי הטרוגניות בפיצול DNA וזיהום DNA לא מאוגד שמובילים לרזולוציית מיפוי נמוכה, תוצאות חיוביות שגויות, שיחות שלא נענו ואות רקע לא ספציפי. השילוב של ChIP עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) משפר את שיטת ChIP-seq על ידי זמירת DNA ChIP לנקודות הצלבה חלבון-DNA, מתן רזולוציה קרובה בסיס זוג אות רקע נמוך3,4,5. רזולוציית המיפוי המשופרת מאוד והרקע הנמוך שמספק ChIP-exo מאפשרים לקבוע מיקומי קשירה מדויקים ומקיפים של חלבון-DNA ברחבי הגנום. ChIP-exo הוא מסוגל לחשוף מוטיבים ייחודיים מבחינה תפקודית DNA מחייב, אינטראקציות שיתופיות בין גורמי שעתוק (TF), ואתרים מרובים חלבון-DNA crosslinking במיקום מחייב גנומי מסוים, לא ניתן לגילוי על ידי שיטות מיפוי גנומיות אחרות3,4,6,7.
ChIP-exo שימש בתחילה ניצנים שמרים כדי לבחון את כריכת DNA ספציפית לרצף של TFs, כדי ללמוד את הארגון המדויק של קומפלקס טרום ייזום שעתוק, ומבנה תת-נוקלאוזומי של היסטונים בודדים על פני הגנום4,8,9. מאז השקתו בשנת 20114, ChIP-exo נוצל בהצלחה באורגניזמים רבים אחרים כולל חיידקים, עכברים ותאים אנושיים7,10,11,12,13,14,15,16,17. בשנת 2016, Rhee et al.14 השתמשו ב- ChIP-exo בנוירונים של יונקים בפעם הראשונה כדי להבין כיצד ביטוי גנים עצביים נשמר לאחר הסרת הפיקוח של תכנות TF Lhx3, המהווה קומפלקס הטרודימר עם תכנות אחר TF Isl1. מחקר זה הראה כי בהיעדר Lhx3, Isl1 מגויס משפרי עצבים חדשים כבול על ידי Onecut1 TF כדי לשמור על ביטוי גנים של גנים משפיע עצבי. במחקר זה, ChIP-exo חשף כיצד TFs מרובים מזהים באופן דינמי סוג תא ואלמנטים רגולטוריים ספציפיים לדנ"א בשלב התא באופן קומבינטורי ברזולוציית מיפוי כמעט נוקלאוטידים. מחקרים אחרים השתמשו גם בשיטת ChIP-exo כדי להבין את יחסי הגומלין בין חלבונים לדנ"א בקווי תאים אחרים של יונקים. האן ואח '7 השתמשו ChIP-exo לבחון ארגון גנום רחב של GATA1 ו TAL1 TFs בתאי אריתרואיד העכבר באמצעות ChIP-exo. מחקר זה מצא כי TAL1 מגויס ישירות לדנ"א ולא בעקיפין באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון עם GATA1 לאורך כל הבידול אריתרואיד. מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו גם ChIP-exo כדי פרופיל מיקומי מחייב הגנום כולו של CTCF, RNA פולימראז II, וסימני היסטון ללמוד מנגנונים אפיגנומיים שעתוק בשורות תאים אנושיים18,19.
ישנן מספר גרסאות של פרוטוקול ChIP-exo זמין3,5,20. עם זאת, קשה לעקוב אחר פרוטוקולי ChIP-exo אלה עבור מחקרים שאינם מכירים את הכנת ספריית הרצף של הדור הבא. גרסה מצוינת של פרוטוקול ChIP-exo פורסמה עם הוראות קלות למעקב ווידאו21, אבל הכיל צעדים אנזימטיים רבים הדורשים כמות משמעותית של זמן כדי להשלים. כאן אנו מדווחים על גרסה חדשה של פרוטוקול ChIP-exo המכיל צעדים אנזימטיים מופחתים וזימני דגירה, והסברים לכל שלב אנזימטי21. תיקון סיום ותגובות dA-tailing משולבים בשלב אחד באמצעות אנזים הכנה סוף. זמני הדגירה עבור אינדקס ושלבי קשירה מתאם אוניברסלי מופחתים מ 2 שעות ל 15 דקות באמצעות משפר קשירה. תגובת הקינז לאחר שלב החיבור של מתאם האינדקס המתואר בפרוטוקול ChIP-exo הקודם מוסרת. במקום זאת, קבוצת פוספט מתווספת במהלך סינתזת DNA אוליגו לאחד הקצוות 5 ' של מתאם האינדקס (טבלה 1), אשר ישמש לשלב עיכול exonuclease למדה. בעוד פרוטוקול ChIP-exo הקודם השתמש RecJf exonuclease עיכול כדי לחסל מזהמים DNA חד גדילי, שלב העיכול הזה מוסר כאן כי זה לא קריטי עבור האיכות של ספריית ChIP-exo. בנוסף, כדי לטהר DNA מקושר הפוך לאחר elution ChIP, שיטת טיהור חרוזים מגנטיים משמש במקום פנול:כלורופורם:אלכוהול isoamyl (PCIA) שיטת החילוץ. זה מקטין את זמן הדגירה של מיצוי DNA. חשוב לציין, זה מסיר את רוב dimers מתאם נוצר במהלך קשירת מתאם אינדקס, אשר עשוי להשפיע על היעילות של PCR בתיווך קשירה.
פרוטוקול ChIP-exo המוצג כאן מותאם במיוחד לגילוי אינטראקציות דנ"א מדויקות של חלבונים בנוירונים של יונקים המובחנים מתאי גזע עובריים (ES) של העכבר. בקצרה, תאים עצביים שנקטפו והצטלבים הם lysed, כדי לאפשר כרומטין להיחשף sonication, ולאחר מכן sonicated כך שברי DNA בגודל מתאים מתקבלים (איור 1). חרוזים מצופים בנוגדנים משמשים לאחר מכן כדי לדכא באופן סלקטיבי כרומטין מקוטע ומסיס לחלבון המעניין. בעוד DNA immunoprecipitated הוא עדיין על החרוזים, סוף תיקון, קשירה של מתאמי רצף, תגובת מילוי ו 5 ' עד 3 ' צעדי עיכול exonuclease למדה מבוצעים. שלב העיכול exonuclease הוא מה שנותן ChIP-exo שלה ברזולוציה גבוהה במיוחד ויחס אות לרעש גבוה. Lambda exonuclease חותך את ה-DNA immunoprecipitated כמה זוגות בסיס (bp) מאתר crosslinking, ובכך גורם DNA מזהם להיות מושפל. הדנ"א ChIP שטופל על ידי exonuclease הוא התרומם מן החרוזים מצופה הנוגדנים, חלבון-DNA crosslinks הפוכים, וחלבונים מושפלים. הדנ"א מופק ומנוכה לדנ"א ChIP חד-גדילי, ואחריו חישול פריימר והרחבה להכנת דנ"א דו-גדילי (dsDNA). לאחר מכן, מתבצעת קשירה של מתאם אוניברסלי לקצוות המטופלים ב exonuclease. הדנ"א שנוצר מטוהר, ואז PCR מוגבר, ג'ל מטוהר, ונתון לריצוף הדור הבא.
פרוטוקול ChIP-exo ארוך יותר מפרוטוקול ChIP-seq, אך אינו מאתגר מבחינה טכנית. כל DNA ChIP immunoprecipitated בהצלחה יכול להיות נתון ChIP-exo, עם מספר צעדים אנזימטיים נוספים. היתרונות הבולטים של ChIP-exo, כגון רזולוציית מיפוי גבוהה במיוחד, אות רקע מופחת, וירידה חיובית ותשלילית כוזבת, לגבי אתרי קשירה גנומיים, עולים על עלות הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מים מזוקקים אוטומטית (ddH2O) מומלץ להכנת מאגרים ותערובות מאסטר תגובה. סעיפים 1-4 מתארים תמוגה וסוניזציה של תאים, סעיפים 5-7 מתארים חיסון כרומטין (ChIP), סעיפים 8-11 מתארים תגובות אנזימטיות על חרוזים, סעיפים 12 ו-13 מתארים חמקמקות ChIP וטיהור DNA, וסעיפים 14-19 מתארים את הכנת הספרייה.
1. קצירה והצלבה של תאים
- לאחר הבחנה בין תאי ES של העכבר לנוירונים פוסט-מיוטיים, הוסף 11% פורמלדהיד לתאים שנקטפו לריכוז סופי של 1% (v/v). תאי סלע על פלטפורמת נדנדה (נדנדה, שייקר או מסובב) במשך 15 דקות, בטמפרטורת החדר (RT, 25 מעלות צלזיוס).
הערה: בהתאם לחלבון היעד שיש לקשר, פחות קישורים פורמלדהיד (לדוגמה, ריכוז סופי של 0.5%) או הצלבה כפולה עם גלוטרט disuccinimidyl (DSG) ניתן להשתמש. - הוסיפו 2.5 מ' גליצין לריכוז סופי של 150 מ"ר כדי לעצור את תגובת ההצלבה. תאי סלע על פלטפורמת נדנדה ב RT, במשך 5 דקות.
- צנטריפוגה תאים מקושרים 15 מ"ל צינורות חרוטים ב RT, במשך 6 דקות, ב 1,350 x גרם. לשאוף את הפתרון, ולאחר מכן resuspend תאים ב 5 מ"ל של 1x פוספט אגירה מלוחים (PBS).
הערה: כדורי התא crosslinked ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת פלאש עם חנקן נוזלי.
2. תמוגה תאית
הערה: השלבים הבאים בפרוטוקול זה מיועדים לכ-2 x 107 תאים עצביים המובחנים מתאי ES של העכבר. כדי לשבור תאים פתוחים, ייעשה שימוש במאגרי תמוגה המכילים חומרי ניקוי שונים. הוסף 50 μL של 1000x מלא מעכב פרוטאז (CPI) מלאי ל 50 מ"ל של חיץ רק לפני השימוש.
- הכן מאגרי תמוגה 1-3 כמתואר בטבלה 2.
- להפשיר כדורי תא מקושרים על קרח, ואז ביסודיות resuspend כדורי תא ב 3 מ"ל של מאגר תמוגה 1 ב 15 צינורות חרוט מ"ל. רוק ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על פלטפורמת נדנדה. צנטריפוגה ב 1,350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושואף supernatant.
- ביסודיות resuspend תאים כדוריים ב 3 מ"ל של מאגר תמוגה 2. סלע ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה. צנטריפוגה ב 1,350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושואף supernatant.
- מוסיפים 1 מ"ל של מאגר תמוגה 3 לכל גלולה, ואז לשמור על קרח. מיד להמשיך sonication.
3. כרומטין קולי
הערה: שמור דגימות על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס במהלך הליך sonication זה כדי להפחית היפוך crosslink.
- באמצעות מרית סטרילית, להוסיף חרוזי sonication(שולחן החומרים)עד 0.2 מ"ל סימן סיום על 15 צינורות פוליסטירן מ"ל. לשטוף חרוזי sonication על ידי מערבולת ב 600 μL של 1x PBS עד כתמים יבשים אינם גלויים. צנטריפוגה הצינורות עבור 5 s ב 30 x גרם לשאוף 1x PBS.
הערה: Sonication בצינורות פוליסטירן יעיל יותר מאשר sonication בצינורות פוליפרופילן. אם מספר קטן יותר של תאים (לדוגמה, <106 תאים) הוא sonicated, להשתמש 1.5 צינורות פוליסטירן מ"ל מבלי להוסיף חרוזי sonication. - ביסודיות resuspend lysates הגרעיני ב 1 מ"ל של מאגר תמוגה 3 (משלב 2.4), ולאחר מכן להעביר את צינורות פוליסטירן 15 מ"ל המכיל חרוזי sonication. בקצרה מערבולת צינורות פוליסטירן.
- כדי לפצל את ה-DNA כרומטין מקושר, sonicate ליסטים גרעיניים ב 4 מעלות צלזיוס עבור מספר ממוטב של מחזורים, עם משרעת כוח ב 30 W, ומחזורי sonication להגדיר 30 s על/30 s כבוי.
הערה: אופטימיזציה של sonication עבור כל סוג תא ואצווה יגרום לתפוקה הטובה ביותר ChIP-exo. עבור 2 x 107 תאים עצביים של העכבר, 20-30 מחזורי sonication בהגדרות שהוזכרו יהיה לפצל את הכרומטין בטווח של 100-500 bp. - לאחר sonication הושלם, להעביר את כל supernatant (lysates sonicated), מכל מדגם, כדי 1.5 צינורות מ"ל. הוסף 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)פנוקסי]אתנול) לכל מדגם בריכוז סופי של 1%. מערבבים על ידי צנרת.
- כדי גלולה פסולת התא, דגימות צנטריפוגה ב 13,500 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להעביר את כל lysates sonicated (על טבעי) מכל מדגם חדש 1.5 מ"ל צינורות.
- קח 30 μL של lysate sonicated מכל מדגם (~ 3% של lysate sonicated) ולהוסיף חדש 1.5 צינורות מ"ל כדי לבדוק sonication. לאחסן lysates sonicated הנותרים ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן דגירה עם חרוזים מצופים נוגדנים.
4. בדיקת קוליזציה
- הפוך 20 מ"ל של 2x חלבון K מאגר על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 מ"ל של 0.5 M EDTA, 10 מ"ל של 10% נתרן דודקיל סולפט (SDS) ו 6 מ"ל של ddH autoclaved2O. אל תוסיף CPI למאגר זה. יש לאחסן בצינור של 50 מ"ל ב-RT.
- כדי להפוך את חלבון-DNA crosslink, על ידי הסרת החלבונים, לקחת את 30 μL של כרומטין sonicated מכל מדגם (משלב 3.6), להוסיף 166 μL של ddH autoclaved2O, 200 μL של 2x חלבון K מאגר ו 4 μL של 20 מ"ג / מ"ל proteinase K. בקצרה מערבולת הדגימות, ולאחר מכן דגירה ב 65 °C (65 °F) עבור 1-3 שעות ב 24 x גרם.
- הערה: lysates sonicated ניתן להפוך crosslinked ב 65 °C (65 °F) לילה.
- לחלץ DNA באמצעות PCIA (25:24:1) ואתנול משקעים שיטה כדלקמן.
התראה: PCIA רעיל. יש להשתמש מתחת למכסה המנוע עם ציוד מגן אישי סטנדרטי (PPE).- הוסף 400 μL של PCIA לכל מדגם בצינורות 1.5 מ"ל, להגדיר מערבולת למהירות מקסימלית ודגימות מערבולת עבור 20 s. צנטריפוגה ב 18,400 x g במשך 6 דקות ב RT. שני שלבים יישמרו. בזהירות להעביר את השכבה מימית העליונה (שלב ברור) של כל מדגם חדש 1.5 מ"ל צינורות.
- הוסף 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase A. דגימות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- הוסף 1 μL של 20 מ"ג / מ"ל גליקוגן לכל מדגם, ולאחר מכן לזרז עם 1 מ"ל של קר כקרח 100% אתנול (מאוחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס). מערבבים בקצרה, ואז דגימות דגירה במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד 1 שעות. דגימות צנטריפוגה ב 18,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בזהירות לשפוך 100% אתנול.
- לשטוף כדורי עם 500 μL של קר כקרח 70% אתנול (מאוחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה ב 18,400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשפוך 70% אתנול.
- דגימות דגירה בצינורות 1.5 מ"ל ב 50 מעלות צלזיוס עד האתנול הנותר מתאדה. Resuspend כדורי DNA ב 15 μL של ddH autoclaved2O או ddH ללא גרעין2O.
- הפעל את דגימות ה-DNA שחולצו, יחד עם סולם DNA, בג'ל agarose 1.5% ב 120-180 V ולבדוק את גודל ה-DNA sonicated.
5. דגירת נוגדנים עם חרוזים
הערה: השלבים הבאים בפרוטוקול זה מיועדים לכ-2 x 107 תאים עצביים המובחנים מתאי ES של העכבר. אין להקפיא ולהפשיר חרוזים מגנטיים בשום שלב במהלך פרוטוקול ChIP-exo שכן החרוזים עלולים להישבר ולגרום לזיהום הדגימה או שביצועי הנוגדן עלולים להיפגע.
- לאחר תמוגה של תאים sonication, להכין חלבון G חרוזים מגנטיים(טבלה של חומרים)עבור ChIP, לערבב חרוזים מגנטיים עד הומוגני, ולאחר מכן להוסיף 25 μL של חרוזים מגנטיים 2 חלבון mL נמוך לאגד צינורות.
הערה: סוג החרוזים המגנטיים בהם נעשה שימוש יהיה תלוי במין הנוגדנים. - לשטוף חרוזים עם 1 מ"ל של פתרון חסימה(טבלה 2),לערבב היטב, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות. בעוד עדיין על מתלה מגנטי, להסיר supernatant ברגע שהוא ברור.
- הוסף 1 מ"ל של פתרון חסימה לחרוזים המגנטיים. צינורות סלע במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס על פלטפורמת נדנדה. בקצרה להסתובב, ולאחר מכן למקם צינורות על מתלה מגנטי ולהסיר supernatant.
- חזור על שלב 5.3 פעמיים נוספות.
- הוסף 500 μL של פתרון חסימה לחרוזים מגנטיים. בקצרה לסובב את הנוגדן נגד Isl1 (0.04 מיקרוגרם / μL, שולחן החומרים),ולאחר מכן להוסיף 4 מיקרוגרם של נוגדן מקביל 2 חלבון מ"ל נמוך לאגד צינורות המכילים את החרוזים המגנטיים בתמיסת חסימה.
- חזור על שלב 5.5 ללא נוגדן (כלומר, אין בקרת נוגדנים עבור ChIP).
הערה: ניתן לקבוע את כמות הנוגדנים שיש להוסיף באופן אמפירי על ידי התחשבות באיכות הנוגדן ובמספר התאים המשמשים ל- ChIP. - דגימות סלע ב 4 מעלות צלזיוס עבור 6-24 שעות על פלטפורמת נדנדה.
6. כרומטין כשל חיסוני (ChIP)
- לשטוף חרוזים מצופים נוגדנים משלב 5.8 עם 1 מ"ל של פתרון חסימה. מניחים דגימות על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 6.1 פעמיים נוספות.
- Resuspend חרוזים מצופים נוגדנים ב 50 μL של פתרון חסימה, ולאחר מכן להעביר חדש 2 מ"ל חלבון נמוך לאגד צינורות. עבור כל דגימת ChIP, להוסיף lysates sonicated (~ 1.0 מ"ל משלב 3.6) לחרוזים מצופים נוגדנים ב 2 חלבון מ"ל נמוך לאגד צינורות.
- דגירה כל מדגם על פלטפורמת נדנדה לילה ב 4 °C (60 °F).
7. שטיפת ChIP
הערה: יש לשמור דגימות על קרח או ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הצלבת חלבון-DNA במהלך שטיפות ChIP.
- הפוך חיץ שטיפת מלח גבוהה, מאגר לשטוף LiCl ו 10 mM Tris-HCl מאגר (pH 7.4) כמתואר בטבלה 3. יש לאחסן בצינורות 50 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μL של 1000x מניות מדד המחירים לצרכן לכל המאגרים ממש לפני השימוש.
- בקצרה לסובב דגימות צינורות 2 מ"ל חלבון נמוך לאגד כדי לאסוף נוזל מן הכובעים, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר supernatant בזהירות עם פיפטה.
- עבור שוטף ChIP, להוסיף 1 מ"ל של מאגר תמוגה 3 (ב 4 מעלות צלזיוס) לכל צינור. מערבבים על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בקצרה לסובב דגימות, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
- מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפת מלח גבוה וקר לכל צינור. מערבבים על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בקצרה לסובב דגימות, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
- מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפת LiCl קר לכל צינור. מערבבים על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בקצרה לסובב דגימות, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר Tris-HCl קר 10 מ"מ (pH 7.4) לכל צינור. מערבבים על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בקצרה לסובב דגימות, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
הערה: ניתן להשתמש במאגר Tris-EDTA (pH 8.0) במקום במאגר Tris-HCl (עמ' 7.4). - חזור על שלבים 7.4-7.6 שלוש פעמים.
- העבר את חרוזי המדגם עם 500 μL של חיץ Tris-HCl (pH 7.4) לצינורות טריים של 1.5 מ"ל. בקצרה לסובב דגימות, ולאחר מכן למקם על מתלה מגנטי במשך 1 דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
8. סוף תיקון ותגובת dA-tailing על חרוזים
הערה: Sonication לעתים קרובות יוצר dsDNA סיום לא בוטה. נדרשת תגובת סיום-תיקון כדי ליצור דנ"א קהה לפני תגובת dA-tailing ואחריו שלב קשירה מתאם האינדקס. עבור קשירת DNA סוף דביק עם DNA מתאם אינדקס, dATP מתווסף לקצה 3 ' של בוטה, שבר dsDNA על ידי התגובה dA-tailing. תערובת תגובת הכנה לסיום מכילה dATP.
- לאחר שטיפת ChIP, להוסיף 38 μL של ddH autoclaved2O לחרוזים מדגם ב 1.5 צינורות מ"ל לתיקון סוף ותגובת dA-tailing.
- הוסף 5.6 μL של תערובת תגובת הכנה סוף ו 2.4 μL של תערובת אנזים הכנה סוף (טבלה של חומרים) לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 46 μL). דגימות דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לשטוף חרוזים כמתואר בשלבים קודמים לשטוף ChIP 7.4-7.6.
9. קשירת מתאם אינדקס על חרוזים
הערה: למתאם האינדקס יש 6-10 בסיסים של רצפי אינדקס ברקוד, הספציפיים לדוגמה נתונה המשמשת לריבוי דגימות מרובות ברצף תפוקה גבוהה. רצפי DNA של מתאם אינדקס מתוארים בטבלה 1.
- עבור ליגציה מתאם אינדקס, להוסיף 27 μL של מאגר קר 10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.4) לחרוזים לדוגמה. הוסף 2 μL של מתאם אינדקס μM 15, 0.5 μL של משפר קשירה, ו 15 μL של תערובת אמן ליגאז(טבלה של חומרים)לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 44.5 μL).
- דגימות דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לשטוף חרוזים כמתואר בשלבים 7.4-7.6.
10. תגובת מילוי על חרוזים
הערה: לאחר קשירה מתאם, אין קשר phosphodiester בין הקצה 5 ' של המתאם ואת הקצה 3 'של ה-DNA ChIP. ניתן לתקן את החתך על ידי תגובת מילוי.
- הוסף 47 μL של מאגר קר 10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.4) אל החרוזים לדוגמה.
- הפוך את תערובת תגובת המילוי (שולחן 4 ושולחן החומרים) על קרח.
- הוסף 11.1 μL של תערובת מילוי לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 58.1 μL). דגימות דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לשטוף חרוזים כמתואר בשלבים 7.4-7.6.
11. למבדה עיכול exonuclease על חרוזים
- לאחר תגובת מילוי על חרוזים, להוסיף 50 μL של ddH autoclaved קר2O כדי חרוזים מדגם.
- כדי לעכל את ה- DNA ChIP בכיוון 5 ' עד 3 ', להוסיף 6 μL של חיץ 10x lambda exonuclease ו 2 μL של 5 U / μL lambda exonuclease (שולחן החומרים, נפח התגובה הכולל: 58 μL). דגימות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לשטוף חרוזים כמתואר בשלבים 7.4-7.6.
12. אלויון והצלבה הפוכה
- הפוך את מאגר ההתפוגגות של ChIP כמתואר בטבלה 5.
הערה: אל תוסיף מדד המחירים לצרכן למאגר elution של ChIP. - כדי elute ChIP דגימות מן החרוזים, resuspend דגימות ב 75 μL של מאגר elution ChIP ודגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 15 דקות ב 130 x גרם.
- הוסף 2.5 μL של 20 מ"ג / מ"ל proteinase K(שולחן החומרים)לדגימות. בקצרה מערבולת, ואז דגירה את הדגימות לילה ב 65 °C (65 °F).
13. חילוץ DNA
- לאחר דגימות יש דגירה לילה ב 65 °C (65 °F), בקצרה ספין דגימות, מקום על מתלה מגנטי במשך 1 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant מכל מדגם חדש 1.5 מ"ל צינורות.
- הוסף 1 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase A לדגימות. בקצרה מערבולת, ולאחר מכן דגירה את הדגימות ב 37 °C (69 °F) במשך 30 דקות. הוסף ~ 25 μL של ddH autoclaved2O לנפח של עד 100 μL.
- לטהר דנ"א באמצעות חרוזים מגנטיים(שולחן החומרים). דנ"א Elute עם 16 μL של ddH autoclaved2O או ddH ללא גרעין2O.
14. דנאטורה, חישול פריימר והרחבת פריימר
- לאחר elution ChIP והצלבה הפוכה, להעביר 16 μL של דגימות DNA שחולצו משלב 13.3 לצינורות PCR.
- הפוך denaturing ו תערובת חישול פריימר(שולחן 6 ושולחן החומרים)על הקרח. הוסף 1.2 μL של תערובת חישול דנאטור פריימר לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 17.2 μL). הפעל דגימות באמצעות התוכנית המתוארת בטבלה 6 כדי denature ו anneal פריימרים ל- DNA התבנית.
- הפוך את תערובת הארכת פריימר (שולחן 7 ושולחן של חומרים) על קרח.
- לאחר התוכנית כדי denature ו פריימרים anneal הושלמה, להוסיף 3 μL של תערובת הארכת פריימר לדגימות (נפח התגובה הכולל: 20.2 μL). הפעל דוגמאות באמצעות התוכנית עבור הרחבת פריימר המתוארת בטבלה 7.
- המשך מיד לתגובת dA-tailing.
15. תגובת זנב dA
הערה: עבור קשירת DNA סוף דביק עם DNA מתאם אוניברסלי, dATP מתווסף לקצה 3 'של בוטה, dsDNA על ידי התגובה dA-tailing.
- הפוך תערובת זנב dA(שולחן 8 ושולחן החומרים)על הקרח.
- הוסף 4.1 μL של תערובת זנב dA לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 24.3 μL). הפעל דוגמאות באמצעות התוכנית עבור dA-tailing (טבלה 8).
- המשך מיד לתיבת מתאם אוניברסלית.
16. קשירת מתאם אוניברסלית
הערה: המתאם האוניברסלי כולל רצפים ספציפיים לריצוף תפוקה גבוהה לזיהוי דגימת DNA לכימיה ברצף. רצפי הדנ"א של המתאם האוניברסלי מתוארים בטבלה 1.
- לאחר תגובת dA-tailing, הפוך את תערובת החיבורים של המתאם האוניברסלית (טבלה 9 וטבלת החומרים) עבור קשירת מתאם אוניברסלית.
- הוסף 21.5 μL לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 45.8 μL) ודגימות דגירה במשך 15 דקות ב 20 °C (69 °F).
17. ניקוי DNA
- לטהר דנ"א באמצעות חרוזים מגנטיים(שולחן החומרים). דנ"א Elute עם 21 μL של ddH autoclaved2O או ddH ללא גרעין2O.
- אחסן דגימות ב- -20 °C עד מוכן לבצע PCR בתיווך קשירה (LM-PCR) וטיהור PCR.
18. PCR בתיווך קשירה
הערה: רצפי פריימר LM-PCR מתוארים בטבלה 1.
- לאחר ניקוי DNA, הפוך LM-PCR לערבב (טבלה 10 וטבלת חומרים) על הקרח.
- הוסף 29 μL של ערבוב LM-PCR לכל מדגם (נפח התגובה הכולל: 50 μL) ולהפעיל דגימות באמצעות התוכנית עבור LM-PCR (טבלה 10).
- מיד להמשיך טיהור ג'ל של DNA מוגבר PCR, ואחריו טיהור DNA לריצוף תפוקה גבוהה.
19. DNA purification של LM-PCR מוגברת DNA
- הפעל את דגימות הדנ"א המוגברות של LM-PCR, יחד עם סולם דנ"א, בג'ל אגרוז של 1.5% ב-120-180 וולט ובלו 200-400 bp להקות.
- לטהר DNA מן הג'ל שנכרת באמצעות ערכת מיצוי ג'ל(שולחן החומרים).
- לאחר טיהור הדנ"א, בדוק את הריכוז(טבלת החומרים) שלכל דגימת ספריית ChIP-exo. שלח דוגמאות לריצוף בעל תפוקה גבוהה עבור רצף קריאה יחידה.
הערה: אורך הקריאה המועדף עבור רצף קריאה יחידה הוא לפחות 35 bp, וזה מספיק כדי ליישר באופן ייחודי את הרצף קורא את הגנום הפניה בעכבר או בתאים אנושיים. עבור רוב גורמי שעתוק בעכבר או בתאים אנושיים, 10-20 מיליון קריאות לכל מדגם ChIP-exo מספיקות כדי לזהות את מיקומי הכריכה הגנומיים שלהם. לפחות 30 מיליון קריאות לכל דגימה נדרשות כדי למפות אזורים גנומיים המועשרים בסימני היסטון בתאי יונקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2A מדגים את תוצאות sonication לאחר תמוגה של תאים sonication, עם מחזורים שונים, של תאי נוירון מוטורי מובחן מתאי ES העכבר. המספר האופטימלי של מחזורי sonication (לדוגמה, 12 מחזורים באיור 2A)יצר עוצמת דנ"א חזקה ב-100-400 bp שברי דנ"א. ספריות ChIP-exo באיכות גבוהה מבוססות על הגודל והכמות של דנ"א כרומטין מקוטע. לכן, אופטימיזציה של sonication מומלץ עבור כל סוג תא ואצווה של תאים לפני תחילת ChIP-exo.
איור 2B מציג מוצרי PCR (LM-PCR) בתיווך קשירה של דגימות ה-DNA ChIP-exo המוגברות ב-18-21 מחזורי PCR. LM-PCR מגביר שברי דנ"א ChIP-exo המחובלים במתאמי DNA לריצוף הדור הבא. פריימר PCR הוא חלק מרצפי מתאמי ה- DNA. גודל שברי הדנ"א הקוליים הוא כ-100-400 bp(איור 2A). לאחר עיכול exonuclease למדה, הגודל של שברי DNA יהפוך חצי גודל של החומר ההתחלתי (50-200 bp). כ 125 bp של מתאמי DNA היו קשורים שברי DNA ChIP-exo ולכן, הגודל הצפוי של מוצרי LM-PCR הוא 175-325 bp. המספר המינימלי של PCR cyclesc תוך עדיין להיות מספיק כדי להגביר את ספריית ChIP-exo, מבוצעים כדי למנוע הגברה יתר של ה-DNA ChIP-exo.
כאן, ChIP-exo עבור Isl1 בוצעה בתאי ES עכבר נוירונים מוטוריים. Isl1 הוא גורם שעתוק תכנות נוירון מוטורי, אשר בא לידי ביטוי במיוחד נוירונים מוטוריים פוסט-מימטיים. התוצאות עבור Isl1 ChIP-exo מראות כמויות משמעותיות של 200-400 bp LM-PCR מוגבר ChIP-exo DNA (איור 2B). הלהקה סביב 100 bp מציין חפצי PCR ממתאמים פריימר PCR. הפעלת בקרת נוגדנים ללא נוגדנים לצד דגימה ניסיונית חשובה גם כדי להבטיח שדנ"א רקע לא ספציפי מתעכל על ידי הטיפול ב-lambda exonuclease. לדוגמה, זיהינו מיקומים מאוגדים של Isl1 בנוירונים מוטוריים שמקורם בתאי ES באמצעות ChIP-exo ו- ChIP-seq (איור 3). אות ChIP-exo היה ממוקד מאוד באתרים מחייבים Isl1, גילוי דפוסי קשירה מרובים של גורם שעתוק Isl1 מקובצים באשכולות. אות ChIP-seq הציג אותות רחבים יותר, המציין כי ChIP-exo של Isl1 יש רזולוציית מיפוי גבוהה יותר מאשר ChIP-seq של Isl1.
איור 1: סכמטי של פרוטוקול ChIP-exo. לאחר ChIP (שלבים 1-7), התגובות לתיקון קצה וזנב dA הופכות את הדנ"א של ChIP לקהה על ידי הוספת קבוצת פוספט לקצה ה-5' של הדנ"א והוספת dATP לקצה ה-3' של הדנ"א (שלב 8). קצוות Sonicated של DNA ChIP, על החרוזים מחוברים עם מתאם האינדקס (שלב 9). לאחר תגובת המילוי, הדנ"א של המתאם עם ה-5' הופך להיות בוטה (שלב 10). למבדה exonuclease מעכל את ה-DNA sonicated 5 ' עד 3 ' עד החלבון (TF)-DNA נקודות הצלבה (שלב 11). לאחר elution, הצלבה הפוכה מיצוי DNA (שלבים 12 ו -13), DNA חד גדילי denatured נעשה תקוע כפול על ידי הרחבת אינדקס PCR פריימר (שלב 14), ואחריו dA-tailing (שלב 15). המתאם האוניברסלי מועבר לאחר מכן לקצה המטופל ב exonuclease (שלב 16). הספריה המתקבלת מנוקה, PCR מוגברת ונתונה לריצוף הדור הבא (שלבים 17-19). מיפוי הקצוות של 5' של תגי הרצף וכתוצאה מכך לגנום הייחוס מתייג את מחסום האקסונוקלאז ובכך את האתר המדויק של הצלבת חלבון-DNA.
איור 2: Sonication והגברת LM-PCR של ספריית ChIP-exo. (A)1.5% ג'ל agarose של DNA sonicated אלקטרופורזה. 12, 18, ו 24 מחזורים של sonication נערכו כדי למצוא מחזורי sonication אופטימלית עבור 2 x 107 תאים של נוירונים מוטוריים המופקים על ידי תא העכבר ES. לאחר sonication, דגימת ה-DNA היה הפוך crosslinked, ו שחולצו באמצעות משקעים PCIA ואתנול. כל דגימה הכילה 4 x 105 שווה ערך לתאים, שהם 2% מהתאים sonicated. 12 מחזורים של sonication הפיק תשואה גדולה יותר של DNA sonicated עם הגודל הרצוי (100-500 bp). (B)1.5% ג'ל agarose של ספריות ChIP-exo electrophoresed בעקבות 18-21 מחזורים של LM-PCR ללא בקרת נוגדנים (No Ab) ו Isl1 בתאי עצב מוטוריים שמקורם בעכבר ES. כל דגימה הכילה 10 x 106 תאים המקבילים של נוירונים מוטוריים עכבר. התוצאה ללא נוגדן ChIP-exo (נתיב 2) מדגימה כי DNA לא ספציפי, מזהם מסולק על ידי exonuclease למדה. ספריות ChIP-exo עבור Isl1 (נתיב 3) מציגות ספריות דנ"א מוגברות בסביבות 200-400 bp, מה שמצביע על כך שספריות ChIP-exo הוגברו בהצלחה על-ידי PCR בתיווך קשירת מתאם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין ChIP-exo ל- ChIP-seq עבור Isl1 בלוקוסים ספציפיים. החלקות הכחולות והאדומות מציגות את התפלגות תגי הרצף עבור מיקומים הקשורים ל- ChIP-seq ו- ChIP-exo Isl1, בהתאמה, קרוב לגן Slit3 ו- Fgfr1 בנוירונים מוטוריים מתפתחים בעמוד השדרה המובדלים מתאי ES של העכבר.
טבלה 1: אוליגונוקלאוטידים המשמשים בפרוטוקול זה.
| שם אוליגו | אורך (nt) | רצף | הערה | |||||
| מתאם אינדקס-קדימה* | 66 | 5'/פוס/CAAGCAGAAGACGGCATGAGAXXXXXXXXGTGGGGGGGGTTCACGTGCTTCCGATCT 3' | 5' פוספט, אינדקס (XXXXXXXX), 3' T-overhang | |||||
| מתאם אינדקס הפוך* | 33 | 5'גטגאגגטקטגקטאקטק 3' | ||||||
| מתאם קשירה-קדימה* | 58 | 5'אטגאטאקגאגגאגגאקטטקטCTTCCTACTACACCTTCCGATCGATCT 3' | ||||||
| מתאם קשירת אותיות הפוך* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| פריימר PCR של אינדקס* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| פריימר PCR אוניברסלי* | 19 | 5'אאטגאטאקגגאקאצ'קג 3' | ||||||
| *מתאמי הרצף וה-PCR שלעיל מיועדים לפלטפורמות הרצף Illumina HiSeq ו-NextSeq. | ||||||||
טבלה 2: מתכונים למאגרי תמוגה 1-3 ולחסימת מאגר. יש לאחסן בצינורות 50 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μL של 1000x CPI (מעכב פרוטאז מלא) מלאי לכל המאגרים רק לפני השימוש.
| מאגר תמוגה 1 | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 1 M HEPES (עמ' 7.3) | 2.5 | 50 מ"מ |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 מ"מ |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 0.1 | 1 מ"מ |
| 50% גליצרול | 10 | 10% |
| 10% אתוקסילאט אוקטילפנול | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-טרימתילפנטן-2-yl)פנוקסי]אתנול] | 1.25 | 0.25% |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
| מאגר תמוגה 2 | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 0.5 מטר טריס-HCl (עמ' 8.0) | 1 | 10 מ"מ |
| 5 M NaCl | 2 | 200 מ"מ |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 0.1 | 1 מ"מ |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
| מאגר תמוגה 3 | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 1 M טריס-HCl (עמ' 8.0) | 0.5 | 10 מ"מ |
| 5 M NaCl | 1 | 100 מ"ר |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 0.1 | 1 מ"מ |
| 10% חומצה דוקסיכולית | 0.5 | 0.10% |
| תמיסת מלח נתרן N-Lauroylsarcosine 30% | 0.83 | 0.50% |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
| פתרון חסימה | ||
| מגיב | כמות | [סופי] |
| אלבומין סרום שור (BSA) | 250 מ"ג | 0.50% |
| מעכב פרוטאז מלא (מדד המחירים לצרכן, 1000x) | 50 μL | פי 1 |
| מלוחים במאגר פוספט (PBS) | מילוי עד 50 מ"ל | |
טבלה 3: מתכונים לשטיפות ChIP: חיץ שטיפת מלח גבוה, חיץ LiCl Wash וחיץ Tris-HCl של 10 מ"מ (עמ' 7.4). יש לאחסן בצינורות 50 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μL של 1000x מניות מדד המחירים לצרכן לכל המאגרים ממש לפני השימוש.
| מאגר שטיפת מלח גבוה | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 1 M HEPES (עמ' 7.3) | 2.5 | 50 מ"מ |
| 5 M NaCl | 5 | 500 מ"מ |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 0.1 | 1 מ"מ |
| 10% 2-[4-(2,4,4-טרימתילפנטן-2-yl)פנוקסי]אתנול] | 5 | 1% |
| 5% חומצה דוקסיכולית | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
| מאגר כביסה של LiCl | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 0.5 מטר טריס-HCl (עמ' 8.0) | 2 | 20 מ"מ |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 0.1 | 1 מ"מ |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 מ"מ |
| 10% אתוקסילאט אוקטילפנול | 2.5 | 0.50% |
| 5% חומצה דוקסיכולית | 5 | 0.50% |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
| מאגר Tris-HCl של 10 מ"מ | ||
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 1 M טריס-HCl (עמ' 7.4) | 0.5 | 10 מ"מ |
| DDHאוטומטי 2O | מלא עד 50 | |
טבלה 4: תערובת מאסטר של תגובת מילוי.
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| 20 מ"ג/מ"ל BSA | 0.6 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| מאגר פולימראז DNA 10x phi29 | 6 | פי 1 |
| 3 מ"מ dNTPs | 2.5 | 150 מיקרומטר |
| 10 U /μL phi29 DNA פולימראז | 2 | 10 U |
| עוצמת ערבוב תגובה | 11.1 |
טבלה 5: מתכון למאגר אלוטיון ChIP. יש לאחסן בצינורות 50 מ"ל ב-RT.
| מגיב | אמצעי אחסון (mL) | [סופי] |
| 0.5 מטר טריס-HCl (עמ' 8.0) | 5 | 50 מ"מ |
| 0.5 מ' אדטה (עמ' 8.0) | 1 | 10 מ"מ |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| DDHאוטומטי 2O | עד 50 מ"ל |
טבלה 6: דנאטרינג פריימר Annealing תגובה מאסטר לערבב ולתכנת.
| תערובת חישול דנאטור ו פריימר | ||
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| 20 מ"ג/מ"ל BSA | 0.2 | 0.2 מ"ג/מ"ל |
| 3 מ"מ dNTPs | 0.5 | 75 מיקרומטר |
| פריימר PCR של אינדקס μM 10 מיקרומטר | 0.5 | 0.25 מיקרומטר |
| עוצמת ערבוב תגובה | 1.2 | |
| תוכנית חישול דנאטור ופריימריז | ||
| טמפרטורה (°C) | זמן | |
| 95 | 5 דקות | |
| 65 | 3 דקות | |
| 60 | 3 דקות | |
| 57 | 3 דקות | |
| 54 | 3 דקות | |
| 51 | 3 דקות | |
| 30 | לנצח | |
טבלה 7: תערובת ותכנות ראשיים של תגובת הארכת פריימר.
| תערובת הרחבה של פריימר | ||
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| מאגר פולימראז DNA 10x phi29 | 2 | פי 1 |
| 10 U /μL phi29 DNA פולימראז | 1 | 75 מיקרומטר |
| עוצמת ערבוב תגובה | 3 | |
| תוכנית הרחבה של פריימר | ||
| טמפרטורה (°C) | זמן | |
| 30 | 20 דקות | |
| 65 | 10 דקות | |
| 4 | לנצח | |
טבלה 8: תערובת ותוכניות ראשיות של תגובת dA-Tailing.
| תערובת זנבות dA | ||
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| 3 מ"מ dATP | 0.7 | 120 מיקרומטר |
| מאגר קטעים של Klenow | 2.4 | פי 1 |
| 5 U / μL קטע Klenow | 1 | 5 U |
| עוצמת ערבוב תגובה | 4.1 | |
| תוכנית זנבות dA | ||
| טמפרטורה (°C) | זמן | |
| 37 | 30 דקות | |
| 75 | 20 דקות | |
| 4 | לנצח | |
טבלה 9: שילוב ראשי של תגובת ליגציה של מתאם אוניברסלי.
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| מים אוטומטיים | 5 | |
| מתאם אוניברסלי של 15 מיקרומטר* | 1 | 320 ננומטר |
| משפר ליגציה | 0.5 | פי 1 |
| ערבוב ראשי של ליגסה | 15 | פי 1 |
| עוצמת ערבוב תגובה | 21.5 | |
| *רצף הדנ"א של המתאם האוניברסלי מתואר בטבלה 1. | ||
טבלה 10: ערבוב ותוכנית ראשיים של PCR בתיווך קשירה.
| תערובת LM-PCR | ||
| מגיב | 1x (μL) | [סופי] |
| פריימר PCR אינדקס μM 10 μM* | 2 | 0.2 מיקרומטר |
| פריימר PCR אוניברסלי של 10 מיקרומטר* | 2 | 0.2 מיקרומטר |
| 2x Taq DNA פולימראז PCR תערובת הורים | 25 | פי 1 |
| עוצמת ערבוב תגובה | 29 | |
| *רצפי פריימר PCR מתוארים בטבלה 1. | ||
| תוכנית LM-PCR | ||
| טמפרטורה (°C) | זמן | מחזורים |
| 98 | 30 שניות | 1 |
| 98 | 10 שניות | 15-25 |
| 65 | 75 שניות | |
| 65 | 5 דקות | 1 |
| 4 | להחזיק | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, ChIP ואחריו עיכול exonuclease משמש להשגת ספריות DNA לזיהוי של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי יונקים ברזולוציית מיפוי גבוהה במיוחד. משתנים רבים תורמים לאיכות הניסוי ChIP-exo. פרמטרים ניסיוניים קריטיים כוללים את איכות הנוגדנים, אופטימיזציה של sonication, ומספר מחזורי LM-PCR. פרמטרים ניסיוניים קריטיים אלה הם גם מה שיכול להגביל את ניסויי ChIP-exo ויידונו להלן.
בכל פרוטוקול ChIP, איכות הנוגדנים היא אחד השיקולים החשובים ביותר. השימוש בנוגדנים ברמת ChIP מומלץ עבור ChIP-exo. ניתן לבדוק את איכות הנוגדנים לפני ביצוע פרוטוקול ChIP-exo. ChIP-seq או ChIP-qPCR יכול לשמש כדי לאמת נוגדנים כיתה ChIP על ידי אישור מיקומים ספציפיים מחייב DNA של החלבון של עניין. לאחר מכן, אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים שנוספו לחרוזים היא אידיאלית כדי להבטיח כי מתחמי חלבון-DNA הם immunoprecipitated22,23.
sonication של כרומטין הוא צעד קריטי נוסף בפרוטוקול ChIP-exo. Sonication הוא קריטי עבור גזירה לא ספציפית של כרומטין, הכרחי עבור immunoprecipitation אופטימלית לחלבון שלעניין 24. הגודל והכמות של DNA sonicated תלויים במספר מחזורי sonication. ריכוז גבוה של דנ"א מקוטע חשוב כדי להבטיח כי מספיק DNA הוא immunoprecipitated לחלבון של עניין עבור ספריית DNA ChIP-exo להיווצר. השגת 100-500 bp DNA מקוטע הוא אידיאלי כי הרזולוציה של ChIP-exo הוא טוב יותר אם שברי כרומטין sonicated יש גדלים התחלתיים קטנים יותר. לכן, sonication כרומטין אופטימלית צריך להיקבע עבור כל סוג ואצווה של תאים על ידי שינוי מספר מחזורי sonication ומאגרי sonication.
הפרמטר הקריטי הסופי הוא קבלת הגברה של DNA ספריית ChIP-exo עם המספר המינימלי של מחזורי LM-PCR כדי למנוע הגברה יתר של חפצי PCR. כדי לקבוע את המספר המינימלי של מחזורי PCR כדי להגביר את ה- DNA ChIP-exo, חלק קטן של ה- DNA ChIP-exo יכול לשמש להפעלת מחזורי PCR מרובים (לדוגמה, 10, 15 ו - 20 מחזורים) ולהשוות את מוצרי PCR.
ChIP-exo יש צעדים רבים יותר מאשר ChIP-seq המסורתית, וכתוצאה מכך, כל צעד צריך להתבצע בזהירות ובדיוק עבור פרוטוקול ChIP-exo לעבוד. חשוב לציין, את הנפח הנכון של כל מגיב בתגובות אנזימטיות יש להוסיף לכל תגובה מאסטר לערבב21. לכן, מומלץ ליצור גיליון אלקטרוני כדי לחשב את עוצמת הקול של כל מגיב הנדרש עבור כל שילוב מאסטר, ולאחר מכן להדפיס את הטבלאות ולבדוק כל מגיב לאחר הוספת תערובות המאסטר. כריתה זהירה של הדנ"א המוגבר חשובה גם היא; קטעים מתחת ל- 200 bp מכילים לעתים קרובות רכיבי Dimers של מתאם, שיש להסירם לפני רצף הדור הבא.
יש לציין כי רוב הפרמטרים והמגבלות הקריטיים של ChIP-exo זהים לאלה של ChIP-seq. עם זאת, שלא כמו ChIP-seq, ChIP-exo מספק מיפוי גנום ברזולוציה גבוהה עם רקע נמוך. לפיכך, ChIP-exo היא השיטה האידיאלית לזיהוי אינטראקציות דנ"א-חלבון מדויקות במגוון מערכות ואורגניזמים, ומסייעת לחשוף את התפקידים המשמעותיים של חלבונים מחייבי DNA בתא. שיטת ChIP-exo המתוארת לעיל יכולה לשמש לבחינת גורמי שעתוק, סימני שינוי היסטון וחלבונים רגולטוריים כרומטין בתאים חיים ברזולוציית מיפוי גבוהה יותר מאשר ChIP-seq25,26,27. בנוסף, ChIP-exo יכול לזהות את מיקומי הכריכה הבודדים של חלבונים מחייבי DNA בתוך אשכול, בעוד ChIP-seq לא יכול בשל רזולוציית המיפוי שלה. חשוב לציין, ChIP-exo מציג יחס אות לרעש גבוה יותר בהשוואה ל- ChIP-seq. יתרונות אלה של ChIP-exo מאפשרים לנו לזהות קבוצה מקיפה של מיקומים מאוגדים ברחבי הגנום. פרוטוקול זה יספק בסיס לחוקרים המעוניינים לבחון מיקומים מחייבי DNA של חלבונים שונים ברחבי הגנום ברזולוציה קרובה של זוג בסיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לחבר במעבדת Rhee על שיתוף נתונים שלא פורסמו ודיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) מענק RGPIN-2018-06404 (משאבי אנוש).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
