Summary
A determinação precisa de locais de ligação de proteínas em todo o genoma é importante para entender a regulação genética. Aqui descrevemos um método de mapeamento genômico que trata DNA cromatina-imunoprecipitado com digestão exonuclease (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alta produtividade. Este método detecta interações proteína-DNA com resolução de mapeamento quase par de bases e alta relação sinal-ruído em neurônios mamíferos.
Abstract
A identificação de interações proteicas e DNA específicas no genoma é importante para entender a regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) é amplamente usada para identificar locais de ligação em todo o genoma de proteínas de ligação de DNA. No entanto, o método ChIP-seq é limitado por sua heterogeneidade no comprimento de fragmentos de DNA sonicados e DNA de fundo não específico, resultando em baixa resolução de mapeamento e incerteza em locais de ligação de DNA. Para superar essas limitações, a combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) utiliza a digestão exonuclease de 5' a 3' para aparar o DNA imunoprecipitado heterogêneo ao local de ligação cruzada proteína-DNA. O tratamento de exonuclease também elimina dna de fundo não específico. O DNA preparado pela biblioteca e exonuclease pode ser enviado para sequenciamento de alto rendimento. O método ChIP-exo permite uma resolução de mapeamento de par de base próxima com maior sensibilidade à detecção e sinal de fundo reduzido. Um protocolo ChIP-exo otimizado para células mamíferas e sequenciamento de próxima geração é descrito abaixo.
Introduction
Os locais das interações proteína-DNA fornecem uma visão dos mecanismos de regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) tem sido usada há uma década para examinar interações genoma-DNA em células vivas1,2. No entanto, o método ChIP-seq é limitado pela heterogeneidade na fragmentação do DNA e contaminação de DNA desvinculada que leva a baixa resolução de mapeamento, falsos positivos, chamadas perdidas e sinal de fundo não específico. A combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) melhora o método ChIP-seq, aparando o DNA ChIP aos pontos de cruzamento de DNA proteico, fornecendo resolução próxima do par de base e um sinal de fundo baixo3,4,5. A resolução de mapeamento muito melhorada e o baixo fundo fornecido pelo ChIP-exo permitem que locais precisos e abrangentes de ligação proteína-DNA sejam determinados em todo o genoma. O ChIP-exo é capaz de revelar motivos de ligação de DNA funcionalmente distintos, interações cooperativas entre fatores de transcrição (TF) e múltiplos locais de ligação entre proteínas e DNA em um determinado local de ligação genômica, não detectável por outros métodos de mapeamento genômico3,4,6,7.
ChIP-exo foi inicialmente usado em levedura brotante para examinar a vinculação de DNA específica de sequência de TFs, para estudar a organização precisa do complexo de pré-iniciação da transcrição, e estrutura subnucleosômica de histones individuais através do genoma4,8,9. Desde sua introdução em 20114, o ChIP-exo tem sido utilizado com sucesso em muitos outros organismos, incluindo bactérias, camundongos e células humanas7,10,11,12,13,14,15,16,17. Em 2016, Rhee et al.14 usaram ChIP-exo em neurônios mamíferos pela primeira vez para entender como a expressão genética neuronal foi mantida após a baixa regulação da programação TF Lhx3, que forma um complexo heterodimer com outra programação TF Isl1. Este estudo mostrou que, na ausência de Lhx3, o Isl1 é recrutado para novos intensificadores neuronais ligados pelo Onecut1 TF para manter a expressão genética dos genes efeitos neuronais. Neste estudo, o ChIP-exo revelou como vários TFs reconhecem dinamicamente o tipo celular e elementos regulatórios de DNA específicos do estágio celular de forma combinatória na resolução de mapeamento de quase nucleotídeos. Outros estudos também usaram o método ChIP-exo para entender a interação entre proteínas e DNA em outras linhas celulares de mamíferos. Han et al.7 usaram ChIP-exo para examinar a organização genoma de GATA1 e TAL1 TFs em células eritróides de camundongos usando ChIP-exo. Este estudo descobriu que o TAL1 é diretamente recrutado para o DNA e não indiretamente através de interações proteína-proteína com GATA1 ao longo da diferenciação eritrócrio. Estudos recentes também usaram ChIP-exo para traçar o perfil dos locais de ligação em todo o genoma de CTCF, RNA Polymerase II e histonas para estudar mecanismos epigenômicos e transcricionais nas linhas celulares humanas18,19.
Existem várias versões do protocolo ChIP-exo disponíveis3,5,20. No entanto, esses protocolos ChIP-exo são difíceis de seguir para pesquisas que não estão familiarizados com a preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração. Uma excelente versão do protocolo ChIP-exo foi publicada com instruções fáceis de seguir e um vídeo21,mas continha muitas etapas enzimáticas que requerem uma quantidade significativa de tempo para ser concluída. Aqui relatamos uma nova versão do protocolo ChIP-exo contendo etapas enzimáticas reduzidas e tempos de incubação, e explicações para cada etapa enzimática21. O reparo final e as reações de cauda dA são combinadas em um único passo usando enzima de preparação final. Os tempos de incubação para etapas de ligadura de índice e adaptador universal são reduzidos de 2h para 15 min usando um melhorador de ligadura. A reação de quinase após a etapa de ligadura do adaptador de índice descrita no protocolo ChIP-exo anterior é removida. Em vez disso, um grupo de fosfato é adicionado durante a síntese de DNA oligo a uma das extremidades de 5' do adaptador de índice(Tabela 1), que será usado para a etapa de digestão de exonuclease lambda. Enquanto o protocolo chip-exo anterior usou recJf digestão exonuclease para eliminar contaminantes de DNA de uma única cadeia, este passo de digestão é removido aqui porque não é crítico para a qualidade da biblioteca ChIP-exo. Além disso, para purificar o DNA cruzado reverso após a elução do ChIP, um método de purificação de contas magnéticas é usado em vez do método de extração fenol:clorofórmio:isoamyl álcool (PCIA). Isso reduz o tempo de incubação da extração de DNA. É importante ressaltar que ele remove a maioria dos dimers adaptadores formados durante a ligante do adaptador de índice, o que pode afetar a eficiência do PCR mediado por ligadura.
O protocolo ChIP-exo apresentado aqui é otimizado para a detecção de interações proteicas precisas e DNA em neurônios mamíferos diferenciados das células-tronco embrionárias do camundongo (ES). Brevemente, as células neuronais colhidas e cruzadas são lísedas, para permitir que a cromatina seja exposta à sônica, e depois sônica para que fragmentos de DNA de tamanho adequado sejam obtidos(Figura 1). As contas revestidas de anticorpos são então usadas para imunoprecipitar seletivamente cromatina fragmentada e solúvel à proteína de interesse. Enquanto o DNA imunoprecipitado ainda está nas contas, reparação final, ligadura de adaptadores de sequenciamento, reação de preenchimento e passos de digestão exonuclease lambda de 5' a 3' são realizados. O passo de digestão exonuclease é o que dá ao ChIP-exo sua ultra-alta resolução e alta relação sinal-ruído. Lambda exonuclease apara o DNA imunoprecipitado alguns pares de base (bp) do local de crosslinking, fazendo com que o DNA contaminante seja degradado. O DNA ChIP tratado pela exonuclease é eludido das contas revestidas de anticorpos, os crosslinks de DNA proteico são invertidos e as proteínas são degradadas. O DNA é extraído e desnaturado ao DNA ChIP de um único fio, seguido de ressarem e extensão para fazer DNA de dupla derivação (dsDNA). Em seguida, é realizada a ligadura de um adaptador universal para as extremidades tratadas com exonuclease. O DNA resultante é purificado, então PCR amplificado, gel purificado e submetido ao sequenciamento de próxima geração.
O protocolo ChIP-exo é mais longo que o protocolo ChIP-seq, mas não é muito desafiador tecnicamente. Qualquer DNA ChIP imunoprecipitado com sucesso pode ser submetido a ChIP-exo, com várias etapas enzimáticas adicionais. As notáveis vantagens do ChIP-exo, como resolução de mapeamento ultra-alta, um sinal de fundo reduzido e diminuição de falsos positivos e negativos, em relação a sites de vinculação genômica, superam o custo de tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: A água destilada e desionizada autoclavada (ddH2O) é recomendada para fazer buffers e misturas mestres de reação. As seções 1-4 descrevem a lise celular e a sônica, as seções 5-7 descrevem a imunoprecipitação de cromatina (ChIP), as seções 8-11 descrevem reações enzimáticas em contas, seções 12 e 13 descrevem elução chip e purificação de DNA, e seções 14-19 descrevem a preparação da biblioteca.
1. Células de colheita e crosslinking
- Depois de diferenciar as células ES do camundongo em neurônios pós-metóticos, adicione 11% de formaldeído às células colhidas a uma concentração final de 1% (v/v). Células rochosas em uma plataforma de balanço (um roqueiro, agitador ou rotador) por 15 minutos, em temperatura ambiente (RT, 25 °C).
NOTA: Dependendo da proteína alvo a ser cruzada, menor formaldeído crosslinking (por exemplo, uma concentração final de 0,5%) ou dupla ligação cruzada com glutarate de desuccinimidílico (DSG) pode ser usado. - Adicione 4,5 M de glycina a uma concentração final de 150 mM para parar a reação de crosslinking. Células de rocha em uma plataforma de balanço na RT, por 5 minutos.
- Centrifugar as células interligadas em tubos cônicos de 15 mL em RT, por 6 min, a 1.350 x g. Aspire a solução e, em seguida, resuspend células em 5 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS).
NOTA: As pelotas de células cruzadas podem ser armazenadas a -80 °C após o congelamento de flash com nitrogênio líquido.
2. Lise celular
NOTA: As seguintes etapas deste protocolo são para aproximadamente 2 x 107 células neuronais diferenciadas das células ES do mouse. Para quebrar células abertas, serão utilizados tampões de lise contendo vários detergentes. Adicione 50 μL de 1000x completo inibidor de protease (CPI) a 50 mL de tampão pouco antes de usar.
- Prepare os buffers de lise 1-3, conforme descrito na Tabela 2.
- Descongele as pelotas de células cruzadas no gelo e, em seguida, resuspend completamente pelotas de células em 3 mL de tampão de lise 1 em tubos cônicos de 15 mL. Arrase a 4 °C por 15 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernanato.
- Resuspend completamente células pelotas em 3 mL de tampão de lise 2. Arrase a 4 °C por 10 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g por 5 min a 4 °C e aspirar supernanato.
- Adicione 1 mL de tampão de lise 3 a cada pelota e mantenha no gelo. Imediatamente proceder à sônica.
3. Cromatina sonicante
NOTA: Mantenha amostras no gelo ou a 4 °C durante este procedimento de sonicação para reduzir a reversão do crosslink.
- Utilizando uma espátula estéril, adicione contas de sônica(Tabela de Materiais)até a marca de graduação de 0,2 mL em tubos de poliestireno de 15 mL. Lave as contas de sônica por vórtice em 600 μL de 1x PBS até que não sejam visíveis manchas secas. Centrifugar os tubos por 5 s a 30 x g e aspirar 1x PBS.
NOTA: A sônicação em tubos de poliestireno é mais eficiente do que a sônica em tubos de polipropileno. Se um número menor de células (por exemplo, <106 células) for sônico, use tubos de poliestireno de 1,5 mL sem adicionar contas de sônica. - Resuspenque minuciosamente os lises nucleares em 1 mL de tampão de lise 3 (a partir da etapa 2.4), depois transfira para os tubos de poliestireno de 15 mL contendo contas de sônica. Brevemente vórtice dos tubos de poliestireno.
- Para fragmentar o DNA de cromatina transligada, sonicates nucleares a 4 °C para um número otimizado de ciclos, com amplitude de energia a 30 W, e ciclos de sonicização definidos para 30 s on/30 s off.
NOTA: A otimização da sônica para cada tipo de célula e lote resultará no melhor rendimento chip-exo. Para 2 x 107 células neuronais do camundongo, 20-30 ciclos de sônica nas configurações mencionadas fragmentarão a cromatina na faixa de 100-500 bp. - Após a sônicação ser concluída, transfira todos os tubos supernacidos (lises sônicas), de cada amostra, para tubos de 1,5 mL. Adicione 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-yl)phenoxy]etanol) a cada amostra em uma concentração final de 1%. Misture por pipetação.
- Para detritos celulares de pelotas, centrífuga amostras a 13.500 x g por 10 min a 4 °C. Transfira todos os lises sonicadas (supernascentes) de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
- Pegue 30 μL de lise sônica de cada amostra (~3% de lise sônica) e adicione a novos tubos de 1,5 mL para verificar a sônicação. Armazene os lises sonicadas restantes a 4 °C até ficarem prontos para incubação com contas revestidas de anticorpos.
4. Verificando a sônica
- Faça 20 mL de tampão 2x proteinase K adicionando 2 mL de 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mL de 0,5 M EDTA, 10 mL de 10% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) e 6 mL de ddH2O autoclavado. Não adicione o IPC a este buffer. Armazene em tubo de 50 mL na RT.
- Para reverter o crosslink proteína-DNA, removendo as proteínas, pegue os 30 μL de cromatina sônica de cada amostra (a partir do passo 3,6), adicione 166 μL de ddH2O autoclaved, 200 μL de tampão K proteinase 2x e 4 μL de 20 mg/mL proteinase K. Brevemente vórtice das amostras, e, em seguida, incubar a 65 °C por 1-3 h a 24 x g.
- NOTA: Os lises sonicadas podem ser cruzados reversos a 65 °C durante a noite.
- Extrair DNA utilizando PCIA (25:24:1) e método de precipitação de etanol da seguinte forma.
ATENÇÃO: PCIA é tóxico. Use sob um capô de fumaça com equipamento de proteção individual padrão (EPI).- Adicione 400 μL de PCIA a cada amostra em tubos de 1,5 mL, coloque vórtice à velocidade máxima e amostras de vórtice para 20 s. Centrifugar a 18.400 x g por 6 min no RT. Duas fases serão observadas. Transfira cuidadosamente a camada aquosa superior (fase clara) de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
- Adicione 1 μL de 10 mg/mL RNase A. Incubar amostras a 37 °C por 30 min.
- Adicione 1 μL de 20 mg/mL de glicogênio a cada amostra e, em seguida, precipitar com 1 mL de etanol gelado 100% (armazenado em um congelador de -20 °C). Misture brevemente, depois incubar amostras no congelador de -80 °C por 30 minutos a 1 h. Centrífuga amostras a 18.400 x g por 10 min a 4 °C e despeje cuidadosamente 100% etanol.
- Lave as pelotas com 500 μL de etanol gelado 70% (armazenado em um congelador de -20 °C). Centrifugar a 18.400 x g por 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente 70% de etanol.
- Incubar amostras em tubos de 1,5 mL a 50 °C até que o etanol restante seja evaporado. Resuspend pelotas de DNA em 15 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O livre de nuclease.
- Execute as amostras de DNA extraídas, juntamente com uma escada de DNA, em um gel de 1,5% de agarose a 120-180 V e verifique o tamanho do DNA sonicado.
5. Incubação de anticorpos com contas
NOTA: As seguintes etapas deste protocolo são para aproximadamente 2 x 107 células neuronais diferenciadas das células ES do mouse. Não congele e descongele contas magnéticas em nenhum momento durante o protocolo ChIP-exo, pois as contas podem rachar causando contaminação da amostra ou o desempenho do anticorpo pode ser comprometido.
- Após a lise celular e a sônica, prepare as contas magnéticas Protein G(Tabela de Materiais)para ChIP, misture contas magnéticas até homogêneas e adicione 25 μL de contas magnéticas a tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL.
NOTA: O tipo de contas magnéticas utilizadas dependerá da espécie dos anticorpos. - Lave as contas com 1 mL de solução de bloqueio(Tabela 2),misture bem, depois coloque em um rack magnético por 1 min. Enquanto ainda estiver em um rack magnético, remova o supernascente quando estiver claro.
- Adicione 1 mL de solução de bloqueio às contas magnéticas. Tubos de rocha por 10 min a 4 °C em uma plataforma de balanço. Gire brevemente, em seguida, coloque tubos em um rack magnético e remova supernaspeuta.
- Repita o passo 5.3 mais duas vezes.
- Adicione 500 μL de solução de bloqueio às contas magnéticas. Gire brevemente o anticorpo contra Isl1 (0,04 μg/μL, Tabela de Materiais), em seguida, adicione 4 μg de anticorpo aos tubos de baixa ligação de proteína correspondentes de 2 mL contendo as contas magnéticas na solução de bloqueio.
- Repita o passo 5.5 sem anticorpo (ou seja, o controle sem anticorpos para ChIP).
NOTA: A quantidade de anticorpos a adicionar pode ser determinada empiricamente considerando a qualidade do anticorpo e o número de células utilizadas para ChIP. - Amostras de rocha a 4 °C por 6-24 h em uma plataforma de balanço.
6. Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
- Lave as contas revestidas de anticorpos da etapa 5.8 com 1 mL de solução de bloqueio. Coloque amostras em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Remova o supernanato.
- Repita o passo 6.1 mais duas vezes.
- Resuspend contas revestidas de anticorpos em 50 μL de solução de bloqueio, em seguida, transferir para novos tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL. Para cada amostra de ChIP, adicione lises sonicadas (~1,0 mL da etapa 3.6) às contas revestidas de anticorpos em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL.
- Incubar cada amostra em uma plataforma de balanço durante a noite a 4 °C.
7. Lavagens chip
NOTA: Mantenha amostras no gelo ou a 4 °C para manter a ligação entre proteínas e DNA durante as lavagens chip.
- Faça tampão de lavagem de sal alto, tampão de lavagem LiCl e tampão Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4) conforme descrito na Tabela 3. Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque de 1000x iPC a todos os buffers pouco antes de usar.
- Gire brevemente amostras em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL para coletar líquido das tampas, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o supernante cuidadosamente com uma pipeta.
- Para as lavagens chip, adicione 1 mL de tampão de lise 3 (a 4 °C) a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem de sal alto a frio em cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem licl frio a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
- Adicione 1 mL de tampão Tris-HCl frio de 10 mM (pH 7.4) a cada tubo. Misture em uma plataforma de balanço a 4 °C por 5 min. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
NOTA: O buffer Tris-EDTA (pH 8.0) pode ser usado em vez do buffer Tris-HCl (pH 7.4). - Repita as etapas 7.4-7.6 três vezes.
- Transfira as contas de amostra com 500 μL de tampão Tris-HCl (pH 7.4) para tubos frescos de 1,5 mL. Gire brevemente amostras, em seguida, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenatário com uma pipeta.
8. Reparação final e reação de cauda dA em contas
NOTA: A sônica muitas vezes gera dsDNA não contundente. Uma reação de reparação final é necessária para fazer DNA sem corte antes da reação de cauda dA seguida pela etapa de ligadura do adaptador de índice. Para ligação de DNA final pegajoso com DNA adaptador de índice, dATP é adicionado à extremidade de 3' de um fragmento dsDNA bruto pela reação de cauda dA. A mistura de reação de preparação final contém dATP.
- Após as lavagens chip, adicione 38 μL de ddH2O autoclaved às contas de amostra em tubos de 1,5 mL para reparo final e reação de cauda dA.
- Adicione 5,6 μL de mix de reação de preparação final e 2,4 μL de mistura de enzima de preparação final(Tabela de Materiais) a cada amostra (volume total de reação: 46 μL). Incubar amostras a 20 °C por 30 min.
- Lave as contas como descrito nas etapas anteriores de lavagem chip 7.4-7.6.
9. Ligante adaptador de índice em contas
NOTA: O adaptador de índice tem de 6 a 10 bases de sequências de índices com código de barras, específicas de uma determinada amostra usada para multiplexar múltiplas amostras em sequenciamento de alto rendimento. As sequências de DNA do adaptador de índice são descritas na Tabela 1.
- Para ligadura adaptadora de índice, adicione 27 μL de tampão Tris-HCl frio de 10 mM (pH 7.4) às contas de amostra. Adicione 2 μL de adaptador de índice de 15 μM, 0,5 μL de melhorador de ligadura e 15 μL de mix mestre ligase(Tabela de Materiais) a cada amostra (volume total de reação: 44,5 μL).
- Incubar amostras a 20 °C por 15 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.
10. Reação de preenchimento em contas
NOTA: Após a ligadura do adaptador, não há ligação de fosfodiester entre a extremidade de 5' do adaptador e a extremidade de 3' do DNA ChIP. O corte pode ser reparado por uma reação de preenchimento.
- Adicione 47 μL de tampão tris-hcl frio de 10 mM (pH 7.4) às contas de amostra.
- Faça a mistura de reação de preenchimento(Tabela 4 e Tabela de Materiais) no gelo.
- Adicione 11,1 μL de mistura de preenchimento a cada amostra (volume total de reação: 58,1 μL). Incubar amostras a 30 °C por 20 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.
11. Digestão exonuclease lambda em contas
- Após a reação de preenchimento nas contas, adicione 50 μL de ddH2O autoclaved a frio às contas de amostra.
- Para digerir o DNA ChIP na direção de 5' a 3', adicione 6 μL de tampão exonuclease lambda 10x e 2 μL de exonuclease lambda de 5 U/μL(Tabela de Materiais,volume total de reação: 58 μL). Incubar amostras a 37 °C por 30 min. Lave contas como descrito nas etapas 7.4-7.6.
12. Elução e crosslinking reverso
- Faça buffer de eluição ChIP conforme descrito na Tabela 5.
NOTA: Não adicione o IPC ao buffer de eluição ChIP. - Para elute amostras chIP das contas, resuspensar amostras em 75 μL de tampão de elução ChIP e incubar a 65 °C por 15 min a 130 x g.
- Adicione 2,5 μL de 20 mg/mL proteinase K(Tabela de Materiais) às amostras. Brevemente vórtice, em seguida, incubar as amostras durante a noite a 65 °C.
13. Extração de DNA
- Depois que as amostras incubaram durante a noite a 65 °C, gire brevemente amostras, coloque em um rack magnético por 1 min, em seguida, transfira o supernante de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
- Adicione 1 μL de 10 mg/mL RNase A às amostras. Brevemente vórtice, em seguida, incubar as amostras a 37 °C por 30 min. Adicione ~25 μL de ddH2O autoclaved a volume de até 100 μL.
- Purificar o DNA usando contas magnéticas(Tabela de Materiais). DNA eluto com 16 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O sem nuclease.
14. Denaturação, ressarem e primer extensão
- Após a elução chip e crosslinking reverso, transfira 16 μL das amostras de DNA extraídas da etapa 13.3 para os tubos PCR.
- Faça mistura de desnaturação e relagem de primer(Tabela 6 e Tabela de Materiais) no gelo. Adicione 1,2 μL de mistura de desnaturing e primer a cada amostra (volume total de reação: 17,2 μL). Execute amostras usando o programa descrito na Tabela 6 para desnaturar e renastilizar primers para o DNA modelo.
- Faça a mistura de extensão de primer(Tabela 7 e Tabela de Materiais) no gelo.
- Uma vez que o programa de desnaturação e primers anneal esteja completo, adicione 3 μL de mix de extensão de primer às amostras (volume total de reação: 20,2 μL). Execute amostras usando o programa para extensão de primer descrita na Tabela 7.
- Proceda imediatamente para a reação de rabo-de-dA.
15. reação de cauda dA
NOTA: Para a ligadura de DNA final pegajoso com DNA adaptador universal, o dATP é adicionado à extremidade de 3' de dsDNA sem corte pela reação de cauda dA.
- Faça mistura de rabo-dA(Tabela 8 e Tabela de Materiais) no gelo.
- Adicione 4,1 μL de mistura de cauda dA a cada amostra (volume total de reação: 24,3 μL). Execute amostras utilizando o programa para dA-tailing(Tabela 8).
- Imediatamente proceda à ligadura universal do adaptador.
16. Ligadura universal do adaptador
NOTA: O adaptador universal inclui sequências específicas de sequenciamento de alto rendimento para reconhecimento de amostras de DNA para química de sequenciamento. As sequências universais de DNA do adaptador são descritas na Tabela 1.
- Após a reação de cauda dA, faça mistura universal de ligadura adaptador (Tabela 9 e Tabela de Materiais) para ligadura universal de adaptador.
- Adicione 21,5 μL a cada amostra (volume total de reação: 45,8 μL) e incuba amostras por 15 min a 20 °C.
17. Limpeza de DNA
- Purificar o DNA usando contas magnéticas(Tabela de Materiais). DNA eluto com 21 μL de ddH2O autoclaved ou ddH2O sem nuclease.
- Armazene amostras a -20 °C até que estejam prontas para realizar a purificação de PCR (LM-PCR) e pcr mediadas por ligadura.
18. PCR mediado por ligadura
NOTA: As sequências de primer LM-PCR são descritas na Tabela 1.
- Após a limpeza do DNA, faça mistura LM-PCR(Tabela 10 e Tabela de Materiais) no gelo.
- Adicione 29 μL de mistura LM-PCR a cada amostra (volume total de reação: 50 μL) e execute amostras utilizando o programa para LM-PCR(Tabela 10).
- Imediatamente proceder à purificação de gel de DNA amplificado pcr, seguido de purificação de DNA para sequenciamento de alto rendimento.
19. DNA purificação do DNA amplificado LM-PCR
- Execute as amostras de DNA amplificadas LM-PCR, juntamente com uma escada de DNA, em um gel de 1,5% de agarose a 120-180 V e extirma bandas de 200-400 bp.
- Purificar o DNA do gel excisado utilizando um kit de extração de gel(Tabela de Materiais).
- Após a purificação do DNA, verifique a concentração(Tabela de Materiais) de cada amostra da biblioteca ChIP-exo. Envie amostras para sequência de alta taxa para sequência de leitura única.
NOTA: O comprimento de leitura preferido para sequenciamento de leitura única é de pelo menos 35 bp, o que é suficiente para alinhar exclusivamente as leituras de sequenciamento ao genoma de referência em células do camundongo ou humano. Para a maioria dos fatores de transcrição em células de camundongos ou humanos, 10-20 milhões de leituras por amostra chip-exo são suficientes para identificar seus locais de ligação genômica. Pelo menos 30 milhões de leituras por amostra são necessárias para mapear regiões genômicas enriquecidas em marcas de histona em células de mamíferos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2A ilustra os resultados da sônica após alise celular e a sônicação, com vários ciclos, de células de neurônios motores diferenciadas das células ES do camundongo. O número ideal de ciclos de sônicação (por exemplo, 12 ciclos na Figura 2A) gerou forte intensidade de DNA em fragmentos de DNA de 100-400 bp. Bibliotecas ChIP-exo de alta qualidade são baseadas no tamanho e quantidade de DNA de cromatina fragmentada. Assim, recomenda-se a otimização da sônica para cada tipo de célula e lote de células antes de iniciar o ChIP-exo.
A Figura 2B mostra produtos PCR mediados por ligadura (LM-PCR) das amostras de DNA ChIP-exo amplificadas por ciclos de 18-21 PCR. O LM-PCR amplifica fragmentos de DNA ChIP-exo que são ligados com adaptadores de DNA para sequenciamento de próxima geração. O primer PCR faz parte das sequências do adaptador de DNA. O tamanho dos fragmentos de DNA sonicados é de cerca de 100-400 bp(Figura 2A). Após a digestão da exonuclease lambda, o tamanho dos fragmentos de DNA se tornaria o tamanho médio do material inicial (50-200 bp). Aproximadamente 125 bp de adaptadores de DNA foram ligados aos fragmentos de DNA ChIP-exo assim, o tamanho esperado dos produtos LM-PCR é de 175-325 bp. O número mínimo de ciclos PCR enquanto ainda é suficiente para amplificar a biblioteca ChIP-exo, são realizados para evitar a amplificação excessiva do DNA ChIP-exo.
Aqui, ChIP-exo para Isl1 foi realizado em neurônios motores derivados de células ES do mouse. Isl1 é um fator de transcrição de programação de neurônios motores, que é especificamente expresso em neurônios motores pós-micóticos. Os resultados do Isl1 ChIP-exo mostram quantidades significativas de 200-400 bp LM-PCR amplificado CHIP-exo DNA(Figura 2B). A banda de cerca de 100 bp indica artefatos PCR de adaptadores e primers PCR. Executar um controle sem anticorpos ao lado de uma amostra experimental também é importante para garantir que o DNA de fundo não específico foi digerido pelo tratamento de exonuclease lambda. Como exemplo, identificamos locais vinculados ao Isl1 em neurônios motores derivados de células ES do mouse usando ChIP-exo e ChIP-seq(Figura 3). O sinal ChIP-exo estava altamente focado em locais de ligação isl1, detectando vários padrões de vinculação do fator de transcrição Isl1 agrupados. O sinal ChIP-seq exibiu sinais mais amplos, indicando que o ChIP-exo de Isl1 tem resolução de mapeamento maior do que o ChIP-seq de Isl1.
Figura 1: Esquema do protocolo ChIP-exo. Após o ChIP (etapas 1-7), as reações de reparo final e de cauda dA tornam o DNA chip encerrado sem cortes adicionando um grupo de fosfato à extremidade de 5' do DNA e adicionando dATP à extremidade de 3' do DNA (passo 8). Extremidades sonicadas do DNA ChIP, nas contas são ligadas com o adaptador de índice (passo 9). Após a reação de preenchimento, o DNA adaptador com a saliência de 5' torna-se blunt-ended (passo 10). Lambda exonuclease digere o DNA sonicado de 5' a 3' até os pontos de crosslinking de proteína (TF)-DNA (passo 11). Após elução, cruzamento reverso e extração de DNA (etapas 12 e 13), o DNA desnaturado de um único fio é feito duplamente encalhado pela extensão do primer PCR de índice (passo 14), seguido pelo rabo-de-rabo de dA (passo 15). O adaptador universal é então ligado ao final tratado de exonuclease (passo 16). A biblioteca resultante é limpa, amplificada por PCR e submetida ao sequenciamento de próxima geração (etapas 17-19). Mapear as extremidades de 5' das tags de sequenciamento resultantes ao genoma de referência demarca a barreira exonuclease e, portanto, o local preciso da ligação entre proteínas e DNA.
Figura 2: Amplificação de Sonication e LM-PCR de uma biblioteca ChIP-exo. (A)1,5% de gel de agarose do DNA sonicado eletroforosado. 12, 18 e 24 ciclos de sônica foram conduzidos para encontrar ciclos de sônica ideal para 2 x 107 células de neurônios motores derivados de células ES do mouse. Após a sônica, a amostra de DNA foi cruzada reversa, e extraída por PCIA e precipitação de etanol. Cada amostra continha 4 x 105 equivalentes celulares, o que equivale a 2% das células sônicas. 12 ciclos de sônica produziram um maior rendimento de DNA sônico com o tamanho desejado (100-500 bp). (B) 1,5% de gel de agarose de bibliotecas chip-exo eletrofosadas após 18-21 ciclos de LM-PCR para nenhum controle de anticorpos (No Ab) e Isl1 em neurônios motores derivados de células ES do mouse. Cada amostra continha 10 x 106 células equivalentes a neurônios motores do rato. O resultado sem anticorpos ChIP-exo (pista 2) demonstra que o DNA não específico e contaminante é eliminado pela exonuclease lambda. As bibliotecas ChIP-exo para Isl1 (pista 3) mostram bibliotecas de DNA amplificadas em torno de 200-400 bp, indicando que as bibliotecas ChIP-exo foram amplificadas com sucesso pelo PCR mediado por ligaduras adaptadoras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de ChIP-exo com ChIP-seq para Isl1 em loci específico. As parcelas preenchidas azul e vermelha mostram a distribuição de etiquetas de sequenciamento para locais vinculados a ChIP-seq e ChIP-exo Isl1, respectivamente, proximal ao gene Slit3 e Fgfr1 em neurônios motores espinhais nascentes diferenciados das células ES do rato.
Tabela 1: Oligonucleotídeos usados neste protocolo.
| Nome Oligo | Comprimento (nt) | Seqüência | Nota | |||||
| Adaptador de índice para a frente* | 66 | 5'/PHOS/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | Fosfato de 5' (XXXXXXXX), 3' T-overhang | |||||
| Adaptador de índice-reverso* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Adaptador de ligadura* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3' | ||||||
| Adaptador de ligadura- reverso* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Primer do Index PCR* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Primer PCR universal* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Os adaptadores de sequenciamento acima e os primers PCR são projetados para as plataformas de sequenciamento Illumina HiSeq e NextSeq. | ||||||||
Tabela 2: Receitas para tampões de lise 1-3 e tampão de bloqueio. Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de 1000x de iPC (inibidor completo de protease) a todos os buffers pouco antes de usar.
| Tampão de lise 1 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% Glicerol | 10 | 10% |
| Etoxilato de octilfenol 10% | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-yl)fenoxi]etanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
| Tampão de lise 2 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
| Tampão de lise 3 | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| Ácido desoxicólico 10% | 0.5 | 0.10% |
| Solução de sal de sódio N-Lauroylsarcosina 30% | 0.83 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
| Solução de bloqueio | ||
| Reagente | Quantidade | [Final] |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 250 mgs | 0.50% |
| Inibidor completo de Protease (CPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Soro fisiológico tamponado fosfato (PBS) | Encha até 50 mL | |
Tabela 3: Receitas para lavagens chIP: tampão de lavagem de sal alto, tampão licl wash e tampão Tris-HCl de 10 mM (pH 7.4). Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque de 1000x iPC a todos os buffers pouco antes de usar.
| Tampão de lavagem de sal alto | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-yl)fenoxi]etanol | 5 | 1% |
| 5% ácido desoxicólico | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
| Tampão de lavagem LiCl | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| Etoxilato de octilfenol 10% | 2.5 | 0.50% |
| 5% ácido desoxicólico | 5 | 0.50% |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
| Tampão Tris-HCl de 10 mM | ||
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoclaved ddH2O | Preencha até 50 | |
Tabela 4: Mistura mestre de reação de preenchimento.
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| 20 mg/mL BSA | 0.6 | 0,2 mg/mL |
| 10x phi29 tampão de polimerase de DNA | 6 | 1x |
| DNTPs de 3 mM | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 POLImerase de DNA | 2 | 10 U |
| Volume de mix de reação | 11.1 |
Tabela 5: Receita para tampão de elução chip. Armazene em tubos de 50 mL na RT.
| Reagente | Volume (mL) | [Final] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8.0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8.0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoclaved ddH2O | até 50 mL |
Tabela 6: Desnaturação e Primer Annealing reação master mix e programa.
| Mistura de desnaturação e renas de primer | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| 20 mg/mL BSA | 0.2 | 0,2 mg/mL |
| DNTPs de 3 mM | 0.5 | 75 μM |
| Primer PCR de índice 10 μM | 0.5 | 0,25 μM |
| Volume de mix de reação | 1.2 | |
| Programa de desnaturação e renas de primer | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 95 | 5 min. | |
| 65 | 3 min. | |
| 60 | 3 min. | |
| 57 | 3 min. | |
| 54 | 3 min. | |
| 51 | 3 min. | |
| 30 | Sempre | |
Tabela 7: Primer Extensão reação master mix e programa.
| Mix de extensão primer | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| 10x phi29 tampão de polimerase de DNA | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 POLImerase de DNA | 1 | 75 μM |
| Volume de mix de reação | 3 | |
| Programa de extensão primer | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 30 | 20 min. | |
| 65 | 10 min. | |
| 4 | Sempre | |
Tabela 8: dA-Tailing reaction master mix e programa.
| mistura dA-Tailing | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Tampão de fragmentos de Klenow | 2.4 | 1x |
| 5 fragmento de Klenow U/μL | 1 | 5 U |
| Volume de mix de reação | 4.1 | |
| programa de tailing dA | ||
| Temperatura (°C) | Hora | |
| 37 | 30 min. | |
| 75 | 20 min. | |
| 4 | Sempre | |
Tabela 9: Mix de mestre de reação de ligadura universal.
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| Água autoclavada | 5 | |
| Adaptador universal de 15 μM* | 1 | 320 nM |
| Melhorador de ligadura | 0.5 | 1x |
| Mistura master de Ligase | 15 | 1x |
| Volume de mix de reação | 21.5 | |
| *A sequência de DNA do adaptador universal é descrita na Tabela 1. | ||
Tabela 10: Mistura e programa mestre pcr mediado por ligadura.
| Mistura LM-PCR | ||
| Reagente | 1x (μL) | [Final] |
| Primer PCR de índice 10 μM* | 2 | 0,2 μM |
| Primer PCR Universal 10 μM* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polimerase PCR master mix | 25 | 1x |
| Volume de mix de reação | 29 | |
| *As sequências de primer PCR são descritas na Tabela 1. | ||
| Programa LM-PCR | ||
| Temperatura (°C) | Hora | Ciclos |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15-25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 min. | 1 |
| 4 | Segurar | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste protocolo, o ChIP seguido pela digestão exonuclease é usado para obter bibliotecas de DNA para a identificação de interações proteína-DNA em células de mamíferos em resolução de mapeamento ultra-alta. Muitas variáveis contribuem para a qualidade do experimento ChIP-exo. Parâmetros experimentais críticos incluem a qualidade dos anticorpos, a otimização da sônica e o número de ciclos LM-PCR. Esses parâmetros experimentais críticos também são o que pode limitar os experimentos chip-exo e serão discutidos abaixo.
Em qualquer protocolo ChIP, a qualidade dos anticorpos é uma das considerações mais importantes. O uso de anticorpos de grau ChIP é recomendado para ChIP-exo. A qualidade do anticorpo pode ser verificada antes de realizar o protocolo ChIP-exo. ChIP-seq ou ChIP-qPCR podem ser usados para validar anticorpos de grau ChIP, confirmando locais específicos de ligação de DNA da proteína de interesse. Posteriormente, a otimização da concentração de anticorpos adicionados às contas é ideal para garantir que os complexos de PROTEÍNA-DNA sejam imunoprecipitados22,23.
A sônicação da cromatina é outro passo crítico no protocolo ChIP-exo. A sônicação é fundamental para o corte não específico da cromatina, necessária para a imunoprecipitação ideal para a proteína de interesse24. O tamanho e a quantidade de DNA sonicado dependem do número de ciclos de sônica. Uma alta concentração de DNA fragmentado é importante para garantir que o DNA suficiente seja imunopreciicionado à proteína de interesse para que uma biblioteca de DNA ChIP-exo seja criada. A obtenção de DNA fragmentado de 100-500 bp é ideal porque a resolução do ChIP-exo é melhor se os fragmentos de cromatina sonicated tiverem tamanhos de partida menores. Portanto, a sônica de cromatina ideal deve ser determinada para cada tipo e lote de células, variando o número de ciclos de sônica e tampões de sônica.
O parâmetro crítico final é obter a amplificação do DNA da biblioteca ChIP-exo com o número mínimo de ciclos LM-PCR para evitar a super-amplificação de artefatos PCR. Para determinar o número mínimo de ciclos de PCR para amplificar o DNA ChIP-exo, uma pequena porção de DNA ChIP-exo pode ser usada para executar vários ciclos pcr (por exemplo, 10, 15 e 20 ciclos) e comparar os produtos PCR.
O ChIP-exo tem muito mais passos do que um ChIP-seq tradicional e, como resultado, cada passo deve ser realizado com cuidado e precisão para que o protocolo ChIP-exo funcione. É importante ressaltar que o volume correto de cada reagente em reações enzimáticas deve ser adicionado a cada mix mestre de reação21. Assim, é recomendado criar uma planilha para calcular o volume de cada reagente necessário para cada mix mestre, em seguida, imprimir as tabelas e verificar cada reagente após a adição às misturas mestras. A excisão cuidadosa do DNA amplificado também é importante; fragmentos abaixo de 200 bp frequentemente contêm dimers adaptadores, que precisam ser removidos antes do sequenciamento da próxima geração.
Notavelmente, a maioria dos parâmetros e limitações críticas do ChIP-exo são idênticos aos do ChIP-seq. No entanto, ao contrário do ChIP-seq, o ChIP-exo oferece mapeamento de genoma de alta resolução com baixo fundo. Assim, o ChIP-exo é o método ideal para identificar interações proteicas e DNA precisas em uma variedade de sistemas e organismos, ajudando a revelar os papéis significativos das proteínas de ligação de DNA na célula. O método ChIP-exo descrito acima pode ser usado para examinar fatores de transcrição, marcas de modificação de histona e proteínas regulatórias de cromatina em células vivas em maior resolução de mapeamento do que chip-seq25,26,27. Além disso, o ChIP-exo pode detectar os locais de ligação individual de proteínas de ligação de DNA dentro de um cluster, enquanto o ChIP-seq não pode devido à sua resolução de mapeamento. É importante ressaltar que o ChIP-exo apresenta uma maior relação sinal-ruído em comparação com o ChIP-seq. Essas vantagens do ChIP-exo permitem identificar um conjunto abrangente de locais vinculados através do genoma. Este protocolo fornecerá uma base para pesquisadores interessados em examinar locais de ligação de DNA de várias proteínas em todo o genoma em resolução próxima de par de bases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao membro do laboratório Rhee por compartilhar dados inéditos e discussões valiosas. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) que concede RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
