Summary
Точное определение белково-связывающих мест в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Здесь мы описываем метод геномного картирования, который лечит хроматин-иммунопреципиентированную ДНК с помощью пищеварения экзонуклеазы (ChIP-exo), за которым следует секвенирование высокой пропускной способности. Этот метод обнаруживает взаимодействие белка и ДНК с почти разрешением отображения базовой пары и высоким соотношением сигнала к шуму у нейронов млекопитающих.
Abstract
Определение специфических взаимодействий белка и ДНК в геноме имеет важное значение для понимания регуляции генов. Иммунопреципиентация хроматина в сочетании с высокопрофильным секвенированием (ChIP-seq) широко используется для определения геномных связывающих мест связывания ДНК-связывающих белков. Однако метод ChIP-seq ограничен своей неоднородностью в длине звуковых фрагментов ДНК и неспецифической фоновой ДНК, что приводит к низкому разрешению карт и неопределенности в местах связывания ДНК. Чтобы преодолеть эти ограничения, сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) использует от 5' до 3' пищеварения экзонуклеазы, чтобы обрезать неоднородно размера иммунопрециозной ДНК к белково-ДНК кроссссылки сайта. Экзонуклеазное лечение также устраняет неспецифическую фоновую ДНК. Подготовленная к библиотеке и экзонуклеазная ДНК может быть отправлена для секвенирования с высокой пропускной способностью. Метод ChIP-exo позволяет почти базовое разрешение отображения с большей чувствительностью обнаружения и уменьшенным фоновым сигналом. Оптимизированный протокол ChIP-exo для клеток млекопитающих и секвенирования следующего поколения описан ниже.
Introduction
Расположение белково-ДНК-взаимодействий дает представление о механизмах регуляции генов. Хроматин иммунопреципиентации в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования (ChIP-seq) был использован в течение десяти лет для изучения генома всей белково-ДНК взаимодействия вживых клетках 1,2. Тем не менее, метод ChIP-seq ограничен неоднородностью в фрагментации ДНК и несырьемого загрязнения ДНК, которые приводят к низкому разрешению отображения, ложным срабатываниям, пропущенным вызовам и неспецифическому фоновому сигналу. Сочетание ChIP с пищеварением экзонуклеазы (ChIP-exo) улучшает метод ChIP-seq, обрезая ДНК ChIP к точкам скрещивания белка-ДНК, обеспечивая почти разрешение базовой пары и низкий фоновыйсигнал 3,4,5. Значительно улучшенное разрешение отображения и низкий фон, предоставляемый ChIP-exo, позволяют определить точные и всеобъемлющие места связывания белковой ДНК по всему геному. ChIP-exo способен выявить функционально различные ДНК-связывающие мотивы, совместные взаимодействия между транскрипционными факторами (TF), и несколько белково-ДНК перекрестных сайтов в определенном геномном месте связывания, не обнаруживаемых другими методамигеномного картирования 3,4,6,7.
ChIP-exo первоначально был использован в начинающих дрожжей для изучения последовательности конкретных ДНК связывания TFs, для изучения точной организации транскрипции до начала комплекса, и суб-нуклеосомной структуры отдельных гистонов черезгеном 4,8,9. С момента своего введения в 2011году 4, ChIP-экзо был успешно использован во многих других организмах, включая бактерии,мыши, и человеческие клетки 7,10,11, 12,13,14,15,16,17. В 2016 году Rhee et al.14 впервые использовали ChIP-exo в нейронах млекопитающих, чтобы понять, как поддерживается экспрессия генов нейронов после регулирования программирования TF Lhx3, который образует гетенодимерный комплекс с другим программированием TF Isl1. Это исследование показало, что в отсутствие Lhx3, Isl1 набирается на новые усилители нейронов связаны Onecut1 TF для поддержания экспрессии генов нейронального эффектора. В этом исследовании, ChIP-экзо показал, как несколько TFs динамически распознают тип клетки и клеточной стадии конкретных элементов РЕГУЛИРОВАНИЯ ДНК в комбинаторной образом при почти нуклеотидного отображения резолюции. Другие исследования также использовали метод ChIP-exo, чтобы понять взаимодействие белков и ДНК в других линиях клеток млекопитающих. Han et al.7 использовали ChIP-exo для изучения генома всей организации GATA1 и TAL1 TFs в клетках эритроидов мыши с помощью ChIP-exo. Это исследование показало, что TAL1 непосредственно набирается в ДНК, а не косвенно через белково-белковые взаимодействия с GATA1 на протяжении всей эритроидной дифференциации. Недавние исследования также использовали ChIP-экзо для профиля генома всей связывающих местах CTCF, РНК Полимераза II, и гистон знаки для изучения эпигеномных и транскрипционных механизмов вчеловеческих клеточных линий 18,19.
Есть несколько версий протокола ChIP-exo доступны3,5,20. Тем не менее, эти протоколы ChIP-exo трудно следовать для исследований, которые не знакомы с подготовкой библиотеки последовательности следующего поколения. Отличная версия протокола ChIP-exo была опубликована с простыми инструкциями и видео21, но содержала много энзиматических шагов, которые требуют значительного количества времени для завершения. Здесь мы сообщаем о новой версии протокола ChIP-exo, содержащей уменьшенные энзиматические шаги и инкубационые времена, а также объяснения для каждого энзиматичногошага 21. Конечный ремонт и dA-хвостовые реакции объединяются в один шаг с использованием фермента энд-подготовки. Время инкубации для этапов перевязки индекса и универсального адаптера сокращается с 2 ч до 15 мин с помощью усилителя перевязки. Реакция киназы после шага перевязки адаптера индекса, описанного в предыдущем протоколе ChIP-exo, удаляется. Вместо этого, фосфатная группа добавляется во время синтеза ДНК олиго к одному из 5' концов адаптера индекса(таблица 1), который будет использоваться для шага пищеварения экзонуклеазы лямбды. В то время как предыдущий протокол ChIP-exo использовал переваривание exonuclease RecJf для устранения одноядерных загрязнителей ДНК, этот шаг пищеварения удаляется здесь, потому что он не имеет решающего значение для качества библиотеки ChIP-exo. Кроме того, для очистки обратной поперечной ДНК после элюции ChIP вместо метода извлечения фенола:хлороформа:изоамилового спирта (PCIA) используется метод очистки магнитных бусин. Это сокращает время инкубации ДНК-извлечения. Важно отметить, что он удаляет большинство адаптер димеров, сформированных во время перевязки адаптера индекса, что может повлиять на эффективность перевязки опосредованного ПЦР.
Представленный здесь протокол ChIP-exo оптимизирован для обнаружения точных взаимодействий белка и ДНК в нейронах млекопитающих, дифференцированных от клеток эмбрионального ствола мыши (ES). Кратко, собранные и перекрестные нейронные клетки лизированы, чтобы позволить хроматин подвергаться sonication, а затем sonicated так, что соответствующие размеры фрагментов ДНК получены (Рисунок 1). Бусы с покрытием антител затем используются для селективного иммунопреципитата фрагментированного, растворимого хроматина к интересному белку. В то время как иммунопрофилированная ДНК все еще находится на бисере, проводится конечный ремонт, перевязка секвенирования адаптеров, реакция заполнения и шаги пищеварения лямбда экзонуклеазы от 5' до 3' lambda exonuclease. Этап пищеварения экзонуклеазы дает ChIP-exo его сверхвысокое разрешение и высокое соотношение сигнала к шуму. Lambda exonuclease обрезает иммунопрофилированные ДНК несколько базовых пар (bp) от перекрестного сайта, в результате чего загрязняющих ДНК будет деградировать. Экзонуклеазы обработанных ChIP ДНК eluted из антител покрытием бисера, белка-ДНК перекрестные обратные, и белки деградируют. ДНК извлекается и денатурирована до одной нити ДНК ChIP, а затем грунтовка annealing и расширение, чтобы сделать двойную мель ДНК (dsDNA). Далее проводится перевязка универсального адаптера к экзонуклеазным концам. Полученная ДНК очищается, затем ПЦР усиливается, очищается гелем и подвергается секвенированию следующего поколения.
Протокол ChIP-exo длиннее протокола ChIP-seq, но не очень технически сложный. Любая успешно иммунопрофилированная ДНК ChIP может быть подвергнута ChIP-экзо, с несколькими дополнительными энзиматичными шагами. Заметные преимущества ChIP-exo, такие как сверхвысокое разрешение отображения, уменьшенный фоновый сигнал и снижение ложноположительного и отрицательного, в отношении сайтов связывания геномных, перевешивают стоимость времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав дистиллированной и деионизированной воды (ddH2O) рекомендуется для изготовления буферов и реакции мастер смеси. Разделы 1–4 описывают клеточный лиз и соникацию, разделы 5–7 описывают иммунопреципитацию хроматина (ChIP), разделы 8–11 описывают энзиматические реакции на бисер, разделы 12 и 13 описывают элюцию и очищение ДНК ChIP, а разделы 14–19 описывают подготовку библиотеки.
1. Сбор и скрещивание ячеек
- После дифференциации клеток мыши ES в постмитотические нейроны, добавьте 11% формальдегида к собранным клеткам к окончательной концентрации 1% (v/v). Рок-клетки на качалке платформы (рокер, шейкер, или ротатор) в течение 15 мин, при комнатной температуре (RT, 25 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от целевого белка, который будет перекрестным, менее формальдегид перекрестного (например, окончательная концентрация 0,5%) или двойной перекрестной связи с disuccinimidyl глутарат (DSG) могут быть использованы. - Добавьте 2,5 Мглицина в окончательную концентрацию 150 мМ, чтобы остановить перекрестную реакцию. Рок-клетки на качалки платформы на RT, в течение 5 минут.
- Центрифуга перекрестных клеток в 15 мл конических труб на RT, в течение 6 мин, на 1350 х г. Аспирировать раствор, затем повторно помыть клетки в 5 мл 1x фосфат-буферного солевого раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрестные клеточные гранулы могут храниться при -80 градусов по Цельсию после флэш-замораживания жидким азотом.
2. Клеточныйлиз
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе для примерно 2 х 107 нейронных клеток дифференцированы от мыши ES клеток. Для взлома открытых ячеек будут использоваться буферы лиза, содержащие различные моющие средства. Добавьте 50 мкл полного ингибитора протеазы (ИПЦ) в 50 мл буфера непосредственно перед использованием.
- Подготовка буферов лиза 1'3, как описано в таблице 2.
- Оттепель перекрестные гранулы клеток на льду, затем тщательно повторного перерасхода клеточных гранул в 3 мл лиза буфера 1 в 15 мл конических труб. Рок при 4 градусов по Цельсию в течение 15 минут на качалки платформы. Центрифуга при 1350 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и аспирировать супернатант.
- Тщательно перерасходовать гранулы клеток в 3 мл лиза буфера 2. Рок при 4 градусов по Цельсию в течение 10 минут на качалки платформы. Центрифуга при 1350 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и аспирировать супернатант.
- Добавьте 1 мл буфера лиза 3 к каждой грануле, а затем держите на льду. Немедленно приступайте к sonication.
3. Соникирующий хроматин
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду или при 4 градусах по Цельсию во время этой звуковой процедуры, чтобы уменьшить разворот поперечной связи.
- Используя стерильный шпатель, добавьте звуковые бусины(Таблица материалов)до градации 0,2 мл на 15 мл полистирола труб. Вымойте sonication шарики вихрем в 600 йл 1x PBS до тех пор, пока сухие пятна не видны. Центрифуга труб для 5 с при 30 х г и аспирировать 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Sonication в полистирол труб является более эффективным, чем sonication в полипропилевых труб. Если меньшее количество клеток (например, lt;106 клеток) sonicated, используйте 1,5 мл полистирола трубки без добавления sonication шарики. - Тщательно повторное использование ядерных лизатов в 1 мл лиза буфера 3 (из шага 2.4), а затем передать 15 мл полистирола труб, содержащих sonication шарики. Кратко вихрь полистирола труб.
- Для фрагментации перекрестной ДНК хроматина, sonicate ядерных лизолирует при 4 градусов по Цельсию для оптимизированного числа циклов, с амплитудой мощности на 30 Вт, и звуковые циклы установлены до 30 с на / 30 с выключен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация звуковой данных для каждого типа ячейки и партии приведет к лучшей доходности ChIP-exo. Для 2 х 107 нейронных клеток мыши, 20-30 циклов звуковой связи в упомянутых настройках будет фрагмент хроматина в диапазоне от 100 до 500 bp. - После того, как sonication будет завершена, перенесите все супернатанты (звуковые лизолаты) из каждого образца в трубы 1,5 мл. Добавьте 10% 2-4-(2,4,4-триметилпентан-2-yl)фенокси-этанол) к каждому образцу при конечной концентрации 1%. Смешайте с помощью пипетки.
- Для гранул клеточного мусора, образцы центрифуги при 13500 х г в течение 10 мин при 4 градусов по Цельсию. Перенесите все звуковые лизолаты (супернатанты) из каждого образца в новые трубы 1,5 мл.
- Возьмите 30 МКЛ sonicated лизата из каждого образца (3% от sonicated лисата) и добавить к новым 1,5 мл труб для проверки звуковой. Храните оставшиеся sonicated лисаты при 4 градусов по Цельсию до готовности к инкубации с антителами покрытием бисера.
4. Проверка звуковой данных
- Сделайте 20 мл буфера 2x протеиназы K, добавив 2 мл 0,5 мл Tris-HCl (рН 8,0), 2 мл 0,5 мл EDTA, 10 мл 10% додекилового сульфата натрия (SDS) и 6 мл автоклавногоddH 2O. Не добавляйте ИПЦ в этот буфер. Хранить в 50 мл трубки на RT.
- Чтобы обратить вспять перекрестье белка-ДНК, удалив белки, возьмите 30 МКЛ звукового хроматина из каждого образца (из шага 3.6), добавьте 166 МКЛ автоклавированного ddH2O, 200 л 2x протеиназы K буфера и 4 л 20 мг/мл протеиназы K. Кратко вихрь образцов, а затем инкубировать при 65 КК для 1'3 ч при 24 х г.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Звуковые лисаты могут быть отменены поперечным при 65 градусов по Цельсию в одночасье.
- Извлекайте ДНК с помощью PCIA (25:24:1) и метода выпадения этанола следующим образом.
ВНИМАНИЕ: PCIA является токсичным. Используйте под дымовой капот со стандартным защитным оборудованием (СИЗ).- Добавьте 400 МКЛ PCIA к каждому образцу в трубах объемом 1,5 мл, установите вихрь на максимальную скорость и образцы вихрей на 20 с. Центрифуга на 18400 х г в течение 6 мин на RT. Будут наблюдаться два этапа. Тщательно перенесите верхний aqueous слой (четкая фаза) каждого образца к новым трубам 1.5 mL.
- Добавьте 1 мл 10 мг/мл RNase A. Инкубационые образцы при 37 градусах Цельсия в течение 30 мин.
- Добавьте 1 л гликогена 20 мг/мл в каждый образец, затем осадок с 1 мл ледяного 100% этанола (хранится в морозильной камере -20 градусов по Цельсию). Смешайте кратко, затем инкубировать образцы в -80 градусов по Цельсию морозильник в течение 30 мин до 1 ч. Образцы центрифуг при 18 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия и тщательно выливают 100% этанола.
- Вымойте гранулы с 500 л ледяного этанола 70% (хранится в морозильной камере -20 градусов по Цельсию). Центрифуга при 18 400 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аккуратно вылейте 70% этанола.
- Инкубационые образцы в трубах 1,5 мл при 50 градусах Цельсия до тех пор, пока оставшийся этанол не испарится. Гранулы ДНК resuspend в 15 йл autoclaved ddH2O или nuclease-свободно ddH2O.
- Выпейте извлеченные образцы ДНК вместе с лестницей ДНК в 1,5% агарозного геля при частоте 120–180 В и проверьте размер звуковой ДНК.
5. Инкубация антител с бисером
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в этом протоколе для примерно 2 х 107 нейронных клеток дифференцированы от мыши ES клеток. Не замораживайте и не оттаивте магнитные бусы в любой момент во время протокола ChIP-exo, так как шарики могут треснуть, вызывая загрязнение образца или производительность антитела может быть скомпрометирована.
- После клеточного лиза и sonication, подготовить белок G магнитных бусин(Таблицаматериалов ) для ChIP, смешать магнитные бусы до однородной, а затем добавить 25 йл магнитных бусин до 2 мл белка низкой связывания труб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемых магнитных бусин будет зависеть от вида антител. - Вымойте шарики с 1 мл блокирующего раствора(таблица 2),хорошо перемешайте, затем поместите на магнитную стойку на 1 мин. Пока все еще на магнитной стойке, извлекните supernatant как только оно ясно.
- Добавьте 1 мл блокирующего раствора в магнитные бусы. Рок трубки в течение 10 минут при 4 градусов по Цельсию на качалки платформы. Кратко спина, а затем поместить трубки на магнитной стойке и удалить supernatant.
- Повторите шаг 5.3 еще два раза.
- Добавьте 500 МКЛ блокирующего раствора в магнитные бусины. Кратко закрутить антитело против Isl1 (0.04 мкг/йл, Таблица материалов), затем добавить 4 мкг антител к соответствующим 2 мл белка низких связующих труб, содержащих магнитные бусы в блокирующий раствор.
- Повторите шаг 5.5 без антител (т.е. без контроля антител для ChIP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител, чтобы добавить может быть определено эмпирически, учитывая качество антител и количество клеток, используемых для ChIP. - Образцы породы при 4 градусах Цельсия в течение 6-24 ч на платформе для качания.
6. Хроматин иммунопреципиентация (CHIP)
- Вымойте бисер с покрытием антител из шага 5.8 с 1 мл блокирующего раствора. Поместите образцы на платформу для качания при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Удалите супернатант.
- Повторите шаг 6.1 еще два раза.
- Resuspend антител покрытием бисера в 50 йл блокирующего раствора, а затем перейти на новые 2 мл белка низкой связывания труб. Для каждого образца ChIP добавьте звуковые лизолаты (1,0 мл от шага 3.6) к бусинкам с покрытием антител в 2-миловых белках с низким содержанием связующих трубок.
- Инкубировать каждый образец на качалки платформы на ночь при 4 градусов по Цельсию.
7. ChIP моет
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы на льду или при 4 градусов по Цельсию для поддержания перекрестного скрещивания белка и ДНК во время стирки ChIP.
- Сделайте высокий буфер для мытья соли, буфер для мытья LiCl и буфер Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4), как описано в таблице 3. Хранить в трубках 50 мл при 4 градусах Цельсия. Добавьте 50 йл 1000-х запасов ИПЦ ко всем буферам непосредственно перед использованием.
- Кратко спина образцов в 2 мл белка низкой связывания труб для сбора жидкости из колпачков, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант тщательно с пипеткой.
- Для мытья ChIP добавьте 1 мл буфера лиза 3 (при 4 градусов по Цельсию) к каждой трубке. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
- Добавьте 1 мл холодного буфера для мытья соли в каждую трубку. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
- Добавьте 1 мл холодного буфера для мытья LiCl в каждую трубку. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
- Добавьте 1 мл холодного буфера Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4) к каждой трубке. Смешайте на качалки платформы при 4 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо буфера Tris-HCl (pH 8.0) можно использовать буфер Tris-EDTA (pH 7.4). - Повторите шаги 7,4–7,6 три раза.
- Перенесите образец бисера с буфером Tris-HCl (рН 7,4) на свежие трубы 1,5 мл. Кратко спина образцов, а затем поместить на магнитную стойку в течение 1 мин и удалить супернатант с пипеткой.
8. Конец ремонта и dA-хвост реакции на бисер
ПРИМЕЧАНИЕ: Sonication часто генерирует не тупой конец dsDNA. Реакция на конец ремонта необходима для того, чтобы сделать тупую ДНК до реакции dA-хвоста, за которой следует шаг перевязки адаптера индекса. Для липкой перевязки ДНК конца с индексом адаптера ДНК, DATP добавляется к 3 'конец тупой, фрагмент dsDNA реакции dA-хвоста. Конец подготовки реакции смесь содержит DATP.
- После мытья ChIP добавьте 38 йл автоклавного ddH2O в образец бисера в 1,5 мл трубок для конечного ремонта и реакции dA-хвоста.
- Добавьте 5,6 мл смеси реакции конечной подготовки и 2,4 мл смеси фермента конечной подготовки(Таблица материалов)к каждому образцу (общий объем реакции: 46 йл). Инкубационые образцы при 20 градусах Цельсия в течение 30 мин.
- Вымойте бисер, как описано в предыдущих шагах ChIP мыть 7.4'7.6.
9. Индексная перевязка адаптера на бисере
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптер индекса имеет 6-10 баз штрих-кодов индексных последовательностей, которые специфичны для данного образца, используемого для мультиплексирования нескольких образцов в высокой пропускной способности последовательности. Последовательности ДНК адаптера индекса описаны в таблице 1.
- Для перевязки адаптера индекса добавьте 27 мкл холодного буфера Tris-HCl (pH 7.4) к буферу образца. Добавьте 2 МКЛ из 15 адаптера индекса МКМ, 0,5 МКЛ усилителя перевязки и 15 МКЛ мастер-микса лигазы(таблица материалов)к каждому образцу (общий объем реакции: 44,5 МКЛ).
- Инкубационые образцы при 20 градусах Цельсия в течение 15 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.
10. Реакция заполнения на бисер
ПРИМЕЧАНИЕ: После перевязки адаптера, нет фосфодитера связь между 5 'конец адаптера и 3' конец ДНК ChIP. Ник может быть восстановлен с помощью реакции заполнения.
- Добавьте 47 мкл холодного буфера Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4) в образец бисера.
- Сделайте на льду смесь реакциизаполнения (таблица 4 итаблица материалов).
- Добавьте к каждому образцу 11,1 мл смеси заполнения (общий объем реакции: 58,1 МЛ). Инкубационые образцы при 30 градусах Цельсия в течение 20 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.
11. Пищеварение экзонуклеазы Lambda на бисере
- После заполнения реакции на бисер, добавить 50 йл холодного autoclaved ddH2O в образец бисера.
- Чтобы переварить ДНК ChIP в направлении от 5' до 3', добавьте 6 МКЛ 10x буфера экзонуклеазы лямбды и 2 МКЛ из 5 экзонуклеазы овсяной ягняты U/L(Таблица материалов, общий объем реакции: 58 йл). Инкубационые образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Вымойте бисер, как описано в шагах 7.4'7.6.
12. Элюция и обратная перекрестье
- Сделайте буфер elution ChIP, описанный в таблице 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ИПЦ в буфер elution ChIP. - Чтобы elute ChIP образцы из бисера, повторного объема образцов в 75 йл буфера chIP elution и инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение 15 мин при 130 х г.
- Добавьте в образцы 2,5 л белказы 20 мг/млK(таблица материалов). Кратко вихрь, а затем инкубировать образцы на ночь при 65 градусов по Цельсию.
13. Извлечение ДНК
- После того, как образцы инкубировали на ночь при 65 градусов по Цельсию, кратко спина образцов, место на магнитной стойке в течение 1 мин, а затем передать супернатант из каждого образца в новые 1,5 мл труб.
- Добавьте в образцы 1 мл 10 мг/мл RNase A. Кратко вихрь, а затем инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Добавьте 25 мл автоклавного ddH2O к объему до 100 мкл.
- Очистка ДНК с помощью магнитныхбусин (Таблица материалов). ДНК Элюта с 16 йл автоклавного ddH2O или без ядра ddH2O.
14. Денатурирование, грунтовка annealing и грунтовка расширение
- После элюции ChIP и обратного скрещивания, передача 16 йл извлеченных образцов ДНК из шага 13,3 в ПЦР труб.
- Сделать денатурации и грунтовки annealing смесь(Таблица 6 и Таблица материалов) на льду. Добавьте к каждому образцу смесь денатурации и грунтовки (общий объем реакции: 17,2 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы, описанной в таблице 6, чтобы денатурировать и аннеальные грунтовки к ДНК шаблона.
- Сделайте грунтовку расширение смеси( Таблица 7 и Таблица материалов) на льду.
- После завершения программы денатуратуры и аннеальных грунтовок добавьте в образцы 3 МКЛ смеси расширения грунтовки (общий объем реакции: 20,2 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы для расширения грунтовки, описанной в таблице 7.
- Немедленно приступайте к реакции dA-хвоста.
15. реакция dA-хвоста
ПРИМЕЧАНИЕ: Для липкой перевязки конце ДНК с универсальной ДНК адаптера, DATP добавляется к 3 'конец тупой, dsDNA реакции dA-хвост.
- Сделать dA-хвост смесь(таблица 8 и таблица материалов )на льду.
- Добавьте к каждому образцу 4,1 МЛ смеси ДНК-хвоста (общий объем реакции: 24,3 МЛ). Вы запустите образцы с помощью программы для dA-хвоста(таблица 8).
- Немедленно приступайте к универсальной перевязки адаптера.
16. Универсальная перевязка адаптера
ПРИМЕЧАНИЕ: Универсальный адаптер включает в себя высокой пропускной способности секвенирования конкретных последовательностей для распознавания образцов ДНК для секвенирования химии. Универсальные последовательности ДНК адаптера описаны в таблице 1.
- После реакции dA-хвоста сделайте универсальную смесь перевязки адаптера(таблица 9 и таблица материалов)для универсальной перевязки адаптера.
- Добавьте 21,5 МЛ к каждому образцу (общий объем реакции: 45,8 МКЛ) и инкубировать образцы в течение 15 мин при 20 градусах Цельсия.
17. Очистка ДНК
- Очистка ДНК с помощью магнитныхбусин (Таблица материалов). Elute ДНК с 21 йл autoclaved ddH2O или нуклеазы свободных ddH2O.
- Храните образцы при -20 градусов по Цельсию до готовности к проведению ПЦР при посредничестве перевязки (LM-PCR) и очистки ПЦР.
18. Опосредованная ПЦР при посредничестве Лигации
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров LM-PCR описаны в таблице 1.
- После очистки ДНК, сделать LM-PCR смесь(Таблица 10 и Таблица материалов) на льду.
- Добавьте 29 л смеси LM-PCR к каждому образцу (общий объем реакции: 50 л) и запустите образцы с помощью программы для LM-PCR(таблица 10).
- Немедленно приступайте к гелевой очистке ПЦР, а затем к очистке ДНК для секвенирования высокой пропускной способности.
19. ДНК рурификации LM-PCR усиливается ДНК
- Запустите LM-PCR усиленные образцы ДНК, наряду с лестницей ДНК, в 1,5% агарозного геля при диапазонах 120-180 В и акцизных 200-400 б/с.
- Очистка ДНК из вырезанного геля с помощью комплекта для извлечения геля(Таблица материалов).
- После очистки ДНК проверьте концентрацию(таблица материалов)каждого образца библиотеки ChIP-exo. Отправить образцы для секвенирования высокой пропускной способности для одночитаемого секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная длина чтения для одночитаемого секвенирования составляет не менее 35 б.п., что достаточно для однозначного выравнивания секвенирования считывания с эталоном генома в мышиных или человеческих клетках. Для большинства транскрипционных факторов в клетках мыши или человека, 10-20 миллионов считыв на образец ChIP-exo достаточно, чтобы определить их геномные места связывания. По крайней мере 30 миллионов считывок на образец необходимы для карты геномных регионов, обогащенных гистоном в клетках млекопитающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2A иллюстрирует результаты sonication после лиза клетки и sonication, с различными циклами, клеток моторных нейронов продифференцированных от клеток ES мыши. Оптимальное количество циклов соника (например, 12 циклов на рисунке 2A) вызвалосильную интенсивность ДНК в 100-400 bp фрагментов ДНК. Высококачественные библиотеки ChIP-exo основаны на размерах и количестве фрагментированной ДНК хроматина. Таким образом, оптимизация звуковой рекомендуется для каждого типа клеток и партии клеток перед запуском ChIP-exo.
На рисунке 2B показаны продукты ПЦР (LM-PCR), опосредованная перевязка ПЦР (LM-PCR) образцов ДНК ChIP-exo, усиленных циклами ПЦР 18–21. LM-PCR усиливает фрагменты ДНК ChIP-exo, которые оснащены адаптерами ДНК для секвенирования следующего поколения. ПЦР грунтовка является частью последовательности адаптера ДНК. Размер звуковых фрагментов ДНК составляет около 100–400 б/с(рисунок 2А). После переваривания лямбды экзонуклеазы размер фрагментов ДНК станет половиной размера исходного материала (50–200 б.п.). Приблизительно 125 bp адаптеров дна были ligated к фрагментам дна ChIP-exo таким образом, ожидаемый размер продуктов LM-PCR 175'325 bp. Минимальное количество циклов ПЦР, будучи достаточным для усиления библиотеки ChIP-exo, выполняется, чтобы избежать чрезмерного усиления ДНК ChIP-exo.
Здесь, ChIP-экзо для Isl1 было выполнено в мышиных ES клеток полученных моторных нейронов. Isl1 является двигатель нейронов программирования транскрипции фактор, который конкретно выражается в постмитотических моторных нейронов. Результаты isl1 ChIP-exo показывают значительное количество 200-400 bp LM-PCR усиливается ChIP-экзоДНК (рисунок 2B). Группа около 100 bp указывает на артефакты ПЦР из адаптеров и праймеров ПЦР. Запуск не антитела контроля наряду с экспериментальным образцом также важно обеспечить неспецифические, фон ДНК переваривается путем лечения экзонуклеазы ягненка. В качестве примера мы определили связанные места Isl1 в моторных нейронах, полученных клетками мыши ES, используя ChIP-exo и ChIP-seq(рисунок 3). Сигнал ChIP-exo был в значительной степени сфокусирован на сайтах связывания Isl1, обнаруживая несколько кластерных шаблонов связывания транскрипционных факторов Isl1. Сигнал ChIP-seq отображал более широкие сигналы, указывающие на то, что ChIP-exo Isl1 имеет более высокое разрешение отображения, чем ChIP-seq isl1.
Рисунок 1: Схема протокола ChIP-exo. После ChIP (шаги 1'7), конечный ремонт и dA-хвост реакции делают ChIP ДНК тупой конец, добавив фосфатной группы к 5 ' конец ДНК и добавление dATP к 3 'конец ДНК (шаг 8). Sonicated концы ДНК ChIP, на бисере привязаны с адаптером индекса (шаг 9). После реакции заполнения ДНК адаптера с 5' свесом становится тупым (шаг 10). Lambda exonuclease переваривает sonicated ДНК от 5' до 3' до белка (TF)-ДНК перекрестных точек (шаг 11). После элюции, обратного скрещивания и извлечения ДНК (шаги 12 и 13), денатурированная однопутная ДНК делается в два раза мель путем расширения индексной ПЦР грунтовки (шаг 14), а затем dA-хвост (шаг 15). Универсальный адаптер затем перевязано к экзонуклеазы обработанный конец (шаг 16). Полученная библиотека очищается, усиливается ПЦР и подвергается последовательности следующего поколения (шаги 17–19). Сопоставление 5' концов результирующего секвенирования тегов на эталонный геном разграничает экзонуклеазный барьер и, таким образом, точное место скрещивания белка и ДНК.
Рисунок 2: Sonication и LM-PCR усиление библиотеки ChIP-exo. (A) 1,5% агарозный гель электрофорезированной звуковой ДНК. 12, 18 и 24 циклов sonication были проведены, чтобы найти оптимальные циклы sonication для 2 х10 7 клеток мыши ES клеток, полученных моторных нейронов. После sonication, образец дна был обратный crosslinked, и извлечено используя высыпание PCIA и этанола. Каждый образец содержал 4 х10 5 клеточных эквивалентов, что составляет 2% звуковых клеток. 12 циклов соникации дали больший выход звуковой ДНК с желаемым размером (100–500 б.п.). (B) 1,5% агарозный гель электрофорезных библиотек ChIP-exo после 18-21 циклов LM-PCR без контроля антител (No Ab) и Isl1 в моторных нейронах, полученных клетками мыши ES. Каждый образец содержал 10 х 106-клеточный эквивалент моторных нейронов мыши. Нет антитела ChIP-экзо результат (полоса 2) показывает, что неспецифические, загрязняющие ДНК устраняется lambda exonuclease. Библиотеки ChIP-exo для Isl1 (лейн 3) показывают усиленные библиотеки ДНК около 200–400 б.п., что указывает на то, что библиотеки ChIP-exo были успешно усилены при посредничестве адаптера опосредованного ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение ChIP-экзо с ChIP-seq для Isl1 в конкретных локусов. Синие и красные заполненные участки показывают распределение тегов секвенирования для ChIP-seq и ChIP-exo Isl1-связанных мест, соответственно, проксимальных для Slit3 и Fgfr1 гена в зарождающихся спинномозговых моторных нейронов отличается от мышиных клеток ES.
Таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые в этом протоколе.
| Имя Олиго | Длина (nt) | Последовательности | Примечание | |||||
| Индексный адаптер-форвард | 66 | 5'/Фос/CAAGCAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTAGAGAGGGGGTGTGCTCCCGATCT 3' | 5' фосфат, индекс (XXXXXXXX), 3' Т-свес | |||||
| Индексный адаптер-обратный | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Адаптер лигации-вперед | 58 | 5'AATGATACGGCGACCGAGATCTACTCTCTCTCCCTACACGACGCTCCCGATCT 3' | ||||||
| Адаптер лигации-обратное | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGGGGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Индекс ПЦР праймер | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Универсальный ПЦР грунтовка | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| «Вышеуказанные адаптеры последовательности и праймеры PCR предназначены для платформ секвенирования Illumina HiSeq и NextSeq. | ||||||||
Таблица 2: Рецепты буферов лиза 1-3 и блокирующего буфера. Хранить в трубках 50 мл при 4 градусах Цельсия. Добавьте 50 мкл 1000x CPI (полный ингибитор протеазы) во все буферы непосредственно перед использованием.
| Лиз буфер 1 | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 1 M HEPES (рН 7,3) | 2.5 | 50 мМ |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 0.1 | 1 мМ |
| 50% глицерол | 10 | 10% |
| 10% Октилфенол этиксилат | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2--4-(2,4,4-триметилпентан-2-yl)фенокси-этанол | 1.25 | 0.25% |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
| Лиз буфер 2 | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 0.5 M Tris-HCl (рН 8.0) | 1 | 10 мМ |
| 5 M NaCl | 2 | 200 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 0.1 | 1 мМ |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
| Лиз буфер 3 | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 1 M Трис-HCl (рН 8,0) | 0.5 | 10 мМ |
| 5 M NaCl | 1 | 100 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 0.1 | 1 мМ |
| 10% Дезоксихолевая кислота | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Лауройлсаркозин солевой раствор натрия | 0.83 | 0.50% |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
| Блокирующее решение | ||
| Реагента | Сумма | (Финал) |
| Альбом сыворотки крупного рогатого скота (BSA) | 250 мг | 0.50% |
| Полный ингибитор протеазы (CPI, 1000x) | 50 мкл | 1x |
| Фосфат буферный солевой раствор (PBS) | Заполните до 50 мл | |
Таблица 3: Рецепты для мытья ChIP: буфер High Salt Wash, буфер LiCl Wash и буфер Tris-HCl 10 мМ (рН 7,4). Хранить в трубках 50 мл при 4 градусах Цельсия. Добавьте 50 йл 1000-х запасов ИПЦ ко всем буферам непосредственно перед использованием.
| Буфер для мытья соли с высоким содержанием соли | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 1 M HEPES (рН 7,3) | 2.5 | 50 мМ |
| 5 M NaCl | 5 | 500 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 0.1 | 1 мМ |
| 10% 2--4-(2,4,4-триметилпентан-2-yl)фенокси-этанол | 5 | 1% |
| 5% Дезоксихолевая кислота | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
| Буфер для мытья LiCl | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 0.5 M Tris-HCl (рН 8.0) | 2 | 20 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 0.1 | 1 мМ |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 мМ |
| 10% Октилфенол этиксилат | 2.5 | 0.50% |
| 5% Дезоксихолевая кислота | 5 | 0.50% |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
| Буфер Tris-HCl 10 мМ | ||
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 1 M Трис-HCl (рН 7,4) | 0.5 | 10 мМ |
| Автоклав ddH2O | Заполните до 50 | |
Таблица 4: Заполните в реакции мастер смеси.
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| 20 мг/мл BSA | 0.6 | 0,2 мг/мл |
| 10x phi29 буфер полимеразы ДНК | 6 | 1x |
| 3 МММ дНТП | 2.5 | 150 МКМ |
| 10 U/L phi29 полимераза ДНК | 2 | 10 U |
| Объем смеси реакции | 11.1 |
Таблица 5: Рецепт буфера ChIP Elution. Хранить в 50 мл труб на RT.
| Реагента | Объем (mL) | (Финал) |
| 0.5 M Tris-HCl (рН 8.0) | 5 | 50 мМ |
| 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) | 1 | 10 мМ |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Автоклав ddH2O | до 50 мл |
Таблица 6: Денатурирование и праймер Аннеалинг реакции мастер смеси и программы.
| Денатурирование и грунтовка annealing смесь | ||
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| 20 мг/мл BSA | 0.2 | 0,2 мг/мл |
| 3 МММ дНТП | 0.5 | 75 МКМ |
| 10 МКМ Индекс ПЦР грунтовка | 0.5 | 0,25 МКМ |
| Объем смеси реакции | 1.2 | |
| Программа денатурации и грунтовки | ||
| Температура (КК) | Время | |
| 95 | 5 мин. | |
| 65 | 3 мин. | |
| 60 | 3 мин. | |
| 57 | 3 мин. | |
| 54 | 3 мин. | |
| 51 | 3 мин. | |
| 30 | Навсегда | |
Таблица 7: Primer Расширение реакции мастер смеси и программы.
| Смесь расширения Primer | ||
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| 10x phi29 буфер полимеразы ДНК | 2 | 1x |
| 10 U/L phi29 полимераза ДНК | 1 | 75 МКМ |
| Объем смеси реакции | 3 | |
| Программа расширения Primer | ||
| Температура (КК) | Время | |
| 30 | 20 мин. | |
| 65 | 10 мин. | |
| 4 | Навсегда | |
Таблица 8: dA-Tailing реакции мастер смеси и программы.
| dA-Tailing микс | ||
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| 3 мМ ДАТП | 0.7 | 120 МКМ |
| Кленов фрагмент буфера | 2.4 | 1x |
| 5 Фрагмент U/L Klenow | 1 | 0 0 |
| Объем смеси реакции | 4.1 | |
| Программа dA-Tailing | ||
| Температура (КК) | Время | |
| 37 | 30 мин. | |
| 75 | 20 мин. | |
| 4 | Навсегда | |
Таблица 9: Универсальный адаптер Ligation реакции мастер смеси.
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| Автоклавная вода | 5 | |
| 15 «М Универсальный адаптер» | 1 | 320 нм |
| Усилитель лигации | 0.5 | 1x |
| Лигас мастер микс | 15 | 1x |
| Объем смеси реакции | 21.5 | |
| «Универсальная последовательность ДНК адаптера описана в таблице 1. | ||
Таблица 10: Лигация-Опосредованная ПЦР мастер микс и программа.
| LM-PCR микс | ||
| Реагента | 1x (КЛ) | (Финал) |
| 10 «M Индекс ПЦР грунтовка» | 2 | 0,2 МКМ |
| 10 «М Универсальный ПЦР грунтовка» | 2 | 0,2 МКМ |
| 2x Так ДНК полимеразы PCR мастер смеси | 25 | 1x |
| Объем смеси реакции | 29 | |
| Последовательности грунтовки PCR описаны в таблице 1. | ||
| Программа LM-PCR | ||
| Температура (КК) | Время | Циклов |
| 98 | 30 с | 1 |
| 98 | 10 с | от 15 до 25 лет |
| 65 | 75 с | |
| 65 | 5 мин. | 1 |
| 4 | Держать | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, ChIP следуют пищеварения экзонуклеазы используется для получения библиотек ДНК для выявления белково-ДНК взаимодействий в клетках млекопитающих при сверхвысоком разрешении отображения. Многие переменные способствуют качеству эксперимента ChIP-exo. Критические экспериментальные параметры включают качество антител, оптимизацию звуковой данных и количество циклов LM-PCR. Эти критические экспериментальные параметры также могут ограничить эксперименты ChIP-exo и будут обсуждаться ниже.
В любом протоколе ChIP качество антител является одним из самых важных соображений. Использование антител класса ChIP рекомендуется для ChIP-экзо. Качество антител может быть проверено до проведения протокола ChIP-exo. ChIP-seq или ChIP-qPCR могут быть использованы для проверки антител класса ChIP, подтверждая конкретные места связывания ДНК белка интереса. Впоследствии, оптимизация концентрации антител, добавленных в бисер идеально подходит для обеспечения того, чтобы белково-ДНК комплексы иммунопрецилитированы22,23.
Соникация хроматина является еще одним важным шагом в протоколе ChIP-exo. Sonication имеет решающее значение для неспецифического стрижки хроматина, необходимого для оптимального иммунопреципиентации белка интереса24. Размер и количество звуковой ДНК зависят от количества циклов соника. Высокая концентрация фрагментированной ДНК имеет важное значение для обеспечения того, чтобы достаточное количество ДНК было иммунопрециптировано к белкам, представляющим интерес для библиотеки ДНК ChIP-exo, которая будет создана. Получение фрагментированной ДНК в 100–500 б.п. идеально, потому что разрешение ChIP-exo лучше, если фрагменты звукового хроматина имеют меньшие стартовые размеры. Таким образом, оптимальная хломатиновая звуковое данные должна быть определена для каждого типа и партии клеток путем изменения количества циклов звуковой связи и звуковых буферов.
Окончательным критическим параметром является получение усиления ДНК библиотеки ChIP-exo с минимальным количеством циклов LM-PCR, чтобы избежать чрезмерного усиления артефактов ПЦР. Чтобы определить минимальное количество циклов ПЦР для усиления ДНК ChIP-exo, небольшая часть ДНК ChIP-exo может быть использована для запуска нескольких циклов ПЦР (например, 10, 15 и 20 циклов) и сравнения продуктов ПЦР.
ChIP-exo имеет гораздо больше шагов, чем традиционный ChIP-seq, и, как результат, каждый шаг должен выполняться тщательно и точно для работы протокола ChIP-exo. Важно отметить, что правильный объем каждого реагента в энзиматических реакциях должен быть добавлен к каждой реакции мастер смеси21. Таким образом, рекомендуется создать электронную таблицу для расчета объема каждого реагента, необходимого для каждого мастер-микса, а затем распечатать таблицы и проверить каждый реагент после добавления к мастер-миксам. Тщательное иссечение усиленной ДНК также имеет важное значение; фрагменты ниже 200 bp часто содержат адаптерные димеры, которые необходимо удалить до последовательности следующего поколения.
Примечательно, что большинство критических параметров и ограничений ChIP-exo идентичны параметрам ChIP-seq. Однако, в отличие от ChIP-seq, ChIP-exo обеспечивает картографирование генома с высоким разрешением с низким фоном. Таким образом, ChIP-exo является идеальным методом для выявления точных белково-ДНК взаимодействий в различных системах и организмах, помогая выявить значительные роли ДНК-связывающих белков в клетке. Метод ChIP-exo, описанный выше, может быть использован для изучения факторов транскрипции, следов модификации гистона и хроматиновых регуляторных белков в живых клетках с более высоким разрешением отображения, чем ChIP-seq25,26,27. Кроме того, ChIP-exo может обнаруживать отдельные связывающие места ДНК-связывающих белков в скоплении, в то время как ChIP-seq не может из-за его разрешения отображения. Важно отметить, что ChIP-exo отображает более высокое соотношение сигнала к шуму по сравнению с ChIP-seq. Эти преимущества ChIP-exo позволяют нам определить полный набор связанных мест по всему геному. Этот протокол обеспечит основу для исследователей, заинтересованных в изучении ДНК-связывающих мест различных белков по всему геному при почти базовом разрешении пары.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудника лаборатории Rhee за обмен неопубликованными данными и ценные дискуссии. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) грант RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
