Summary
Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.
Abstract
Die Identifizierung spezifischer Protein-DNA-Wechselwirkungen im Genom ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird häufig verwendet, um genomweite Bindungsstellen von DNA-bindenden Proteinen zu identifizieren. Die ChIP-seq-Methode wird jedoch durch ihre Heterogenität in der Länge beschallter DNA-Fragmente und unspezifischer Hintergrund-DNA eingeschränkt, was zu einer geringen Kartierungsauflösung und Unsicherheit in DNA-bindenden Stellen führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, nutzt die Kombination von ChIP mit Exonuklease-Verdauung (ChIP-exo) die 5' bis 3' Exonuklease-Verdauung, um die heterogen große immunpräzipierte DNA auf die Protein-DNA-Vernetzungsstelle zu trimmen. Die Exonuklease-Behandlung eliminiert auch unspezifische Hintergrund-DNA. Die bibliotheksvorbereitete und exonukleaseverdsierte DNA kann zur Hochdurchsatzsequenzierung gesendet werden. Die ChIP-exo-Methode ermöglicht eine nahezu Basispaar-Mapping-Auflösung mit größerer Erkennungsempfindlichkeit und reduziertem Hintergrundsignal. Ein optimiertes ChIP-Exo-Protokoll für Säugetierzellen und die Sequenzierung der nächsten Generation wird im Folgenden beschrieben.
Introduction
Die Standorte von Protein-DNA-Wechselwirkungen geben Einblick in die Mechanismen der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird seit einem Jahrzehnt verwendet, um genomweite Protein-DNA-Wechselwirkungen in lebenden Zellen1,2zu untersuchen. Die ChIP-seq-Methode wird jedoch durch Heterogenität bei der DNA-Fragmentierung und ungebundene DNA-Kontamination eingeschränkt, die zu einer niedrigen Mapping-Auflösung, falschen Positivmeldungen, verpassten Anrufen und einem unspezifischen Hintergrundsignal führen. Die Kombination von ChIP mit Exonuklease-Verdauung (ChIP-exo) verbessert die ChIP-seq-Methode, indem ChIP-DNA auf die Protein-DNA-Vernetzungspunkte gestutzt wird, was eine nahezu Base-Pair-Auflösung und ein niedriges Hintergrundsignal3,4,5bietet. Die stark verbesserte Mapping-Auflösung und der geringe Hintergrund von ChIP-exo ermöglichen die Deko-Lösung präziser und umfassender Protein-DNA-Bindungsstellen im gesamten Genom. ChIP-exo ist in der Lage, funktionell unterschiedliche DNA-bindende Motive, kooperative Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren (TF) und mehrere Protein-DNA-Vernetzungsstellen an einem bestimmten genomischen Bindungsort zu offenbaren, die durch andere genomische Kartierungsmethodennichtnachweisbar sind 3,4,6,7.
ChIP-exo wurde ursprünglich in angehender Hefe verwendet, um die sequenzspezifische DNA-Bindung von TFs zu untersuchen, um die genaue Organisation des Transkriptions-Vorinitiierungskomplexes und die subnukleosomale Struktur einzelner Histonen im Genom4,8,9zu untersuchen. Seit seiner Einführung im Jahr 20114, ChIP-exo wurde erfolgreich in vielen anderen Organismen einschließlich Bakterien, Mäuse, und menschliche Zellen7,10,11,12,13,14,15,16,17. Im Jahr 2016 verwendeten Rhee et al.14 erstmals ChIP-exo in Säugetierneuronen, um zu verstehen, wie die neuronale Genexpression nach der Downregulation der Programmierung TF Lhx3 aufrechterhalten wurde, die mit einer anderen Programmier-TF Isl1 einen Heterodimer-Komplex bildet. Diese Studie zeigte, dass in Abwesenheit von Lhx3, Isl1 zu neuen neuronalen Enhancer rekrutiert wird, die von Onecut1 TF gebunden sind, um die Genexpression neuronaler Effektorgene aufrechtzuerhalten. In dieser Studie zeigte ChIP-exo, wie mehrere TFs Zelltyp- und zellstufenspezifische DNA-Regulierungselemente in kombinatorischem Weise bei nahezu nukleotid-Mapping-Auflösung dynamisch erkennen. Andere Studien verwendeten auch die ChIP-exo-Methode, um das Zusammenspiel von Proteinen und DNA in anderen Säugetierzelllinien zu verstehen. Han et al.7 verwendeten ChIP-exo, um die genomweite Organisation von GATA1 und TAL1 TFs in Mauserythroidzellen mit ChIP-exo zu untersuchen. Diese Studie ergab, dass TAL1 direkt für die DNA rekrutiert wird und nicht indirekt durch Protein-Protein-Wechselwirkungen mit GATA1 während der Erythroid-Differenzierung. Neuere Studien verwendeten auch ChIP-exo, um die genomweiten Bindungsstellen von CTCF, RNA Polymerase II und Histonmarkierungen zu profilieren, um epigenomische und transkriptionelle Mechanismen in menschlichen Zelllinien18,19zu untersuchen.
Es gibt mehrere Versionen des ChIP-exo Protokolls verfügbar3,5,20. Diese ChIP-exo-Protokolle sind jedoch für Forscher, die mit der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek der nächsten Generation nicht vertraut sind, schwer zu befolgen. Eine ausgezeichnete Version des ChIP-exo-Protokolls wurde mit leicht verständlichen Anweisungen und einem Video21veröffentlicht, enthielt aber viele enzymatische Schritte, die eine erhebliche Zeitinanspruch samten. Hier berichten wir über eine neue Version des ChIP-exo-Protokolls mit reduzierten enzymatischen Schritten und Inkubationszeiten sowie Erläuterungen für jeden enzymatischen Schritt21. Endreparatur- und dA-Tailing-Reaktionen werden in einem einzigen Schritt mit Endvorbereitungsenzym kombiniert. Die Inkubationszeiten für Index- und Universaladapterligationsschritte werden mit einem Ligationsverstärker von 2 h auf 15 min reduziert. Die Kinase-Reaktion nach dem im vorherigen ChIP-exo-Protokoll beschriebenen Indexadapter-Ligationsschritt wird entfernt. Stattdessen wird während der Oligo-DNA-Synthese eine Phosphatgruppe zu einem der 5' Enden des Indexadapters (Tabelle 1) hinzugefügt, der für den Lambda-Exonuklease-Verdauungsschritt verwendet wird. Während das vorherige ChIP-exo-Protokoll RecJf Exonuclease-Verdauung verwendet, um einsträngige DNA-Verunreinigungen zu beseitigen, wird dieser Verdauungsschritt hier entfernt, da er für die Qualität der ChIP-exo-Bibliothek nicht entscheidend ist. Zur Reinigung der reverse-vernetzten DNA nach der ChIP-Elution wird anstelle der Extraktionsmethode phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCIA) eine Methode zur Reinigung magnetischer Perlen verwendet. Dies reduziert die Inkubationszeit der DNA-Extraktion. Wichtig ist, dass die Mehrheit der Adapterdimer entfernt wird, die während der Indexadapterligation gebildet werden, was die Effizienz der ligationsvermittelten PCR beeinträchtigen kann.
Das hier vorgestellte ChIP-exo-Protokoll ist für den Nachweis präziser Protein-DNA-Wechselwirkungen in Säugetierneuronen optimiert, die sich von Maus-Embryonalstammzellen (ES) unterscheiden. Kurz werden geerntete und vernetzte neuronale Zellen lysiert, damit Chromatin der Beschallung ausgesetzt und dann beschallt werden kann, so dass dna-Fragmente in angemessener Größe erhalten werden (Abbildung 1). Antikörperbeschichtete Perlen werden dann verwendet, um fragmentiertes, lösliches Chromatin selektiv zu immunprezipitieren, um das Protein von Interesse zu erhalten. Während sich die immunpräzipierte DNA noch auf den Perlen befindet, werden Endreparatur, Ligation von Sequenzierungsadaptern, Einfüllreaktion und 5' bis 3' Lambda-Exonuklease-Verdauungsschritte durchgeführt. Der Exonuklease-Verdauungsschritt verleiht ChIP-exo sein ultrahohe Auflösungs- und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Lambda exonuklease schneidet die immunpräzipierte DNA ein paar Base-Pairs (bp) von der Vernetzungsstelle, wodurch kontaminierende DNA abgebaut wird. Die exonukleasebehandelte ChIP-DNA wird aus den antikörperbeschichteten Perlen eluiert, Protein-DNA-Querverbindungen werden umgekehrt und Proteine abgebaut. DNA wird extrahiert und in einsträngige ChIP-DNA denaturiert, gefolgt von Primer-Glühen und Erweiterung, um doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. Als nächstes wird die Ligation eines Universaladapters an den exonukleasebehandelten Enden durchgeführt. Die resultierende DNA wird gereinigt, dann PCR verstärkt, gelgereinigt und der Sequenzierung der nächsten Generation unterzogen.
Das ChIP-exo-Protokoll ist länger als das ChIP-seq-Protokoll, aber technisch nicht sehr anspruchsvoll. Jede erfolgreich immunpräzipierte ChIP-DNA kann ChIP-exo mit mehreren zusätzlichen enzymatischen Schritten unterworfen werden. Die bemerkenswerten Vorteile von ChIP-exo, wie ultrahohe Mapping-Auflösung, ein reduziertes Hintergrundsignal und verringerte falsch positive und negative, in Bezug auf genomische Bindungsstellen, überwiegen die Zeitkosten.
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Protocol
HINWEIS: Autoklaviertes destilliertes und deionisiertes Wasser (ddH2O) wird zur Herstellung von Puffern und Reaktionsmastermischungen empfohlen. Die Abschnitte 1-4 beschreiben zelllyse und beschallt, abschnitte 5-7 beschreiben Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), Abschnitte 8-11 beschreiben enzymatische Reaktionen auf Perlen, Abschnitte 12 und 13 beschreiben ChIP-Elution und DNA-Reinigung und Abschnitte 14-19 beschreiben die Bibliotheksvorbereitung.
1. Ernte- und Vernetzungszellen
- Nach der Differenzierung von Maus-ES-Zellen in postmitotische Neuronen, fügen Sie 11% Formaldehyd zu den geernteten Zellen zu einer Endkonzentration von 1% (v/v). Gesteinszellen auf einer Schaukelplattform (Rocker, Shaker oder Rotator) für 15 min bei Raumtemperatur (RT, 25 °C).
ANMERKUNG: Je nach zu vernetzendem Zielprotein weniger Formaldehyd-Vernetzung (z. B. endwertiver Konzentration von 0,5%) oder Doppelvernetzung mit Disuccinimidylglutarat (DSG) verwendet werden. - Fügen Sie 2,5 m Glycin in eine Endkonzentration von 150 mM, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen. Gesteinszellen auf einer Schaukelplattform bei RT, für 5 min.
- Zentrifugieren Sie die vernetzten Zellen in 15 ml konischen Röhren bei RT, für 6 min, bei 1.350 x g. Aspirieren Sie die Lösung, und setzen Sie dann Die Zellen in 5 ml 1x Phosphat-gepufferter Saline (PBS) wieder aus.
HINWEIS: Die vernetzten Zellpellets können nach dem Einfrieren mit flüssigem Stickstoff bei -80 °C gelagert werden.
2. Zelllyse
HINWEIS: Die folgenden Schritte in diesem Protokoll sind für etwa 2 x 107 neuronale Zellen, die von Maus-ES-Zellen unterschieden werden. Um aufgebrochene Zellen zu brechen, werden Lysepuffer verwendet, die verschiedene Reinigungsmittel enthalten. Fügen Sie 50 l 1000x complete Protease Inhibitor (CPI) Vorrat auf 50 ml Puffer kurz vor der Verwendung.
- Bereiten Sie Lysepuffer 1-3 vor, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Vernetzte Zellpellets auf Eis auftauen und dann Zellpellets in 3 ml Lysepuffer 1 in 15 ml konischen Röhren gründlich aufhängen. Gestein bei 4 °C für 15 min auf einer Schaukelplattform. Zentrifuge bei 1.350 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat-Überstand.
- Pelletzellen in 3 ml Lysepuffer 2 gründlich resuspendieren. Gestein bei 4 °C für 10 min auf einer Schaukelplattform. Zentrifuge bei 1.350 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat-Überstand.
- Fügen Sie 1 ml Lysepuffer 3 zu jedem Pellet hinzu, dann auf Eis halten. Gehen Sie sofort zur Beschallung über.
3. Beschallung von Chromatin
HINWEIS: Halten Sie die Proben während dieses Beschallungsvorgangs auf Eis oder bei 4 °C, um die Kreuzumkehr zu reduzieren.
- Mit einem sterilen Spachtel, fügen Sie Beschallungsperlen (Tabelle der Materialien) bis zur 0,2 ml Graduierungsmarke auf 15 ml Polystyrol-Röhren. Waschen Sie Beads durch Wirbeln in 600 l von 1x PBS, bis keine trockenen Flecken sichtbar sind. Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 s bei 30 x g und aspirieren Sie 1x PBS.
HINWEIS: Die Beschallung in Polystyrolröhren ist effizienter als Beschallung in Polypropylenröhren. Wenn eine kleinere Anzahl von Zellen (z. B. <106 Zellen) beschallt ist, verwenden Sie 1,5 ml Polystyrolröhren ohne Zugabe von Beschallungsperlen. - Die Kernlysate in 1 ml Lysepuffer 3 (ab Schritt 2.4) gründlich wieder aussetzen und dann auf die 15 ml Polystyrolröhren übertragen, die Beschallungsperlen enthalten. Kurz wirbeln die Polystyrolröhren.
- Um die vernetzte Chromatin-DNA zu fragmentieren, beschallen Sie Kernlysate bei 4 °C für eine optimierte Anzahl von Zyklen, mit Leistungsamplitude bei 30 W und Beschallungszyklen auf 30 s auf/30 s aus.
HINWEIS: Die Optimierung der Beschallung für jeden Zelltyp und Charge führt zu der besten ChIP-Exo-Ausbeute. Für 2 x 107 Maus-Neuronalzellen fragmentieren 20-30-Beschallungszyklen bei den genannten Einstellungen das Chromatin im Bereich von 100 bis 500 bp. - Nachdem die Beschallung abgeschlossen ist, übertragen Sie alle Überstande (beschallte Lysate) von jeder Probe auf 1,5 ml Röhren. Fügen Sie 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol) zu jeder Probe mit einer Endkonzentration von 1% hinzu. Mix durch Pipetten.
- Zu Pelletzellablagerungen Zentrifugenproben bei 13.500 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie alle beschallten Lysate (Überstand) von jeder Probe auf neue 1,5 ml-Röhren.
- Nehmen Sie 30 l beschallten Lysats aus jeder Probe (3 % beschalltes Lysat) und fügen Sie neue 1,5 ml-Röhren hinzu, um die Beschallung zu überprüfen. Reste beschallte Lysate bei 4 °C lagern, bis sie mit antikörperbeschichteten Perlen zur Inkubation bereit sind.
4. Überprüfung der Beschallung
- Machen Sie 20 ml 2x Proteinase K Puffer durch Zugabe von 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M EDTA, 10 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 6 ml autoklaved ddH2O. Fügen Sie diesem Puffer keinen CPI hinzu. 50 ml Rohr bei RT aufbewahren.
- Um den Protein-DNA-Anschluss umzukehren, durch Entfernen der Proteine nehmen Sie die 30 l beschallten Chromatin aus jeder Probe (ab Schritt 3.6), fügen Sie 166 l autoklavierte ddH2O, 200 l 2x Proteinase K Puffer und 4 l 20 mg/mL Proteinase K. Kurz Wirbel die Proben, und dann bei 65 °C für 1 x 3 h bei 24 x ginkubieren.
- HINWEIS: Die beschallten Lysate können bei 65 °C über Nacht umgedreht werden.
- Extrahieren Sie DNA mit PCIA (25:24:1) und Ethanol-Fällungsmethode wie folgt.
VORSICHT: PCIA ist giftig. Verwendung unter einer Dunstabzugshaube mit standardmäßiger persönlicher Schutzausrüstung (PSA).- Fügen Sie jeder Probe in 1,5 ml-Röhren 400 l PCIA hinzu, stellen Sie Wirbel auf maximale Geschwindigkeit und Wirbelproben für 20 s ein. Zentrifuge bei 18.400 x g für 6 min bei RT. Es werden zwei Phasen beobachtet. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht (klare Phase) jeder Probe vorsichtig in neue 1,5 ml-Rohre.
- Fügen Sie 1 l von 10 mg/ml RNase A hinzu. Inkubieren Sie Proben bei 37 °C für 30 min.
- Fügen Sie jeder Probe 1 l 20 mg/ml Glykogen hinzu, dann fallen Sie mit 1 ml eiskaltem 100% Ethanol (in einem Gefrierschrank von -20 °C gelagert). Kurz mischen, dann Proben in -80 °C Gefrierschrank für 30 min bis 1 h inkubieren. Zentrifugenproben bei 18.400 x g für 10 min bei 4 °C und sorgfältig 100% Ethanol ausgießen.
- Pellets mit 500 l eiskaltem 70% Ethanol (in einem -20 °C Gefrierschrank gelagert) waschen. Zentrifuge bei 18.400 x g für 5 min bei 4 °C. 70% Ethanol vorsichtig ausgießen.
- Inkubieren Sie Proben in 1,5 ml-Rohren bei 50 °C, bis das verbleibende Ethanol verdampft ist. Resuspend DNA-Pellets in 15 l autoklavierten ddH2O oder nukleasefreien ddH2O.
- Führen Sie die extrahierten DNA-Proben zusammen mit einer DNA-Leiter in einem 1,5% Agarose-Gel bei 120-180 V aus und überprüfen Sie die Größe der beschallten DNA.
5. Antikörper-Inkubation mit Perlen
HINWEIS: Die folgenden Schritte in diesem Protokoll sind für etwa 2 x 107 neuronale Zellen, die von Maus-ES-Zellen unterschieden werden. Einfrieren und Tauen magnetischer Perlen an keinem Punkt während des ChIP-exo-Protokolls, da die Perlen reißen können, was zu einer Kontamination der Probe führt oder die Leistung des Antikörpers beeinträchtigt werden kann.
- Nach der Zelllyse und Beschallung, bereiten Protein G magnetische Perlen (Tabelle der Materialien) für ChIP, mischen magnetische Perlen bis homogen, dann fügen Sie 25 l magnetische Perlen zu 2 ml Protein niedrig bindende Röhren.
HINWEIS: Die Art der verwendeten Magnetperlen hängt von der Art der Antikörper ab. - Waschen Sie Perlen mit 1 ml Blockierlösung (Tabelle 2), gut mischen, dann auf einem magnetischen Rack für 1 min legen. Während Sie sich noch auf einem magnetischen Rack aufbenötigen, entfernen Sie den Überstand, sobald es klar ist.
- Fügen Sie 1 ml Blockierlösung zu den magnetischen Perlen hinzu. Felsröhren für 10 min bei 4 °C auf einer Schaukelplattform. Drehen Sie kurz, legen Sie dann Rohre auf ein magnetisches Rack und entfernen Sie Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 5.3 zwei weitere Male.
- Fügen Sie magnetischen Perlen 500 l Blockierlösung hinzu. Drehen Sie den Antikörper kurz gegen Isl1 (0,04 g/l, Materialtabelle),und fügen Sie dann 4 g Antikörper zu entsprechenden 2 ml Protein-Low-Bind-Röhrchen hinzu, die die magnetischen Perlen in der Blockierlösung enthalten.
- Wiederholen Sie Schritt 5.5 ohne Antikörper (d. h. die keine Antikörperkontrolle für ChIP).
HINWEIS: Die Menge an hinzuzufügendem Antikörper kann empirisch unter Berücksichtigung der Qualität des Antikörpers und der Anzahl der für ChIP verwendeten Zellen bestimmt werden. - Gesteinsproben bei 4 °C für 6 bis 24 h auf einer Schaukelplattform.
6. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
- Waschen Sie antikörperbeschichtete Perlen aus Schritt 5.8 mit 1 ml Blockierlösung. Proben bei 4 °C für 5 min auf eine Schaukelplattform legen. Überstand entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 6.1 zwei weitere Male.
- Antisuspend-Antikörper-beschichtete Perlen in 50 l Blockierlösung, dann in neue 2 ml Protein-Low-Bind-Röhren übertragen. Fügen Sie für jede ChIP-Probe beschallte Lysate (1,0 ml ab Schritt 3,6) zu antikörperbeschichteten Perlen in 2 ml proteinarmen Rohren hinzu.
- Jede Probe über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelplattform inkubieren.
7. ChIP-Wähungen
HINWEIS: Bewahren Sie Proben auf Eis oder bei 4 °C auf, um die Protein-DNA-Vernetzung während der ChIP-Wasszusungen aufrechtzuerhalten.
- Machen Sie hohen Salzwaschpuffer, LiCl-Waschpuffer und 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.4) wie in Tabelle 3beschrieben. In 50 ml-Rohren bei 4 °C lagern. Fügen Sie alle Puffer kurz vor der Verwendung mit 50 L 1000x CPI-Lager hinzu.
- Kurz Drehen Sie Proben in 2 ml Protein-Low-Bind-Röhren, um Flüssigkeit aus den Kappen zu sammeln, dann legen Sie auf einem magnetischen Rack für 1 min und entfernen Sie Überstand sorgfältig mit einer Pipette.
- Für ChIP-Waschungen 1 ml Lysepuffer 3 (bei 4 °C) zu jedem Rohr hinzufügen. Auf einer Schaukelplattform bei 4 °C für 5 min mischen. Kurz Proben drehen, dann 1 min auf ein Magnetischer Rack legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 1 ml kalten hochsalzen Waschpuffer zu jedem Rohr hinzu. Auf einer Schaukelplattform bei 4 °C für 5 min mischen. Kurz Proben drehen, dann 1 min auf ein Magnetischer Rack legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 1 ml kalten LiCl-Waschpuffer in jedes Rohr. Auf einer Schaukelplattform bei 4 °C für 5 min mischen. Kurz Proben drehen, dann 1 min auf ein Magnetischer Rack legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 1 ml kalten 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.4) zu jedem Rohr hinzu. Auf einer Schaukelplattform bei 4 °C für 5 min mischen. Kurz Proben drehen, dann 1 min auf ein Magnetischer Rack legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
HINWEIS: Tris-EDTA-Puffer (pH 8.0) kann anstelle des Tris-HCl-Puffers (pH 7.4) verwendet werden. - Wiederholen Sie die Schritte 7.4 x 7.6 dreimal.
- Übertragen Sie die Probenperlen mit 500 l Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) in frische 1,5 ml-Rohre. Kurz Proben drehen, dann 1 min auf ein Magnetischer Rack legen und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
8. Endreparatur und dA-Tailing-Reaktion auf Perlen
HINWEIS: Beschallung erzeugt oft nicht stumpfendete dsDNA. Eine End-Reparatur-Reaktion ist erforderlich, um stumpfendete DNA vor der dA-Tailing-Reaktion, gefolgt vom Indexadapter-Ligationsschritt, herzustellen. Für klebrige End-DNA-Ligation mit Indexadapter-DNA wird dATP durch die dA-Schwanzreaktion am 3'-Ende eines stumpfen dsDNA-Fragments hinzugefügt. End-Prep-Reaktions-Mix enthält dATP.
- Nach dem ChIP-Einwass 38 l autoklavierte ddH2O zu den Probenperlen in 1,5 ml-Rohren für Dieendreparatur und dA-Tailing-Reaktion hinzufügen.
- Fügen Sie jeder Probe 5,6 l Endvorbereitungsreaktionsmix und 2,4 l Endvorbereitungsenzymmix (Materialtabelle) hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 46 l). Proben bei 20 °C für 30 min inkubieren.
- Waschen Sie Perlen, wie in früheren ChIP-Waschschritten 7.4-7.6 beschrieben.
9. Index Adapter Ligation auf Perlen
HINWEIS: Der Indexadapter verfügt über 6-10 Basen von Barcode-Indexsequenzen, die spezifisch für eine bestimmte Probe sind, die zum Multiplexen mehrerer Samples in der Sequenzierung mit hohem Durchsatz verwendet wird. Indexadapter-DNA-Sequenzen sind in Tabelle 1beschrieben.
- Für die Indexadapterligation 27 l kalten 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7.4) zu den Probenperlen hinzufügen. Fügen Sie jeder Probe 2 L mit 15 M Indexadapter, 0,5 l Ligationsverstärker und 15 l Ligase-Master-Mix (Materialtabelle) hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 44,5 l).
- Proben bei 20 °C für 15 min inkubieren. Waschen Sie Perlen, wie in den Schritten 7.4-7.6 beschrieben.
10. Einfüllreaktion auf Perlen
HINWEIS: Nach der Adapterligation gibt es keine Phosphodiester-Bindung zwischen dem 5' Ende des Adapters und dem 3' Ende der ChIP-DNA. Der Nick kann durch eine Einfüllreaktion repariert werden.
- Fügen Sie den Probenperlen 47 l kalten 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.4) hinzu.
- Machen Sie den Füllreaktionsmix (Tabelle 4 und Tabelle der Materialien) auf Eis.
- Fügen Sie jeder Probe 11,1 L Füllmischung hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 58,1 l). Proben bei 30 °C für 20 min inkubieren. Waschen Sie Perlen, wie in den Schritten 7.4-7.6 beschrieben.
11. Lambda Exonuclease Verdauung auf Perlen
- Nach der Einfüllreaktion auf Perlen 50 l kalte autoklavierte ddH2O zu den Probenperlen hinzufügen.
- Um die ChIP-DNA in 5' bis 3' Richtung zu verdauen, fügen Sie 6 l 10x Lambda-Exonukleasepuffer und 2 l von 5 U/L Lambda-Exonuklease hinzu (Materialtabelle, Gesamtreaktionsvolumen: 58 l). Proben bei 37 °C für 30 min inkubieren. Waschen Sie Perlen, wie in den Schritten 7.4-7.6 beschrieben.
12. Elution und Reverse-Vernetzung
- Erstellen Sie den ChIP-Elutionspuffer, wie in Tabelle 5beschrieben.
HINWEIS: Fügen Sie CPI nicht zum ChIP-Elutionspuffer hinzu. - Um ChIP-Proben aus den Perlen zu entkernen, setzen Sie Proben in 75 l ChIP-Elutionspuffer wieder auf und brüten bei 65 °C für 15 min bei 130 x g.
- Den Proben werden 2,5 l von 20 mg/ml Proteinase K (Materialtabelle) hinzugefügt. Kurz Wirbel, dann inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 65 °C.
13. DNA-Extraktion
- Nachdem Proben über Nacht bei 65 °C inkubiert haben, kurz Proben drehen, 1 min auf ein Magnetgestell legen und dann den Überstand von jeder Probe in neue 1,5 ml-Röhren übertragen.
- Fügen Sie den Proben 1 l von 10 mg/ml RNase A hinzu. Kurz Wirbel, dann inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 30 min. Fügen Sie bis zu 100 L autoklavierten ddH2O hinzu.
- Reinigen Sie DNA mit magnetischen Perlen (Tabelle der Materialien). Elute-DNA mit 16 l autoklavierter ddH2O oder nukleasefreier ddH2O.
14. Denaturieren, Primerglühen und Primerverlängerung
- Übertragen Sie nach ChIP-Elution und Umgekehrter Vernetzung 16 l der extrahierten DNA-Proben aus Schritt 13.3 in PCR-Röhren.
- Denaturieren und Grundieren glüht mischen (Tabelle 6 und Tisch aus Materialien) auf Eis. Fügen Sie jeder Probe 1,2 L Denaturierung und Primer-Glüh-Mischung hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 17,2 l). Führen Sie Proben mit dem in Tabelle 6 beschriebenen Programm aus, um die Vorlagen-DNA zu denaturieren und zu entwerten.
- Primer-Erweiterungsmischung (Tabelle 7 und Materialtabelle) auf Eis.
- Sobald das Programm zur Denaturierung und der Nealprimer abgeschlossen ist, fügen Sie den Proben 3 l Primer-Erweiterungsmischung hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 20,2 l). Führen Sie Beispiele mit dem Programm für die Primererweiterung aus, wie in Tabelle 7beschrieben.
- Gehen Sie sofort mit der dA-tailing Reaktion fort.
15. dA-Tailing-Reaktion
HINWEIS: Für klebrige End-DNA-Ligation mit universeller Adapter-DNA wird dATP durch die dA-Tailing-Reaktion zum 3'-Ende der stumpfen dsDNA hinzugefügt.
- Machen Sie dA-tailing Mischung (Tabelle 8 und Tabelle der Materialien) auf Eis.
- Fügen Sie jeder Probe 4,1 L dA-Tailing-Mischung hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 24,3 l). Führen Sie Samples mit dem Programm für dA-tailing aus (Tabelle 8).
- Gehen Sie sofort zur universellen Adapterligation.
16. Universelle Adapterligation
HINWEIS: Der universelle Adapter enthält Sequenzierungsspezifische Sequenzen mit hohem Durchsatz für die DNA-Probenerkennung für die Sequenzierungschemie. Die universellen Adapter-DNA-Sequenzen sind in Tabelle 1beschrieben.
- Nach dA-Tailing-Reaktion, machen universelle Adapter Ligation Mix (Tabelle 9 und Tabelle der Materialien) für universelle Adapterligation.
- Zu jeder Probe 21,5 l hinzufügen (Gesamtreaktionsvolumen: 45,8 l) und Proben für 15 min bei 20 °C inkubieren.
17. DNA-Reinigung
- Reinigen Sie DNA mit magnetischen Perlen (Tabelle der Materialien). Elute-DNA mit 21 l autoklavierter ddH2O oder nukleasefreier ddH2O.
- Speichern Sie Proben bei -20 °C, bis sie bereit sind, ligationsvermittelte PCR (LM-PCR) und PCR-Reinigung durchzuführen.
18. Ligationsvermittelte PCR
HINWEIS: LM-PCR-Primersequenzen sind in Tabelle 1beschrieben.
- Nach der DNA-Bereinigung LM-PCR-Mix (Tabelle 10 und Materialtabelle) auf Eis.
- Fügen Sie jeder Probe 29 L LM-PCR-Mix hinzu (Gesamtreaktionsvolumen: 50 L) und führen Sie Samples mit dem Programm für LM-PCR (Tabelle 10) aus.
- Gehen Sie sofort mit der Gelreinigung der PCR-verstärkten DNA fort, gefolgt von der DNA-Reinigung für die Hochdurchsatzsequenzierung.
19. DNA-Purififikation von LM-PCR-verstärkter DNA
- Führen Sie die LM-PCR-verstärkten DNA-Proben zusammen mit einer DNA-Leiter in einem 1,5% Agarose-Gel bei 120 bis 180 V und verbrauchen 200–400 bp-Bänder.
- Reinigen Sie die DNA aus dem ausgeschnittenen Gel mit einem Gel-Extraktions-Kit (Tabelle der Materialien).
- Überprüfen Sie nach der DNA-Reinigung die Konzentration (Materialtabelle) jeder ChIP-exo-Bibliotheksprobe. Senden Sie Beispiele für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz für die Sequenzierung mit nur einem Lesesatz.
HINWEIS: Die bevorzugte Leselänge für die Single-Read-Sequenzierung beträgt mindestens 35 bp, was ausreicht, um die Sequenzierungslesevorgänge eindeutig am Referenzgenom in Maus- oder menschlichen Zellen auszurichten. Für die meisten Transkriptionsfaktoren in Maus- oder menschlichen Zellen reichen 10 bis 20 Millionen Lesevorgänge pro ChIP-Exo-Probe aus, um ihre genomischen Bindungsstellen zu identifizieren. Mindestens 30 Millionen Lesevorgänge pro Probe sind erforderlich, um genomische Regionen zu kartieren, die in Histonspuren in Säugetierzellen angereichert sind.
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Representative Results
Abbildung 2A zeigt die Beschallungsergebnisse nach Zelllyse und Beschallung, mit verschiedenen Zyklen, von motorischen Neuronenzellen, die von Maus-ES-Zellen unterschieden werden. Die optimale Anzahl von Beschallungszyklen (z. B. 12 Zyklen in Abbildung 2A) erzeugte eine starke DNA-Intensität in DNA-Fragmenten von 100 bis 400 bp. Hochwertige ChIP-Exo-Bibliotheken basieren auf der Größe und Menge der fragmentierten Chromatin-DNA. Daher wird die Optimierung der Beschallung für jeden Zelltyp und Zellbatch empfohlen, bevor ChIP-exo gestartet wird.
Abbildung 2B zeigt ligationsvermittelte PCR-Produkte (LM-PCR) der ChIP-exo DNA-Proben, die durch 18-21 PCR-Zyklen verstärkt werden. LM-PCR verstärkt ChIP-exo DNA-Fragmente, die mit DNA-Adaptern für die Sequenzierung der nächsten Generation ligiert sind. PCR Primer ist ein Teil der DNA-Adaptersequenzen. Die Größe der beschallten DNA-Fragmente liegt bei etwa 100 bis 400 bp (Abbildung 2A). Nach der Lambda-Exonuklease-Verdauung würde die Größe der DNA-Fragmente die halbe Größe des Ausgangsmaterials (50-200 bp) werden. Ungefähr 125 bp DNA-Adapter wurden an die ChIP-exo DNA-Fragmente ligiert, so dass die erwartete Größe der LM-PCR-Produkte 175-325 bp beträgt. Die minimale Anzahl von PCR-Zyklenc, während sie immer noch ausreicht, um die ChIP-exo-Bibliothek zu verstärken, wird durchgeführt, um eine Überverstärkung der ChIP-exo-DNA zu vermeiden.
Hier wurde ChIP-exo für Isl1 in Maus-ES-Zell-abgeleiteten motorischen Neuronen durchgeführt. Isl1 ist ein Transkriptionsfaktor für die Programmierung des Motors, der sich speziell in postmitotischen motorischen Neuronen ausdrückt. Die Ergebnisse für Isl1 ChIP-exo zeigen signifikante Mengen von 200 x 400 bp LM-PCR-verstärkte ChIP-exo DNA (Abbildung 2B). Das Band um 100 bp zeigt PCR-Artefakte von Adaptern und PCR-Primern an. Eine No-Antikörper-Kontrolle neben einer experimentellen Probe ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass unspezifische Hintergrund-DNA durch die Lambda-Exonuklease-Behandlung verdaut wurde. Als Beispiel haben wir Isl1-gebundene Positionen in Maus-ES-Zell-abgeleiteten motorischen Neuronen mit ChIP-exo und ChIP-seq (Abbildung 3) identifiziert. Das ChIP-exo-Signal war hochkonzentriert an Isl1-Bindungsstellen und entdeckte mehrere gruppierte Isl1-Transkriptionsfaktorbindungsmuster. Das ChIP-seq-Signal zeigte breitere Signale an, was darauf hindeutet, dass ChIP-exo von Isl1 eine höhere Mapping-Auflösung hat als ChIP-seq von Isl1.
Abbildung 1: Schematic des ChIP-exo-Protokolls. Nach ChIP (Schritte 1-7) machen die Endreparatur- und dA-Tailing-Reaktionen Die ChIP-DNA stumpf, indem sie eine Phosphatgruppe am 5'-Ende der DNA hinzufügen und dATP am 3'-Ende der DNA (Schritt 8) hinzufügen. Beschallte Enden der ChIP-DNA, auf den Perlen sind mit dem Indexadapter (Schritt 9) ligiert. Nach der Einfüllreaktion wird die Adapter-DNA mit dem 5' Überhang stumpf (Schritt 10). Lambda exonuklease verdaut die beschallte DNA 5' bis 3' bis zum Protein (TF)-DNA-Vernetzungspunkte (Schritt 11). Nach Elution, Reverse-Crosslinking und DNA-Extraktion (Schritte 12 und 13) wird denaturierte einsträngige DNA durch Index-PCR-Primer-Erweiterung (Schritt 14) doppelsträngig gemacht, gefolgt von dA-tailing (Schritt 15). Der Universaladapter wird dann an das exonukleasebehandelte Ende (Schritt 16) geguntert. Die resultierende Bibliothek wird bereinigt, PCR-verstärkt und der Sequenzierung der nächsten Generation unterzogen (Schritte 17-19). Die Kartierung der 5' Enden der resultierenden Sequenzierungs-Tags zum Referenzgenom dekargraphiert die Exonukleasebarriere und damit die genaue Stelle der Protein-DNA-Vernetzung.
Abbildung 2: Beschallung und LM-PCR-Verstärkung einer ChIP-exo-Bibliothek. (A) 1,5% Agarosegel der elektrophoresierten beschallten DNA. 12, 18 und 24 Zyklen der Beschallung wurden durchgeführt, um optimale Beschallungszyklen für 2 x 107 Zellen von Maus ES-Zell-abgeleiteten motorischen Neuronen zu finden. Nach der Beschallung wurde die DNA-Probe umgekehrt vernetzt und mit PCIA- und Ethanolfällung extrahiert. Jede Probe enthielt 4 x 105 Zelläquivalente, was 2% der beschallten Zellen entspricht. 12 Zyklen der Beschallung erzeugten eine größere Ausbeute an beschallter DNA mit der gewünschten Größe (100 bis 500 bp). (B) 1,5% Agarose-Gel von elektrophoresierten ChIP-Exo-Bibliotheken nach 18-21 Zyklen LM-PCR für keine Antikörperkontrolle (No Ab) und Isl1 in Maus ES-Zell-abgeleiteten motorischen Neuronen. Jede Probe enthielt 10 x 106 Zellenäquivalente von Mausmotorneuronen. Das No-Antikörper-ChIP-exo-Ergebnis (Lane 2) zeigt, dass unspezifische, kontaminierende DNA durch Lambda-Exonuklease eliminiert wird. Die ChIP-exo-Bibliotheken für Isl1 (Lane 3) zeigen verstärkte DNA-Bibliotheken um 200 bis 400 bp, was darauf hindeutet, dass die ChIP-exo-Bibliotheken erfolgreich durch Adapterligations-vermittelte PCR verstärkt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich von ChIP-exo mit ChIP-seq für Isl1 an bestimmten Loci. Die blau und rot gefüllten Diagramme zeigen die Verteilung von Sequenzierungs-Tags für ChIP-seq- und ChIP-exo Isl1-gebundene Positionen, proximal zu Slit3 und Fgfr1-Gen in aufkommenden spinalen motorischen Neuronen, die von Maus-ES-Zellen unterschieden sind.
Tabelle 1: Oligonukleotide, die in diesem Protokoll verwendet werden.
| Oligo-Name | Länge (nt) | Sequenz | Hinweis | |||||
| Indexadapter-Forward* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' Phosphat, Index (XXXXXXXX), 3' T-Überhang | |||||
| Indexadapter-Reverse* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Ligationadapter-Forward* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTCTCTCCTACACGACGCTCTCCGATCT 3' | ||||||
| Ligationadapter-Reverse* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Index PCR Primer* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Universelle PCR-Grundierung* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Die oben genannten Sequenzierungsadapter und PCR-Primer sind für Illumina HiSeq und NextSeq Sequencing-Plattformen konzipiert. | ||||||||
Tabelle 2: Rezepte für Lysepuffer 1-3 und Blockierpuffer. In 50 ml-Rohren bei 4 °C lagern. Fügen Sie alle Puffer kurz vor der Anwendung 50 L 1000x CPI (Complete Protease Inhibitor) zu alle Puffer hinzu.
| Lysispuffer 1 | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% Glycerin | 10 | 10% |
| 10% Octylphenolethoxylat | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
| Lysispuffer 2 | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
| Lysispuffer 3 | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% Desoxycholsäure | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Lauroylsarcosin Natriumsalzlösung | 0.83 | 0.50% |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
| Blockierlösung | ||
| Reagenz | Menge | [Endgültig] |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Kompletter Protease-Hemmer (CPI, 1000x) | 50 l | 1x |
| Phosphatgepufferte Saline (PBS) | Füllung auf 50 ml | |
Tabelle 3: Rezepte für ChIP-Waschungen: Hoher Salzwaschpuffer, LiCl-Waschpuffer und 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.4). In 50 ml-Rohren bei 4 °C lagern. Fügen Sie alle Puffer kurz vor der Verwendung mit 50 L 1000x CPI-Lager hinzu.
| Hoher Salzwaschpuffer | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol | 5 | 1% |
| 5% Desoxycholsäure | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
| LiCl-Waschpuffer | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| 10% Octylphenolethoxylat | 2.5 | 0.50% |
| 5% Desoxycholsäure | 5 | 0.50% |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
| 10 mM Tris-HCl Puffer | ||
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoklavierte ddH2O | Füllen auf 50 | |
Tabelle 4: Fill-in-Reaktions-Master-Mix.
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.6 | 0,2 mg/ml |
| 10x phi29 DNA-Polymerasepuffer | 6 | 1x |
| 3 mM dNTPs | 2.5 | 150 m |
| 10 U/L phi29 DNA-Polymerase | 2 | 10 U |
| Reaktionsmixvolumen | 11.1 |
Tabelle 5: Rezept für ChIP Elution Puffer. 50 ml Rohre bei RT aufbewahren.
| Reagenz | Volumen (mL) | [Endgültig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoklavierte ddH2O | bis 50 ml |
Tabelle 6: Denaturing und Primer Annealing Reaktion Master Mix und Programm.
| Denaturing und Primer-Glüh-Mix | ||
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.2 | 0,2 mg/ml |
| 3 mM dNTPs | 0.5 | 75 m |
| 10 M Index PCR-Primer | 0.5 | 0,25 m |
| Reaktionsmixvolumen | 1.2 | |
| Deaturing- und Primer-Glühprogramm | ||
| Temperatur (°C) | Zeit | |
| 95 | 5 Min. | |
| 65 | 3 Min. | |
| 60 | 3 Min. | |
| 57 | 3 Min. | |
| 54 | 3 Min. | |
| 51 | 3 Min. | |
| 30 | ewig | |
Tabelle 7: Primer Extension Reaktion Master Mix und Programm.
| Primer-Erweiterungsmix | ||
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| 10x phi29 DNA-Polymerasepuffer | 2 | 1x |
| 10 U/L phi29 DNA-Polymerase | 1 | 75 m |
| Reaktionsmixvolumen | 3 | |
| Primer-Erweiterungsprogramm | ||
| Temperatur (°C) | Zeit | |
| 30 | 20 Min. | |
| 65 | 10 Min. | |
| 4 | ewig | |
Tabelle 8: dA-Tailing Reaktionsmaster-Mix und -Programm.
| dA-Tailing-Mix | ||
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 m |
| Klenow-Fragmentpuffer | 2.4 | 1x |
| 5 U/L Klenow-Fragment | 1 | 5 U |
| Reaktionsmixvolumen | 4.1 | |
| dA-Tailing-Programm | ||
| Temperatur (°C) | Zeit | |
| 37 | 30 Min. | |
| 75 | 20 Min. | |
| 4 | ewig | |
Tabelle 9: Universal Adapter Ligation Reaktion Master Mix.
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| Autoklaviertes Wasser | 5 | |
| 15 M Universaladapter* | 1 | 320 nM |
| Ligation Enhancer | 0.5 | 1x |
| Ligase Master Mix | 15 | 1x |
| Reaktionsmixvolumen | 21.5 | |
| *Universelle Adapter-DNA-Sequenz ist in Tabelle 1beschrieben. | ||
Tabelle 10: Ligation-Mediated PCR Master Mix und Programm.
| LM-PCR-Mix | ||
| Reagenz | 1x (L) | [Endgültig] |
| 10 M Index PCR Primer* | 2 | 0,2 m |
| 10 M Universal PCR Primer* | 2 | 0,2 m |
| 2x Taq DNA Polymerase PCR Master Mix | 25 | 1x |
| Reaktionsmixvolumen | 29 | |
| *PCR-Primersequenzen sind in Tabelle 1beschrieben. | ||
| LM-PCR-Programm | ||
| Temperatur (°C) | Zeit | Zyklen |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15-25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 Min. | 1 |
| 4 | Halten | |
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Discussion
In diesem Protokoll wird ChIP, gefolgt von Exonuklease-Verdauung, verwendet, um DNA-Bibliotheken zur Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Säugetierzellen mit ultrahoher Kartierungsauflösung zu erhalten. Viele Variablen tragen zur Qualität des ChIP-exo-Experiments bei. Zu den kritischen experimentellen Parametern gehören die Qualität von Antikörpern, die Optimierung der Beschallung und die Anzahl der LM-PCR-Zyklen. Diese kritischen experimentellen Parameter sind auch, was ChIP-exo-Experimente begrenzen kann und wird unten diskutiert werden.
In jedem ChIP-Protokoll ist die Qualität von Antikörpern eine der wichtigsten Überlegungen. Die Verwendung von ChIP-Antikörpern wird für ChIP-exo empfohlen. Die Antikörperqualität kann vor der Durchführung des ChIP-exo-Protokolls überprüft werden. ChIP-seq oder ChIP-qPCR können verwendet werden, um ChIP-grade Antikörper zu validieren, indem spezifische DNA-bindende Stellen des Proteins von Interesse bestätigt werden. Anschließend ist die Optimierung der Konzentration von Antikörpern, die den Perlen zugesetzt werden, ideal, um sicherzustellen, dass Protein-DNA-Komplexe immunpräzipiert sind22,23.
Die Beschallung von Chromatin ist ein weiterer wichtiger Schritt im ChIP-exo-Protokoll. Die Beschallung ist entscheidend für das unspezifische Scheren von Chromatin, das für eine optimale Immunpräzipitation des von Interesse sindden Proteins24notwendig ist. Die Größe und Menge der beschallten DNA sind abhängig von der Anzahl der Beschallungszyklen. Eine hohe Konzentration fragmentierter DNA ist wichtig, um sicherzustellen, dass genügend DNA immunprezipitiert wird, um das Protein von Interesse zu erhalten, damit eine ChIP-exo DNA-Bibliothek erstellt werden kann. Die Gewinnung von 100-500 bp fragmentierter DNA ist ideal, da die Auflösung von ChIP-exo besser ist, wenn die beschallten Chromatinfragmente kleinere Startgrößen haben. Daher sollte die optimale Chromatinbeschallung für jeden Zelltyp und jede Zellcharge bestimmt werden, indem die Anzahl der Beschallungszyklen und Beschallungspuffer variiert wird.
Der letzte kritische Parameter ist die Verstärkung der ChIP-exo-Bibliotheks-DNA mit der minimalen Anzahl von LM-PCR-Zyklen, um eine Überverstärkung von PCR-Artefakten zu vermeiden. Um die minimale Anzahl von PCR-Zyklen zur Verstärkung der ChIP-Exo-DNA zu bestimmen, kann ein kleiner Teil der ChIP-Exo-DNA verwendet werden, um mehrere PCR-Zyklen (z. B. 10, 15 und 20 Zyklen) auszuführen und die PCR-Produkte zu vergleichen.
ChIP-exo hat viel mehr Schritte als ein herkömmliches ChIP-seq und daher sollte jeder Schritt sorgfältig und präzise durchgeführt werden, damit das ChIP-exo-Protokoll funktioniert. Wichtig ist, dass jedem Reaktionsmastermix21das richtige Volumen jedes Reagenzes in enzymatischen Reaktionen zugesetzt werden muss. Daher wird empfohlen, eine Kalkulationstabelle zu erstellen, um das Volumen jedes Reagenzes zu berechnen, das für jeden Mastermix erforderlich ist, dann die Tabellen zu drucken und jedes Reagenz nach Addition der Mastermischungen zu überprüfen. Sorgfältige Exzision der verstärkten DNA ist ebenfalls wichtig; Fragmente unter 200 bp enthalten häufig Adapterdimer, die vor der Sequenzierung der nächsten Generation entfernt werden müssen.
Insbesondere sind die meisten kritischen Parameter und Einschränkungen von ChIP-exo identisch mit denen von ChIP-seq. Im Gegensatz zu ChIP-seq liefert ChIP-exo jedoch hochauflösende Genomkartierungen mit niedrigem Hintergrund. Somit ist ChIP-exo die ideale Methode zur Identifizierung präziser Protein-DNA-Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Systemen und Organismen und hilft dabei, die wichtige Rolle von DNA-bindenden Proteinen in der Zelle aufzudecken. Die oben beschriebene ChIP-exo-Methode kann verwendet werden, um Transkriptionsfaktoren, Histonmodifikationsmarkierungen und Chromatin-Regulierungsproteine in lebenden Zellen mit höherer Kartierungsauflösung als ChIP-seq25,26,27zu untersuchen. Darüber hinaus kann ChIP-exo die einzelnen Bindungspositionen von DNA-bindenden Proteinen innerhalb eines Clusters erkennen, während ChIP-seq aufgrund seiner Mapping-Auflösung nicht möglich ist. Wichtig ist, dass ChIP-exo ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu ChIP-seq aufweist. Diese Vorteile von ChIP-exo ermöglichen es uns, einen umfassenden Satz gebundener Standorte im gesamten Genom zu identifizieren. Dieses Protokoll wird eine Grundlage für Forscher bieten, die an der Untersuchung von DNA-bindenden Positionen verschiedener Proteine im gesamten Genom in nahezu Base-Pair-Auflösung interessiert sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem Mitglied des Rhee-Labors für den Austausch unveröffentlichter Daten und wertvoller Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Stipendium RGPIN-2018-06404 (H.R.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
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