Summary
Præcis bestemmelse af proteinbindende steder på tværs af genomet er vigtig for forståelsen af genregulering. Her beskriver vi en genomisk kortlægningsmetode, der behandler chromatin-immunoprecipitated DNA med exonuklease fordøjelse (ChIP-exo) efterfulgt af højgennemstrømning sekventering. Denne metode registrerer protein-DNA-interaktioner med nær base-pair kortlægning opløsning og høj signal-til-støj-forholdet i pattedyr neuroner.
Abstract
Identifikation af specifikke protein-DNA-interaktioner på genomet er vigtig for forståelsen af genregulering. Chromatin immunoprecipitation kombineret med høj-gennemløb sekventering (ChIP-seq) er meget udbredt til at identificere genom-dækkende bindende steder af DNA-bindende proteiner. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrænset af dens heterogenitet i længden af sonikerede DNA-fragmenter og ikke-specifik baggrunds-DNA, hvilket resulterer i lav kortlægningsopløsning og usikkerhed på DNA-bindingssteder. For at overvinde disse begrænsninger bruger kombinationen af ChIP med exonuklease fordøjelse (ChIP-exo) 5' til 3'exonuklease fordøjelse til at trimme det heterogene størrelse immunoprecipiterede DNA til protein-DNA crosslinking-stedet. Exonuklease behandling eliminerer også ikke-specifik baggrunds-DNA. Det biblioteksforberedte og eksorklease fordøjede DNA kan sendes til sekvensering med høj gennemløb. ChIP-exo-metoden giver mulighed for næsten basispartilknytningsopløsning med større registreringsfølsomhed og reduceret baggrundssignal. En optimeret ChIP-exo-protokol til pattedyrsceller og næste generations sekventering er beskrevet nedenfor.
Introduction
Placeringen af protein-DNA-interaktioner giver indsigt i mekanismerne for genregulering. Chromatin immunoprecipitation kombineret med høj gennemstrømningssekvensering (ChIP-seq) har været brugt i et årti til at undersøge genom-dækkende protein-DNA-interaktioner i levende celler1,2. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrænset af heterogenitet i DNA-fragmentering og ubundet DNA-forurening, der fører til lav kortlægningsopløsning, falske positiver, ubesvarede opkald og ikke-specifikt baggrundssignal. Kombinationen af ChIP med exonuklease fordøjelse (ChIP-exo) forbedrer ChIP-seq-metoden ved at trimme ChIP DNA til protein-DNA crosslinking-punkterne, hvilket giver nær base-pair-opløsning og et lavt baggrundssignal3,4,5. Den stærkt forbedrede kortlægningsopløsning og lave baggrund fra ChIP-exo gør det muligt at bestemme nøjagtige og omfattende protein-DNA-bindingssteder på tværs af genomet. ChIP-exo er i stand til at afsløre funktionelt forskellige DNA-bindende motiver, samarbejdsinteraktioner mellem transskriptionsfaktorer (TF) og flere protein-DNA-krydslinkingsteder på et bestemt genomisk bindingssted, der ikke kan påvises ved andre genomiske kortlægningsmetoder3,4,6,7.
ChIP-exo blev oprindeligt brugt i spirende gær til at undersøge den sekvensspecifikke DNA-binding af TF'er, til at studere den nøjagtige organisering af transskriptionsforstartskomplekset og subkernestrukturen af individuelle histoner på tværs af genomet4,8,9. Siden introduktionen i 20114er ChIP-exo med succes blevet udnyttet i mange andre organismer, herunder bakterier, mus og menneskelige celler7,10,11,12,13,14,15,16,17. I 2016 brugte Rhee et al.14 ChIP-exo i pattedyrsneuroner for første gang for at forstå, hvordan neuronalt genekspression blev opretholdt efter nedreguleringen af programmeringen TF Lhx3, som danner et heterodimer kompleks med en anden programmering TF Isl1. Denne undersøgelse viste, at Isl1 i mangel af Lhx3 rekrutteres til nye neuronale forstærkere bundet af Onecut1 TF for at opretholde genekspression af neuronale effektorgener. I denne undersøgelse afslørede ChIP-exo, hvordan flere TF'er dynamisk genkender celletype og cellestadiespecifikke DNA-reguleringselementer på en kombinatorisk måde ved næsten nukleotidkortopløsning. Andre undersøgelser brugte også ChIP-exo-metoden til at forstå samspillet mellem proteiner og DNA i andre pattedyrscellelinjer. Han et al.7 brugte ChIP-exo til at undersøge genom-dækkende organisering af GATA1 og TAL1 TF'er i mus erythroid celler ved hjælp af ChIP-exo. Denne undersøgelse viste, at TAL1 er direkte rekrutteret til DNA snarere end indirekte gennem protein-protein interaktioner med GATA1 hele erythroid differentiering. Nylige undersøgelser også brugt ChIP-exo til at profilere genom-dækkende bindende steder CTCF, RNA Polymerase II, og histone mærker til at studere epigenomiske og transskriptionelle mekanismer i menneskelige cellelinjer18,19.
Der findes flere versioner af ChIP-exo-protokollen3,5,20. Disse ChIP-exo-protokoller er dog vanskelige at følge for forskere, der ikke er bekendt med næste generations sekventeringsbiblioteksforberedelse. En fremragende version af ChIP-exo-protokollen blev offentliggjort med let at følge instruktioner og en video21, men indeholdt mange enzymatiske trin, der kræver en betydelig mængde tid at gennemføre. Her rapporterer vi en ny version af ChIP-exo-protokollen, der indeholder reducerede enzymatiske trin og inkubationstider og forklaringer til hvert enzymatisk trin21. Slutreparations- og dA-tailing-reaktioner kombineres i et enkelt trin ved hjælp af endeforberedelsesenzym. Inkubationstiden for indeks- og universaladapterens ligationstrin reduceres fra 2 timer til 15 min. ved hjælp af en ligationforstærker. Kinasereaktionen efter det ligationstrin for indeksadapteren, der er beskrevet i den forrige ChIP-exo-protokol, fjernes. I stedet tilsættes en fosfatgruppe under oligo-DNA-syntesen til en af indeksadapterens 5 ender (tabel 1), som vil blive brugt til lambda exonuklease fordøjelsestrinnet. Mens den tidligere ChIP-exo-protokol brugte RecJf exonuclease fordøjelsen til at eliminere enkeltstrengede DNA-forurenende stoffer, fjernes dette fordøjelsestrin her, fordi det ikke er kritisk for kvaliteten af ChIP-exo-biblioteket. For at rense omvendt krydslinket DNA efter ChIP-udsmeltning anvendes desuden en magnetisk perlerensningsmetode i stedet for ekstraktionsmetoden phenol:chloroform:isoamylalkohol (PCIA). Dette reducerer inkubationstiden for DNA-ekstraktion. Det er vigtigt, at det fjerner de fleste adapter dimers dannet under indeksadapter ligation, hvilket kan påvirke effektiviteten af ligation-medieret PCR.
ChIP-exo-protokollen, der præsenteres her, er optimeret til påvisning af præcise protein-DNA-interaktioner i pattedyrsneuroner, der er differentieret fra musefosterstamceller (ES). Kort, høstede og crosslinked neuronale celler lysed, at tillade chromatin at blive udsat for sonikering, derefter sonikeret således, at passende størrelse DNA-fragmenter er opnået (Figur 1). Antistofbelagte perler anvendes derefter til selektivt at immunoprecipitate fragmenteret, opløselig kromatin til protein af interesse. Mens det immunoprecipiterede DNA stadig er på perlerne, udføres endereparation, ligation af sekventeringsadaptere, udfyldningsreaktion og 5' til 3' lambda exonuclease fordøjelsestrin. Exonuklease fordøjelsestrinnet er det, der giver ChIP-exo sin ultrahøje opløsning og høje signal-til-støj-forhold. Lambda exonuclease trimmer immunoprecipiteret DNA et par base-par (bp) fra crosslinking site, hvilket forårsager forurenende DNA, der skal nedbrydes. Det exonukleasebehandlede ChIP DNA er udvisket fra de antistofbelagte perler, protein-DNA crosslinks vendes, og proteiner nedbrydes. DNA udvindes og denatureres til enkeltstrenget ChIP DNA, efterfulgt af primer annealing og udvidelse til at lave dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Dernæst udføres ligation af en universel adapter til de exonukleasebehandlede ender. Den resulterende DNA renses, derefter PCR forstærkes, gel renset, og udsættes for næste generation sekventering.
ChIP-exo-protokollen er længere end ChIP-seq-protokollen, men er ikke særlig teknisk udfordrende. Enhver vellykket immunoprecipiteret ChIP DNA kan udsættes for ChIP-exo, med flere yderligere enzymatiske trin. De bemærkelsesværdige fordele ved ChIP-exo, såsom ultrahøj kortlægningsopløsning, et reduceret baggrundssignal og reducerede falske positive og negativer med hensyn til genomiske bindingssteder, opvejer tidsomkostningerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Autoklaveret destilleret og deioniseret vand (ddH2O) anbefales til fremstilling af buffere og reaktionsmasterblandinger. Afsnit 1−4 beskriver celle lysis og sonikering, afsnit 5−7 beskriver chromatin immunoprecipitation (ChIP), afsnit 8−11 beskriver enzymatiske reaktioner på perler, afsnit 12 og 13 beskriver ChIP elution og DNA-rensning, og afsnit 14−19 beskriver biblioteksforberedelse.
1. Høst og krydsning af celler
- Efter at have differentieret mus ES celler i postmitotiske neuroner, tilføje 11% formaldehyd til de høstede celler til en endelig koncentration på 1% (v / v). Rockceller på en gyngeplatform (en rocker, shaker eller rotator) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT, 25 °C).
BEMÆRK: Afhængigt af det målprotein, der skal krydses, er der mindre formaldehydkrydsning (f.eks. en endelig koncentration på 0,5 %) eller dobbelt crosslinking med disuccinimidylglutat (DSG) kan bruges. - Der tilsættes 2,5 M glycin til en endelig koncentration på 150 mM for at stoppe krydskoblingsreaktionen. Rock celler på en gyngeplatform på RT, i 5 min.
- Centrifuge de krydsede celler i 15 mL koniske rør ved RT, i 6 min, ved 1.350 x g. Aspirér opløsningen, og genbrug derefter celler i 5 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: De krydsbundne cellepiller kan opbevares ved -80 °C efter flammefrysning med flydende nitrogen.
2. Celle lysis
BEMÆRK: Følgende trin i denne protokol er for ca. 2 x 107 neuronale celler differentieret fra mus ES-celler. For at bryde åbne celler vil lysis buffere, der indeholder forskellige rengøringsmidler, blive brugt. Der tilsættes 50 μL 1000x komplet proteasehæmmer (CPI) lager til 50 mL buffer lige før brug.
- Forbered lysis buffere 1−3 som beskrevet i tabel 2.
- Tø crosslinked celle pellets på is, derefter grundigt resuspend celle pellets i 3 mL lysis buffer 1 i 15 mL koniske rør. Rock ved 4 °C i 15 minutter på en gyngeplatform. Centrifuge ved 1.350 x g i 5 min ved 4 °C og aspirat supernatant.
- Grundigt resuspend pelleterede celler i 3 mL lysis buffer 2. Rock ved 4 °C i 10 minutter på en gyngeplatform. Centrifuge ved 1.350 x g i 5 min ved 4 °C og aspirat supernatant.
- Tilsæt 1 mL lysis buffer 3 til hver pellet, og hold derefter på is. Gå straks videre til sonikering.
3. Soning af kromatin
BEMÆRK: Hold prøverne på is eller ved 4 °C under denne sonikeringsprocedure for at reducere tværgående vending.
- Ved hjælp af en steril spatel tilsættes sonikeringsperler(Tabel over materialer)op til 0,2 mL gradueringsmærket på 15 mL polystyrenrør. Vask sonikeringsperler ved hvirvelstrømning i 600 μL 1x PBS, indtil der ikke er synlige tørre pletter. Centrifuge rørene i 5 s ved 30 x g og aspirat 1x PBS.
BEMÆRK: Sonikering i polystyrenrør er mere effektiv end sonikering i polypropylenrør. Hvis et mindre antal celler (f.eks. <106 celler) er sonikeret, skal du bruge 1,5 mL polystyrenrør uden at tilføje sonikeringsperler. - De nukleare lysater genudnyttes grundigt i 1 mL lysis buffer 3 (fra trin 2.4) og overføres derefter til de 15 mL polystyrenrør, der indeholder sonikeringsperler. Kort vortex polystyren rør.
- For at fragmentere det krydslinkede chromatin-DNA lysater sonicate nuclear ved 4 °C for et optimeret antal cyklusser med effektforstærkning ved 30 W og sonikeringscyklusser indstillet til 30 s til/30 s fra.
BEMÆRK: Optimering af sonikering for hver celletype og batch vil resultere i det bedste ChIP-exo-udbytte. For 2 x 107 mus neuronale celler, 20−30 sonikering cykler på de nævnte indstillinger vil fragmentere kromatin i intervallet 100−500 bp. - Når sonikeringen er afsluttet, overføres alle supernatant (soniske lysater) fra hver prøve til 1,5 mL rør. Der tilsættes 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol) til hver prøve ved en endelig koncentration på 1%. Bland ved pipetting.
- Til pelletcelleaffald udtages centrifugeprøver ved 13.500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Alle sonikerede lysater (supernatant) overføres fra hver prøve til nye 1,5 mL rør.
- Tag 30 μL sonikeret lysat fra hver prøve (~3% af sonikeret lysat) og tilsæt til nye 1,5 mL rør for at kontrollere sonikering. De resterende soniske lysater opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til inkubation med antistofbelagte perler.
4. Kontrol af sonikering
- Der fremstilles 20 mL 2x proteinase K buffer ved tilsætning af 2 mL på 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 mL 0,5 M EDTA, 10 mL 10% natrium dodecyl sulfat (SDS) og 6 mL autoklaveret ddH2O. Føj ikke CPI til denne buffer. Opbevares i 50 mL rør på RT.
- For at vende protein-DNA-krydslinket skal du ved at fjerne proteinerne tage de 30 μL sonikeret chromatin fra hver prøve (fra trin 3.6), tilsætte 166 μL autoklaveret ddH2O 200 μL 2x proteinase K buffer og 4 μL på 20 mg/mL proteinase K. Hvirvler kort prøverne og inkuberes derefter ved 65 °C i 1−3 timer ved 24 x g.
- BEMÆRK: De sonikerede lysater kan vendes på tværs ved 65 °C natten over.
- Ekstrakt DNA ved hjælp af PCIA (25:24:1) og ethanol nedbør metode som følger.
ADVARSEL: PCIA er giftig. Anvendes under en røghætte med standard personlige værnemidler (PPE).- Der tilsættes 400 μL PCIA til hver prøve i 1,5 mL rør, der indstilles vortex til maksimal hastighed og hvirvelprøver i 20 s. Centrifuge ved 18.400 x g i 6 min ved RT. Der vil blive observeret to faser. Det øverste vandige lag (klar fase) af hver prøve overføres forsigtigt til nye 1,5 mL rør.
- Der tilsættes 1 μL på 10 mg/mL RNase A. Inkubatprøver ved 37 °C i 30 min.
- Der tilsættes 1 μL på 20 mg/mL glykogen til hver prøve, hvorefter der tilsættes 1 mL iskold 100% ethanol (opbevares i en fryser på -20 °C). Blandes kort og inkuber derefter prøver i -80 °C fryser i 30 minutter til 1 time. Centrifugeprøver ved 18.400 x g i 10 minutter ved 4 °C og hæld forsigtigt 100% ethanol ud.
- Pellets vaskes med 500 μL iskold 70% ethanol (opbevares i en fryser på -20 °C). Centrifuge ved 18.400 x g i 5 min ved 4 °C. Hæld forsigtigt 70% ethanol ud.
- Inkuber prøver i 1,5 mL rør ved 50 °C, indtil den resterende ethanol er fordampet. Opbrugte DNA-pellets i 15 μL autoklaveret ddH2O eller nukleasefri ddH2O.
- Kør de udvundne DNA-prøver sammen med en DNA-stige i en 1,5% agarosegel ved 120−180 V og kontroller størrelsen af det sonikerede DNA.
5. Antistof inkubation med perler
BEMÆRK: Følgende trin i denne protokol er for ca. 2 x 107 neuronale celler differentieret fra mus ES-celler. Magnetiske perler må ikke fryses og optøs på noget tidspunkt under ChIP-exo-protokollen, da perlerne kan revne, hvilket kan forårsage kontaminering af prøven, eller antistoffets ydeevne kan blive kompromitteret.
- Efter celle lysis og sonikering, forberede Protein G magnetiske perler (Tabel over materialer) for ChIP, bland magnetiske perler indtil homogen, derefter tilføje 25 μL af magnetiske perler til 2 mL protein lav binde rør.
BEMÆRK: Den anvendte type magnetiske perler afhænger af antistoffernes art. - Vask perler med 1 ml blokeringsopløsning (Tabel 2), bland godt, og placer dem derefter på et magnetisk stativ i 1 min. Mens du stadig er på et magnetisk stativ, skal du fjerne supernatant, når det er klart.
- Der tilsættes 1 ml blokeringsopløsning til magnetperlerne. Klipperør i 10 minutter ved 4 °C på en gyngeplatform. Drej kort, placer derefter rør på et magnetisk stativ og fjern supernatant.
- Gentag trin 5.3 to gange mere.
- Der tilsættes 500 μL blokeringsopløsning til magnetiske perler. Antistoffet drejes kortvarigt mod Isl1 (0,04 μg/μL, Materialetabel),hvorefter der tilsættes 4 μg antistof til tilsvarende 2 ml proteinfattige binderør, der indeholder magnetperlerne i blokeringsopløsningen.
- Gentag trin 5.5 uden antistof (dvs. ingen antistofkontrol for ChIP).
BEMÆRK: Mængden af antistof, der skal tilsættes, kan bestemmes empirisk ved at tage hensyn til antistoffets kvalitet og antallet af celler, der anvendes til ChIP. - Stenprøver ved 4 °C i 6−24 timer på en gyngeplatform.
6. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
- Der vaskes antistofbelagte perler fra trin 5.8 med 1 ml blokeringsopløsning. Prøverne anbringes på en rokkeplatform ved 4 °C i 5 min.
- Gentag trin 6.1 to gange mere.
- Resuspend antistofbelagte perler i 50 μL blokeringsopløsning, og overfør derefter til nye 2 ml proteinfattige binderør. For hver ChIP-prøve tilsættes soniske lysater (~1,0 mL fra trin 3.6) til antistofbelagte perler i 2 mL proteinfattige binderør.
- Hver prøve inkuberes på en gyngeplatform natten over ved 4 °C.
7. ChIP vasker
BEMÆRK: Hold prøverne på is eller ved 4 °C for at opretholde protein-DNA-krydsning under ChIP-vask.
- Lav høj saltvaskbuffer, LiCl-vaskebuffer og 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7.4) som beskrevet i tabel 3. Opbevares i 50 mL rør ved 4 °C. Der tilsættes 50 μL 1000x CPI-lager til alle buffere lige før brug.
- Spin prøver kort i 2 mL protein lav binde rør til at indsamle væske fra hætter, derefter placere på en magnetisk rack i 1 min og fjerne supernatant omhyggeligt med en pipette.
- For ChIP-vask tilsættes 1 mL lysis buffer 3 (ved 4 °C) til hvert rør. Bland på en gyngeplatform ved 4 °C i 5 min. Spin prøver kort, læg derefter på et magnetisk stativ i 1 minut og fjern supernatanten med en pipette.
- Tilsæt 1 mL kold høj saltvaskbuffer til hvert rør. Bland på en gyngeplatform ved 4 °C i 5 min. Spin prøver kort, læg derefter på et magnetisk stativ i 1 minut og fjern supernatanten med en pipette.
- Tilsæt 1 mL kold LiCl vaskebuffer til hvert rør. Bland på en gyngeplatform ved 4 °C i 5 min. Spin prøver kort, læg derefter på et magnetisk stativ i 1 minut og fjern supernatanten med en pipette.
- Der tilsættes 1 mL kold 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) til hvert rør. Bland på en gyngeplatform ved 4 °C i 5 min. Spin prøver kort, læg derefter på et magnetisk stativ i 1 minut og fjern supernatanten med en pipette.
BEMÆRK: Tris-EDTA buffer (pH 8.0) kan bruges i stedet for Tris-HCl buffer (pH 7.4). - Gentag trin 7.4−7.6 tre gange.
- Prøveperlerne overføres med 500 μL Tris-HCl-buffer (pH 7.4) til friske 1,5 mL rør. Spin prøver kort, læg derefter på et magnetisk stativ i 1 minut og fjern supernatanten med en pipette.
8. Slutreparation og dA-tailing reaktion på perler
BEMÆRK: Sonication genererer ofte ikke-stumpe ended dsDNA. Der kræves en slutreparationsreaktion for at lave et stumpt DNA forud for dA-tailing-reaktionen efterfulgt af ligationstrinnet for indeksadapteren. For klæbrig ende DNA ligation med indeks adapter DNA, dATP er føjet til 3 'slutningen af en stump, dsDNA fragment af dA-tailing reaktion. Slutforberedelsesreaktionsmixet indeholder dATP.
- Efter ChIP-vask tilsættes 38 μL autoklaveret ddH2O til prøveperlerne i 1,5 mL rør til slutreparation og dA-tailing-reaktion.
- Der tilsættes 5,6 μL endeforberedelsesreaktionsblanding og 2,4 μL endeforberedelsesenzymblanding (Materialetabel) til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 46 μL). Inkuber prøver ved 20 °C i 30 min.
- Vaskeperler som beskrevet i tidligere ChIP-vasketrin 7.4−7.6.
9. Indeksadapter ligation på perler
BEMÆRK: Indeksadapteren har 6−10 baser af stregkodede indekssekvenser, som er specifikke for en given prøve, der bruges til multipleksering af flere prøver i rækkefølge med høj overførselshastighed. DNA-sekvenser af indeksadaptere er beskrevet i tabel 1.
- For indeksadapter ligation tilsættes 27 μL kold 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) til prøveperlerne. Der tilsættes 2 μL 15 μM-indeksadapter, 0,5 μL ligationsforstærker og 15 μL ligasemasterblanding (Tabel over materialer) til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 44,5 μL).
- Inkuber prøver ved 20 °C i 15 min. Vaskeperler som beskrevet i trin 7.4−7.6.
10. Udfyldningsreaktion på perler
BEMÆRK: Efter adapterligation er der ingen fosforbinding mellem adapterens 5' ende og 3' enden af ChIP DNA'et. Nick kan repareres ved en fill-in reaktion.
- Der tilsættes 47 μL kold 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7.4) til prøveperlerne.
- Gør udfyldningsreaktionsblandingen (tabel 4 og materialetabel )på is.
- Der tilsættes 11,1 μL udfyldningsblanding til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 58,1 μL). Inkuber prøver ved 30 °C i 20 min. Vaskeperler som beskrevet i trin 7.4−7.6.
11. Lambda exonuclease fordøjelse på perler
- Efter udfyldningsreaktion på perler tilsættes 50 μL kold autoklaveret ddH2O til prøveperlerne.
- For at fordøje ChIP DNA i retning af 5' til 3' tilsættes 6 μL 10x lambda exonuclease buffer og 2 μL af 5 U/μL lambda exonuclease (Tabel over materialer, samlet reaktionsvolumen: 58 μL). Inkuber prøver ved 37 °C i 30 min. Vaskeperler som beskrevet i trin 7.4−7.6.
12. Eluering og omvendt krydsning
- Opret ChIP-elueringsbuffer som beskrevet i tabel 5.
BEMÆRK: Føj ikke CPI til ChIP elution-bufferen. - For at udtage ChIP-prøver fra perlerne udtages prøverne i 75 μL chip elution buffer og inkuberes ved 65 °C i 15 min ved 130 x g.
- Der tilsættes 2,5 μL på 20 mg/mL proteinase K (Materialetabel) til prøverne. Kort hvirvelstrøm, og inkuber derefter prøverne natten over ved 65 °C.
13. DNA-ekstraktion
- Efter at prøverne er inkuberet natten over ved 65 °C, skal der kortvarigt placeres spinprøver på et magnetisk stativ i 1 min., hvorefter supernatanten overføres fra hver prøve til nye 1,5 mL rør.
- Der tilsættes 1 μL på 10 mg/mL RNase A til prøverne. Kort hvirvelstrøm, og inkuber derefter prøverne ved 37 °C i 30 min. Der tilsættes ~25 μL autoklaveret ddH2O til volumen op til 100 μL.
- Rense DNA ved hjælp af magnetiske perler(Tabel over materialer). Elute DNA med 16 μL autoklaveret ddH2O eller nukleasefri ddH2O.
14. Denaturering, primer annealing og primer udvidelse
- Efter chip-udtrækning og omvendt krydsning overføres 16 μL af de udvundne DNA-prøver fra trin 13.3 til PCR-rør.
- Lav denaturering og primer annealing mix(tabel 6 og tabel over materialer)på is. Der tilsættes 1,2 μL denaturering og primerglødningsblanding til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 17,2 μL). Kør prøver ved hjælp af det program, der er beskrevet i tabel 6, for at denaturere og anneal primere til skabelon-DNA'et.
- Lav primer udvidelse mix (Tabel 7 og Table of Materials) på is.
- Når programmet til denaturering og anneal primere er færdigt, tilsættes 3 μL primerforlængelsesblanding til prøverne (samlet reaktionsvolumen: 20,2 μL). Kør eksempler ved hjælp af programmet til primerudvidelse, der er beskrevet i tabel 7.
- Fortsæt straks til dA-tailing reaktion.
15. dA-tailing reaktion
BEMÆRK: For klæbrig ende DNA ligation med universel adapter DNA, dATP tilsættes til 3 'ende af stump, dsDNA af dA-tailing reaktion.
- Lav dA-tailing mix(tabel 8 og tabel over materialer)på is.
- Der tilsættes 4,1 μL dA-tailing-blanding til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 24,3 μL). Kør prøver ved hjælp af programmet til dA-tailing (Tabel 8).
- Fortsæt straks til universel adapter ligation.
16. Ligation af universaladapter
BEMÆRK: Den universelle adapter indeholder sekvensspecifikke sekvenser med høj gennemløb til DNA-prøvegenkendelse til sekventeringskemi. De universelle adapter-DNA-sekvenser er beskrevet i tabel 1.
- Efter dA-tailing reaktion, gøre universelle adapter ligation mix (Tabel 9 og Tabel over materialer) for universel adapter ligation.
- Der tilsættes 21,5 μL til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 45,8 μL) og inkuber prøver i 15 minutter ved 20 °C.
17. DNA-oprydning
- Rense DNA ved hjælp af magnetiske perler(Tabel over materialer). Elute DNA med 21 μL autoklaveret ddH2O eller nukleasefri ddH2O.
- Prøverne opbevares ved -20 °C, indtil de er klar til at udføre ligation-medieret PCR (LM-PCR) og PCR-rensning.
18. Ligation-medieret PCR
BEMÆRK: LM-PCR-primersekvenser er beskrevet i tabel 1.
- Efter DNA oprydning, gøre LM-PCR mix (Tabel 10 og Tabel over materialer) på is.
- Der tilsættes 29 μL LM-PCR-blanding til hver prøve (samlet reaktionsvolumen: 50 μL), og prøverne køres ved hjælp af programmet for LM-PCR (tabel 10).
- Fortsæt straks til gelrensning af PCR forstærket DNA, efterfulgt af DNA-rensning til sekvensering med høj gennemløb.
19. DNA purificering af LM-PCR forstærket DNA
- Kør LM-PCR forstærkede DNA-prøver, sammen med en DNA stige, i en 1,5% agarose gel på 120−180 V og punktafgifter 200-400 bp bands.
- Rense DNA fra den punkterede gel ved hjælp af en gel ekstraktion kit (Tabel over materialer).
- Efter DNA-rensning skal du kontrollere koncentrationen (Materialetabel) af hver ChIP-exo-biblioteksprøve. Indsend eksempler til sekvensering med høj overførselshastighed til sekvensering med enkeltlæsning.
BEMÆRK: Den foretrukne læselængde for enkeltlæst sekventering er mindst 35 bp, hvilket er tilstrækkeligt til entydigt at justere sekventeringsaflæsningerne til referencegenomet i mus eller menneskelige celler. For de fleste transskriberingsfaktorer i museceller eller menneskelige celler er 10-20 millioner læsninger pr. ChIP-exo-prøve tilstrækkelige til at identificere deres genomiske bindingssteder. Mindst 30 millioner læsninger pr. prøve er nødvendige for at kortlægge genomiske regioner beriget med histonemærker i pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A illustrerer sonikeringsresultater efter celle lysis og sonikering, med forskellige cyklusser, af motoriske neuronceller differentieret fra mus ES celler. Det optimale antal sonikeringscyklusser (f.eks. 12 cyklusser i figur 2A) genererede stærk DNA-intensitet i 100−400 BP DNA-fragmenter. ChIP-exo-biblioteker af høj kvalitet er baseret på størrelsen og mængden af fragmenteret chromatin-DNA. Således anbefales optimering af sonikering for hver celletype og batch af celler, før du starter ChIP-exo.
Figur 2B viser ligationsmedierede PCR-produkter (LM-PCR) af ChIP-exo DNA-prøverne forstærket af 18−21 PCR-cyklusser. LM-PCR forstærker ChIP-exo DNA-fragmenter, der er ligated med DNA-adaptere til næste generations sekventering. PCR primer er en del af DNA-adaptersekvenserne. Størrelsen af sonikerede DNA-fragmenter er omkring 100−400 bp (Figur 2A). Efter lambda exonuclease fordøjelsen, ville størrelsen af DNA-fragmenter blive den halve størrelse af udgangsmaterialet (50−200 bp). Ca. 125 bp DNA-adaptere blev ligeret til ChIP-exo DNA-fragmenterne, således er den forventede størrelse af LM-PCR-produkter 175−325 bp. Det minimale antal PCR-cyclesc, mens det stadig er tilstrækkeligt til at forstærke ChIP-exo-biblioteket, udføres for at undgå overforstærkning af ChIP-exo DNA.
Her blev ChIP-exo for Isl1 udført i mus ES celle-afledt motor neuroner. Isl1 er en motor neuron programmering transskription faktor, som er specifikt udtrykt i postmitotiske motoriske neuroner. Resultaterne for Isl1 ChIP-exo viser betydelige mængder på 200−400 bp LM-PCR forstærket ChIP-exo DNA (Figur 2B). Bandet omkring 100 bp angiver PCR artefakter fra adaptere og PCR primere. Det er også vigtigt at køre en antistofkontrol sammen med en forsøgsprøve for at sikre, at ikke-specifik, baggrunds-DNA blev fordøjet af lambda exonuclease-behandlingen. Som et eksempel identificerede vi Isl1-bundne placeringer i mus ES celle-afledte motoriske neuroner ved hjælp af ChIP-exo og ChIP-seq (Figur 3). ChIP-exo-signalet var meget fokuseret på Isl1-bindingssteder og opdagede flere klyngede Isl1-transskriberingsfaktorbindingsmønstre. ChIP-seq-signalet viste bredere signaler, hvilket indikerer, at ChIP-exo af Isl1 har en højere kortlægningsopløsning end ChIP-seq af Isl1.
Figur 1: Skematisk over ChIP-exo-protokollen. Efter ChIP (trin 1−7) gør slutreparations- og dA-tailing-reaktionerne ChIP DNA stumpt afsluttet ved at tilføje en fosfatgruppe til DNA'ets 5' ende og tilføje dATP til 3' enden af DNA'et (trin 8). Soniske ender af ChIP DNA, på perlerne er ligated med indeksadapteren (trin 9). Efter udfyldningsreaktionen bliver adapter-DNA'et med 5's udhæng stumpt (trin 10). Lambda exonuclease fordøjer det sonikerede DNA 5' til 3' op til proteinet (TF)-DNA crosslinking point (trin 11). Efter eluering, reverse-crosslinking og DNA ekstraktion (trin 12 og 13), denatureret enkeltstrenget DNA er lavet dobbelt-strandet af indeks PCR primer udvidelse (trin 14), efterfulgt af dA-tailing (trin 15). Den universelle adapter er derefter ligated til exonuklease-behandlede ende (trin 16). Det resulterende bibliotek ryddes op, PCR-forstærkes og udsættes for næste generations sekventering (trin 17−19). Kortlægning af 5's ender af de resulterende sekventering tags til referencegenomet afgrænser exonuklease barrieren og dermed det præcise sted for protein-DNA crosslinking.
Figur 2: Sonikering og LM-PCR-forstærkning af et ChIP-exo-bibliotek. (A) 1,5 % agarosegel af det elektroforererede sonikerede DNA. 12, 18 og 24 sonikeringscyklusser blev udført for at finde optimale sonikeringscyklusser for 2 x 107 celler af mus ES celle-afledte motoriske neuroner. Efter sonikering blev DNA-prøven omvendt krydslinket og ekstraheret ved hjælp af PCIA og ethanoludfældning. Hver prøve indeholdt 4 x 105 celleækvivalenter, hvilket er 2% af de sonikerede celler. 12 cyklusser af sonikering produceret et større udbytte af sonikeret DNA med den ønskede størrelse (100−500 bp). (B) 1,5% agarosegel af elektroforer ChIP-exo biblioteker efter 18−21 cyklusser af LM-PCR uden antistofkontrol (No Ab) og Isl1 i mus ES celle-afledt motor neuroner. Hver prøve indeholdt 10 x 106 celle svarende til mus motor neuroner. Intet antistof ChIP-exo resultat (bane 2) viser, at ikke-specifikke, forurenende DNA elimineres ved lambda exonuclease. ChIP-exo-bibliotekerne til Isl1 (bane 3) viser forstærkede DNA-biblioteker omkring 200−400 bp, hvilket indikerer, at ChIP-exo-bibliotekerne med succes blev forstærket af adapter ligation-medieret PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af ChIP-exo med ChIP-seq for Isl1 på bestemte loci. De blå og røde fyldte parceller viser fordelingen af sekventering tags for ChIP-seq og ChIP-exo Isl1-bundet steder, henholdsvis proksimale til Slit3 og Fgfr1 gen i spirende spinal motor neuroner differentieret fra mus ES celler.
Tabel 1 — Oversigt Oligonukleotider, der anvendes i denne protokol.
| Oligo navn | Længde (nt) | Sekvens | Bemærk | |||||
| Indekskort fremad* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGAAGACGGCATACGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' fosfat, indeks (XXXXXXXX), 3' T-udhæng | |||||
| Indeksadapter-omvendt* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Ligation adapter-forward* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGATCTACACTCTTACACACGACCTTCCGATCT 3' | ||||||
| Ligation adapter-omvendt* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Indeks PCR primer* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Universal PCR primer* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| * Ovenstående sekventering adaptere og PCR primere er designet til Illumina HiSeq og NextSeq Sekventering Platforme. | ||||||||
Tabel 2: Opskrifter på lysis buffere 1−3 og blokeringsbuffer. Opbevares i 50 mL rør ved 4 °C. Der tilsættes 50 μL CPI (komplet proteasehæmmer) på 1000x CPI (komplet proteasehæmmer) til alle buffere lige før brug.
| Lysis buffer 1 | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 1 M HEPES (pH 7,3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% Glycerol | 10 | 10% |
| 10% Octylphenol ethoxylat | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
| Lysis buffer 2 | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
| Lysis buffer 3 | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8,0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% deoxycholic syre | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Lauroylsarcosine natriumsaltopløsning | 0.83 | 0.50% |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
| Blokerende løsning | ||
| Reagens | Beløb | [Endelig] |
| Bovin serum albumin (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Komplet Protease-hæmmer (CPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Fosfat bufferet saltvand (PBS) | Fyld til 50 mL | |
Tabel 3 — Oversigt Opskrifter til ChIP vasker: Høj Salt Wash buffer, LiCl Wash buffer og 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7,4). Opbevares i 50 mL rør ved 4 °C. Der tilsættes 50 μL 1000x CPI-lager til alle buffere lige før brug.
| Høj saltvask buffer | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 1 M HEPES (pH 7,3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol | 5 | 1% |
| 5% Deoxycholic syre | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
| LiCl-vaskebuffer | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| 10% Octylphenol ethoxylat | 2.5 | 0.50% |
| 5% Deoxycholic syre | 5 | 0.50% |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
| 10 mM Tris-HCl buffer | ||
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7,4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoklaveret ddH2O | Fyld til 50 | |
Tabel 4 — Kommissionen for De Fyld-in reaktion master mix.
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| 20 mg/mL BSA | 0.6 | 0,2 mg/mL |
| 10x phi29 DNA polymerase buffer | 6 | 1x |
| 3 mM dNTP'er | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 DNA polymerase | 2 | 10 U |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 11.1 |
Tabel 5 — Kommissionen for De Opskrift på ChIP Elution buffer. Opbevares i 50 mL rør på RT.
| Reagens | Bind (mL) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoklaveret ddH2O | op til 50 mL |
Tabel 6 — Oversigt Denaturering og Primer Annealing reaktion master mix og program.
| Denaturering og primer udglødning mix | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| 20 mg/mL BSA | 0.2 | 0,2 mg/mL |
| 3 mM dNTP'er | 0.5 | 75 μM |
| 10 μM Indeks PCR primer | 0.5 | 0,25 μM |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 1.2 | |
| Denaturering og primer udglødning program | ||
| Temperatur (°C) | Tidspunkt | |
| 95 | 5 min. | |
| 65 | 3 min. | |
| 60 | 3 min. | |
| 57 | 3 min. | |
| 54 | 3 min. | |
| 51 | 3 min. | |
| 30 | Evigt | |
Tabel 7 — Kommissionen for De Primer Extension reaktion master mix og program.
| Primer udvidelse mix | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| 10x phi29 DNA polymerase buffer | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 DNA polymerase | 1 | 75 μM |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 3 | |
| Primer-udvidelsesprogram | ||
| Temperatur (°C) | Tidspunkt | |
| 30 | 20 min. | |
| 65 | 10 min. | |
| 4 | Evigt | |
Tabel 8: dA-Tailing reaktion master mix og program.
| dA-Tailing-blanding | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Klenow fragment buffer | 2.4 | 1x |
| 5 U/μL Klenow-fragment | 1 | 5 U |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 4.1 | |
| dA-Tailing-program | ||
| Temperatur (°C) | Tidspunkt | |
| 37 | 30 min. | |
| 75 | 20 min. | |
| 4 | Evigt | |
Tabel 9 — Rådets forordning (EØF) nr. Universal Adapter Ligation reaktion master mix.
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| Autoklaveret vand | 5 | |
| 15 μM Universal adapter* | 1 | 320 nM |
| Ligation forstærker | 0.5 | 1x |
| Ligase mester mix | 15 | 1x |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 21.5 | |
| *DNA-sekvensen for universaladapteren er beskrevet i tabel 1. | ||
Tabel 10 — Oversigt Ligation-Medieret PCR master mix og program.
| LM-PCR-mix | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Endelig] |
| 10 μM Indeks PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 10 μM Universal PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polymerase PCR master mix | 25 | 1x |
| Lydstyrke for reaktionsblanding | 29 | |
| *PCR-primersekvenser er beskrevet i tabel 1. | ||
| LM-PCR-program | ||
| Temperatur (°C) | Tidspunkt | Cykler |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15−25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 min. | 1 |
| 4 | Holde | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol bruges ChIP efterfulgt af exonuklease fordøjelse til at opnå DNA-biblioteker til identifikation af protein-DNA-interaktioner i pattedyrsceller ved ultrahøj kortlægningsopløsning. Mange variabler bidrager til kvaliteten af ChIP-exo eksperimentet. Kritiske eksperimentelle parametre omfatter kvaliteten af antistoffer, optimering af sonikering og antallet af LM-PCR-cyklusser. Disse kritiske eksperimentelle parametre er også, hvad der kan begrænse ChIP-exo eksperimenter og vil blive diskuteret nedenfor.
I enhver ChIP-protokol er antistofkvalitet en af de vigtigste overvejelser. Brug af chip-antistoffer anbefales til ChIP-exo. Antistofkvaliteten kan kontrolleres, inden chip-exo-protokollen udføres. ChIP-seq eller ChIP-qPCR kan bruges til at validere antistoffer af ChIP-kvalitet ved at bekræfte specifikke DNA-bindingssteder for det pågældende protein. Efterfølgende er optimering af koncentrationen af antistoffer, der tilsættes perlerne, ideel til at sikre, at protein-DNA-komplekser immunoprecipitated22,23.
Sonikeringen af chromatin er endnu et kritisk skridt i ChIP-exo-protokollen. Sonikering er afgørende for den ikke-specifikke klipning af chromatin, der er nødvendig for optimal immunoprecipitation til det pågældende protein24. Størrelsen og mængden af sonikeret DNA afhænger af antallet af sonikeringscyklusser. En høj koncentration af fragmenteret DNA er vigtig for at sikre, at nok DNA er immunoprecipitated til protein af interesse for en ChIP-exo DNA-bibliotek, der skal oprettes. At opnå 100−500 bp fragmenteret DNA er ideelt, fordi opløsningen af ChIP-exo er bedre, hvis de sonikerede chromatinfragmenter har mindre startstørrelser. Derfor bør den optimale chromatin-sonikering bestemmes for hver type og batch af celler ved at variere antallet af sonikeringscyklusser og sonikeringsbuffere.
Den sidste kritiske parameter er at opnå forstærkning af ChIP-exo bibliotek DNA med det minimale antal LM-PCR-cyklusser for at undgå overforstærkning af PCR-artefakter. For at bestemme det minimale antal PCR-cyklusser for at forstærke ChIP-exo DNA kan en lille del af ChIP-exo DNA bruges til at køre flere PCR-cyklusser (for eksempel 10, 15 og 20 cyklusser) og sammenligne PCR-produkterne.
ChIP-exo har mange flere trin end en traditionel ChIP-seq, og som følge heraf skal hvert trin udføres omhyggeligt og præcist, for at ChIP-exo-protokollen fungerer. Det er vigtigt, at der tilsættes den korrekte mængde af hvert reagens i enzymatiske reaktioner til hver reaktionsmasterblanding21. Det anbefales således at oprette et regneark til beregning af mængden af hvert reagens, der kræves til hver masterblanding, derefter udskrive tabellerne og kontrollere hvert reagens efter tilføjelse til masterblandingerne. Omhyggelig udskæring af det forstærkede DNA er også vigtigt; fragmenter under 200 bp indeholder ofte adapter dimers, som skal fjernes før næste generations sekventering.
Især er de fleste af chip-exos kritiske parametre og begrænsninger identiske med ChIP-seqs. Men i modsætning til ChIP-seq leverer ChIP-exo genomkortlægning i høj opløsning med lav baggrund. ChIP-exo er således den ideelle metode til at identificere præcise protein-DNA-interaktioner i en række systemer og organismer, hvilket hjælper med at afsløre de betydelige roller, som DNA-bindende proteiner i cellen spiller. ChIP-exo-metoden, der er beskrevet ovenfor, kan bruges til at undersøge transskriptionsfaktorer, histonemodifikationsmærker og chromatinregulerende proteiner i levende celler ved højere kortlægningsopløsning end ChIP-seq25,26,27. Derudover kan ChIP-exo registrere de individuelle bindingssteder for DNA-bindende proteiner i en klynge, mens ChIP-seq ikke kan på grund af sin kortlægningsopløsning. Det er vigtigt, at ChIP-exo viser et højere signal-til-støj-forhold sammenlignet med ChIP-seq. Disse fordele ved ChIP-exo giver os mulighed for at identificere et omfattende sæt af bundne steder på tværs af genomet. Denne protokol vil danne grundlag for forskere, der er interesseret i at undersøge DNA-bindende placeringer af forskellige proteiner på tværs af genomet ved næsten base-pair opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmet af Rhee-laboratoriet for at dele ikke-offentliggjorte data og værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tilskud RGPIN-2018-06404 (HR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Simplified ChIP-exo assays. Nature Communications. 9 (1), 2842 (2018).
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
