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Genetics

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPिशन-एक्सोक्यूलेसेज (सीआईपी-एक्सो) का उपयोग करके माउस स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का उच्च-संकल्प मानचित्रण

Published: August 14, 2020 doi: 10.3791/61124
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

Summary

जीन नियमन को समझने के लिए जीनोम में प्रोटीन-बाध्यकारी स्थानों का सटीक निर्धारण महत्वपूर्ण है । यहां हम एक जीनोमिक मैपिंग विधि का वर्णन करते हैं जो एक्सोन्यूक्लियेज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ क्रोमेटिन-इम्यूनोप्रिपिशिटेटेड डीएनए का इलाज करता है और इसके बाद उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण होता है। यह विधि स्तनधारी न्यूरॉन्स में बेस-पेयर मैपिंग रिज़ॉल्यूशन और उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाती है।

Abstract

जीन नियमन को समझने के लिए जीनोम पर विशिष्ट प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान महत्वपूर्ण है । क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिcipitेशन के साथ मिलकर उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का व्यापक रूप से डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के जीनोम-व्यापी बाध्यकारी स्थानों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, ChIP-seq विधि सोनिकेटेड डीएनए टुकड़े और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि डीएनए की लंबाई में अपनी विषमता से सीमित है, जिसके परिणामस्वरूप कम मानचित्रण संकल्प और डीएनए बाध्यकारी साइटों में अनिश्चितता । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक्सोक्यूक्लिज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ चिप का संयोजन प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग साइट पर विषम आकार के इम्यूनोप्रिपिटेटेड डीएनए को ट्रिम करने के लिए 5 'से 3' एक्सोन्यूक्लिज पाचन का उपयोग करता है। एक्सोक्यूलेस उपचार गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि डीएनए को भी समाप्त करता है। पुस्तकालय द्वारा तैयार और एक्सोक्यूलेज-पचाए गए डीएनए को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए भेजा जा सकता है। ChIP-exo विधि अधिक से अधिक पता लगाने संवेदनशीलता और कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ आधार जोड़ी मानचित्रण संकल्प के पास के लिए अनुमति देता है । स्तनधारी कोशिकाओं और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक अनुकूलित ChIP-exo प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है।

Introduction

प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन के स्थान जीन विनियमन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिcipitेशन के साथ-साथ उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का उपयोग एक दशक के लिए जीवित कोशिकाओं में जीनोम-वाइड प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जांच करने के लिए किया गया है1,2। हालांकि, ChIP-seq विधि डीएनए विखंडन और अनबाउंड डीएनए संदूषण में विषमता से सीमित है जो कम मानचित्रण संकल्प, झूठी सकारात्मक, मिस्ड कॉल और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत का कारण बनती है। एक्सोक्यूक्लिज पाचन (सीआईपी-एक्सो) के साथ सीआईपी का संयोजन प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग पॉइंट्स पर सीआईपी डीएनए को ट्रिम करके, बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन और कम पृष्ठभूमि सिग्नल3,4,5के पास प्रदान करके चित-सेक्यू विधि में सुधार करता है। बहुत बेहतर मानचित्रण संकल्प और कम पृष्ठभूमि ChIP द्वारा प्रदान की-exo सटीक और व्यापक प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी स्थानों जीनोम भर में निर्धारित करने के लिए अनुमति देते हैं । सीआईपी-एक्सो कार्यात्मक रूप से अलग डीएनए-बाध्यकारी रूपांकनों, ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफ) के बीच सहकारी बातचीत, और एक निश्चित जीनोमिक बाध्यकारी स्थान में कई प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग साइटों को प्रकट करने में सक्षम है, अन्य जीनोमिक मानचित्रण विधियों द्वारा पता लगाने योग्य नहीं है3,4,6,7।

ChIP-exo शुरू में नवोदित खमीर में इस्तेमाल किया गया था TFs के अनुक्रम विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी की जांच करने के लिए, प्रतिलेखन पूर्व दीक्षा परिसर के सटीक संगठन का अध्ययन करने केलिए, और जीनोम4,8,9भर में व्यक्तिगत हिस्टोटोन की उप-नाभिक संरचना । 20114में इसकी शुरुआत के बाद से, चिप-एक्सो का बैक्टीरिया, चूहों और मानव कोशिकाओं सहित कई अन्य जीवों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है7,10,11,12,13,14,15, 16,17। 2016 में, री एट अल14 ने पहली बार स्तनधारी न्यूरॉन्स में ChIP-exo का उपयोग किया ताकि यह समझा जा सके कि प्रोग्रामिंग टीएफ एलएचएक्स 3 के डाउनरेगुलेशन के बाद न्यूरोनल जीन अभिव्यक्ति को कैसे बनाए रखा गया था, जो एक अन्य प्रोग्रामिंग टीएफ Isl1 के साथ एक हेट्रोडिमर कॉम्प्लेक्स बनाता है। इस अध्ययन से पता चला है कि Lhx3 की अनुपस्थिति में, Isl1 को न्यूरोनल प्रभावक जीन की जीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए Onecut1 TF द्वारा बंधे नए न्यूरोनल बढ़ाने के लिए भर्ती किया जाता है । इस अध्ययन में, ChIP-exo ने खुलासा किया कि कैसे कई टीएफ गतिशील रूप से कोशिका प्रकार और सेल चरण-विशिष्ट डीएनए नियामक तत्वों को निकट-न्यूक्लियोटाइड मैपिंग रिज़ॉल्यूशन पर संयोजन तरीके से पहचानते हैं। अन्य अध्ययनों में भी अन्य स्तनधारी कोशिका लाइनों में प्रोटीन और डीएनए के बीच परस्पर क्रिया को समझने के लिए ChIP-exo विधि का इस्तेमाल किया । हान एटअल. 7 ने चिप-एक्सो का उपयोग करके माउस एरिथ्रोइड कोशिकाओं में GATA1 और TAL1 TFs के जीनोम-वाइड संगठन की जांच करने के लिए ChIP-exo का उपयोग किया। इस अध्ययन में पाया गया कि TAL1 सीधे डीएनए के लिए भर्ती के बजाय परोक्ष रूप से प्रोटीन के माध्यम से-erythroid भेदभाव भर में GATA1 के साथ प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के माध्यम से । हाल के अध्ययनों में सीटीसीएफ, आरएनए पॉलीमरेज II के जीनोम-वाइड बाध्यकारी स्थानों को प्रोफाइल करने के लिए चिप-एक्सो का भी उपयोग किया गया, और मानव सेल लाइनों18, 19में एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्शनल तंत्रों का अध्ययन करने के लिए हिस्टोन के निशान।

3,5,20उपलब्ध चिप-एक्सो प्रोटोकॉल के कई संस्करण हैं। हालांकि, इन ChIP-exo प्रोटोकॉल शोध जो अगली पीढ़ी अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी से परिचित नहीं है के लिए पालन करने के लिए मुश्किल हैं । ChIP-exo प्रोटोकॉल का एक उत्कृष्ट संस्करण आसानी से पालन करने वाले निर्देशों और एक वीडियो21के साथ प्रकाशित किया गया था, लेकिन इसमें कई एंजाइमेटिक कदम शामिल थे जिन्हें पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है। यहां हम कम एंजाइमेटिक चरणों और इनक्यूबेशन समय वाले ChIP-exo प्रोटोकॉल के एक नए संस्करण की रिपोर्ट करते हैं, और प्रत्येक एंजाइमेटिक चरण21के लिए स्पष्टीकरण देते हैं। अंत की मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रियाओं को अंत तैयारी एंजाइम का उपयोग करके एक ही चरण में जोड़ा जाता है। इंडेक्स और यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन स्टेप्स के लिए इनक्यूबेशन बार एक लिगेशन बढ़ाने का उपयोग करके 2 घंटे से घटाकर 15 मिनट कर दिया जाता है। पिछले ChIP-exo प्रोटोकॉल में वर्णित इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन चरण के बाद किनेज़ प्रतिक्रिया को हटा दिया जाता है। इसके बजाय, ओलिगो डीएनए संश्लेषण के दौरान एक फॉस्फेट समूह को इंडेक्स एडाप्टर(टेबल 1)के 5 सिरों में से एक में जोड़ा जाता है, जिसका उपयोग लैम्ब्डा एक्सोक्यूल्यूलस पाचन चरण के लिए किया जाएगा। जबकि पिछले ChIP-exo प्रोटोकॉल ने एकल फंसे डीएनए संदूषकों को खत्म करने के लिए RecJf exonuclease पाचन का इस्तेमाल किया, यह पाचन कदम यहां हटा दिया जाता है क्योंकि यह ChIP-exo पुस्तकालय की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । इसके अलावा, ChIP elution के बाद रिवर्स-क्रॉसलिंक डीएनए को शुद्ध करने के लिए, फिनॉल के बजाय एक चुंबकीय मोती शुद्धिकरण विधि का उपयोग किया जाता है: क्लोरोफॉर्म: आइसोअमिल अल्कोहल (पीसीआईए) निष्कर्षण विधि। इससे डीएनए निकालने का इनक्यूबेशन समय कम हो जाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन के दौरान गठित अधिकांश एडाप्टर डिमर्स को हटा देता है, जो लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर की दक्षता को प्रभावित कर सकता है।

यहां प्रस्तुत ChIP-exo प्रोटोकॉल माउस भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं से विभेदित स्तनधारी न्यूरॉन्स में सटीक प्रोटीन-डीएनए बातचीत का पता लगाने के लिए अनुकूलित है । संक्षेप में, काटा गया और क्रॉसलिंक्ड न्यूरोनल कोशिकाओं को lysed किया जाता है, ताकि क्रोमेटिन को सोनीशन के संपर्क में आने दिया जा सके, फिर ध्वनित किया जा सके ताकि उचित आकार के डीएनए टुकड़े प्राप्त किए जासकें (चित्र 1)। एंटीबॉडी-लेपित मोतियों का उपयोग तब मिश्रित, घुलनशील क्रोमेटिन को ब्याज के प्रोटीन में चुनिंदा रूप से इम्यूनोप्रिपिशेट करने के लिए किया जाता है। जबकि इम्यूनोप्रिपिटेटेड डीएनए अभी भी मोतियों पर है, अंत-मरम्मत, अनुक्रमण एडाप्टर, फिल-इन रिएक्शन और 5 'से 3' लैम्ब्डा एक्सोक्यूलस पाचन चरण किए जाते हैं। एक्सोक्यूलस पाचन कदम है जो ChIP-exo अपने अल्ट्रा उच्च संकल्प और उच्च संकेत से शोर अनुपात देता है । लैम्ब्डा एक्सोक्यूलेज इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड डीएनए को क्रॉसलिंकिंग साइट से कुछ बेस-जोड़े (बीपी) ट्रिम करता है, जिससे डीएनए को दूषित किया जाता है । एक्सोन्यूलेस-इलाज सीआईपी डीएनए एंटीबॉडी-कोटेड मोतियों से eluted है, प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंक उलट रहे हैं, और प्रोटीन अपमानित कर रहे हैं । डीएनए निकाला और एकल फंसे Chip डीएनए के लिए विकृत है, प्राइमर annealing और विस्तार के बाद डबल फंसे डीएनए (dsDNA) बनाने के लिए । इसके बाद, एक्सोक्यूलेस-ट्रीट किए गए सिरों के लिए एक सार्वभौमिक एडाप्टर का लिगाशन किया जाता है। परिणामस्वरूप डीएनए शुद्ध है, तो पीसीआर परिलक्षित, जेल शुद्ध, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण के अधीन है ।

ChIP-exo प्रोटोकॉल ChIP-seq प्रोटोकॉल से अधिक लंबा है, लेकिन बहुत तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण नहीं है। किसी भी सफलतापूर्वक इम्यूनोप्रिपिटेटेड चैप डीएनए को कई अतिरिक्त एंजाइमेटिक चरणों के साथ, ChIP-exo के अधीन किया जा सकता है। सीआईपी-एक्सो के उल्लेखनीय फायदे, जैसे अल्ट्रा-हाई मैपिंग रिज़ॉल्यूशन, कम बैकग्राउंड सिग्नल, और जीनोमिक बाध्यकारी साइटों के बारे में झूठी सकारात्मक और नकारात्मक में कमी, समय लागत से पल्ला झाड़ ती है।

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Protocol

नोट: बफर और रिएक्शन मास्टर मिक्स बनाने के लिए ऑटोक्लेव्ड आसुत और डिओनाइज्ड वॉटर (डीडीएच2ओ) की सिफारिश की जाती है। धारा 1−4 सेल लाइसिस और सोनीफिकेशन का वर्णन करती है, धारा 5−7 क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटी (सीएचआईपी) का वर्णन करती है, धारा 8−11 मोतियों पर एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का वर्णन करती है, धारा 12 और 13 में ChIP एल्यूशन और डीएनए शुद्धिकरण का वर्णन है, और धारा 14−19 पुस्तकालय की तैयारी का वर्णन करती है।

1. कटाई और क्रॉसलिंकिंग कोशिकाएं

  1. माउस ईएस कोशिकाओं को पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स में अंतर करने के बाद, काटी गई कोशिकाओं में 11% फॉर्मलडिहाइड को 1% (v/v) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए एक कमाल के मंच (एक घुमाव, शेखर, या रोटेटर) पर रॉक कोशिकाएं।
    नोट: लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर क्रॉसलिंक किया जाना है, कम फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग (उदाहरण के लिए, 0.5%) या डिसिनिमिडिल ग्लूटारेट (डीएसजी) के साथ डबल क्रॉसलिंकिंग का उपयोग किया जा सकता है।
  2. क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 150 m M M की अंतिम एकाग्रता में 2.5 एम ग्लाइसिन जोड़ें। आर टी में एक कमाल के मंच पर रॉक कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए ।
  3. 15 एमएल शंकु नलियों में क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं को 1,350 x ग्रामपर 6 मिनट के लिए, आर टी में क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। समाधान को एस्पिरेट करें, फिर 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से ढंकें।
    नोट: क्रॉसलिंक्ड सेल छर्रों को तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीजिंग के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. सेल लाइसिस

नोट: इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित कदम माउस ईएस कोशिकाओं से विभेदित लगभग 2 x10 7 न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए हैं। खुली कोशिकाओं को तोड़ने के लिए, विभिन्न डिटर्जेंट युक्त लाइसिस बफ़र्स का उपयोग किया जाएगा। उपयोग से ठीक पहले बफर के 50 एमएल में 1000x पूर्ण प्रोटीज अवरोधक (सीपीआई) स्टॉक के 50 माइक्रोन जोड़ें।

  1. टेबल 2में वर्णित लाइसिस बफ़र्स 1−3 तैयार करें।
  2. बर्फ पर क्रॉसलिंक्ड सेल छर्रों को पिघलाएं, फिर 15 एमएल शंकु ट्यूबों में लाइसिस बफर 1 के 3 एमएल में सेल छर्रों को अच्छी तरह से रीसुस्पेंड करें। एक कमाल के मंच पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  3. लाइसिस बफर 2 के 3 एमएल में पेलेट कोशिकाओं को अच्छी तरह से रिसेंडल करें। एक कमाल के मंच पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  4. प्रत्येक गोली में लाइसिस बफर 3 का 1 एमएल जोड़ें, फिर बर्फ पर रखें। तुरंत सोनिकेशन के लिए आगे बढ़ें।

3. सोनिकेटिंग क्रोमेटिन

नोट: क्रॉसलिंक उत्क्रमण को कम करने के लिए इस सोनीशन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें।

  1. बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके, 15 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब पर 0.2 एमएल ग्रेजुएशन मार्क तक सोनीएशन मोतियों(सामग्रीकी तालिका) जोड़ें। 1x पीबीएस के 600 माइक्रोन में भंवर से सोनिकेशन मोतियों को धोएं जब तक कि कोई सूखे धब्बे दिखाई न दें। 30 x ग्राम पर 5 एस के लिए ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और 1x पीबीएस को एस्पिरेट करें।
    नोट: पॉलीस्टीरीन ट्यूबों में सोनीशन पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में सोनीशन की तुलना में अधिक कुशल है। यदि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या (उदाहरण के लिए, और लेफ्टिनेंट;106 कोशिकाओं) को सोनिकेटेड किया जाता है, तो सोनीशन मोतियों को जोड़े बिना 1.5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब का उपयोग करें।
  2. लाइसिस बफर 3 (स्टेप 2.4 से) के 1 एमएल में परमाणु लाइसेट्स को अच्छी तरह से फिर से रीसस्ट करें, फिर 15 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें सोनीशन मोतियों वाले हैं। संक्षेप में पॉलीस्टीरिन ट्यूब भंवर।
  3. क्रॉसलिंक्ड क्रोमेटिन डीएनए को खंडित करने के लिए, 30 डब्ल्यू पर पावर आयाम के साथ, चक्रों की अनुकूलित संख्या के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नाभिकीय रूप से स्थापित किया जाता है, और सोनीकेशन चक्र 30 एस ऑन/30 एस बंद हो जाते हैं।
    नोट: प्रत्येक सेल प्रकार और बैच के लिए सोनीशन का अनुकूलन सबसे अच्छा ChIP-exo उपज में परिणाम होगा । 2 x 107 माउस न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए, उल्लिखित सेटिंग्स में 20−30 सोनिकेशन चक्र 100−500 बीपी की सीमा में क्रोमेटिन को खंडित कर देंगे।
  4. सोनीशन पूरा होने के बाद, प्रत्येक नमूने से 1.5 एमएल ट्यूब में सभी सुपरनेटेंट (सोनिकेटेड lysates) को स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने में 10% 2-[4-(2,4-ट्राइमेथाइलपेन्टन-2-yl) फिनोक्सी] इथेनॉल जोड़ें) 1% की अंतिम एकाग्रता पर। पाइपिंग करके मिलाएं।
  5. पैलेट सेल मलबे के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूने। प्रत्येक नमूने से सभी सोनिकेटेड lysates (सुपरनेट) को नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. प्रत्येक नमूने से 30 माइक्रोनल सोनिकेटेड lysate लें (~ 3% सोनिकेटेड lysate) और सोनीशन की जांच करने के लिए नई 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ें। एंटीबॉडी-लेपित मोतियों के साथ इनक्यूबेशन के लिए तैयार होने तक शेष सोनिकेटेड lysates को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. सोनीफिकेशन की जांच

  1. 0.5 एम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.0), 0.5 एम ईडीटीए के 2 एमएल, 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 10 एमएल और ऑटोक्लेव डीएच 2 ओ के 6 एमएल जोड़कर 2x प्रोटीन के बफर की20एमएल बनाएं। इस बफर में सीपीआई न जोड़ें। आरटी में 50 एमएल ट्यूब में स्टोर करें।
  2. प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंक को रिवर्स करने के लिए, प्रोटीन को हटाकर, प्रत्येक नमूने (चरण 3.6 से) से सोनिकेटेड क्रोमेटिन के 30 माइक्रोन लें, ऑटोक्लेवेड डीडीएच2ओ के 166 माइक्रोन जोड़ें, 2x प्रोटीन के 200 माइक्रोन के बफर और 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन के 4 माइक्रोन संक्षेप में नमूनों को भंवर, और फिर 24 x gपर 1−3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
  3. नोट: सोनिकेटेड लिट्स को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर रिवर्स क्रॉसलिंक किया जा सकता है।
  4. PCIA (25:24:1) और इथेनॉल वर्षा विधि का उपयोग कर डीएनए निकालें इस प्रकार है ।
    सावधानी: PCIA विषाक्त है। मानक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ एक धुएं हुड के तहत उपयोग करें।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक नमूने में पीसीआईए के 400 माइक्रोन जोड़ें, अधिकतम गति के लिए भंवर सेट करें और 20 एस के लिए भंवर के नमूने। आरटी में 6 मिनट के लिए 18,400 x g पर सेंट्रलाइज। दो चरणों का अवलोकन किया जाएगा। ध्यान से प्रत्येक नमूने की ऊपरी जलीय परत (स्पष्ट चरण) को नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीग्राम/एमएल RNase A. इनक्यूबेट नमूनों के 1 μL जोड़ें ।
    3. प्रत्येक नमूने में 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन का 1 माइक्रोन जोड़ें, फिर 1 एमएल बर्फ-ठंडे 100% इथेनॉल (एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत) के साथ उपजी करें। संक्षेप में मिलाएं, फिर 30 मिनट से 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों को इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 18,400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने और ध्यान से 100% इथेनॉल डालना।
    4. बर्फ के 500 माइक्रोन के साथ छर्रों धो-ठंड 70% इथेनॉल (एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत) । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 18,400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। ध्यान से 70% इथेनॉल डालना।
    5. शेष इथेनॉल सुखाया जाता है जब तक 50 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलील ट्यूबों में इनक्यूबेट नमूने। ऑटोक्लेव्ड डीडीएच 2 ओ या न्यूक्लियेज-फ्रीडीडीएच2ओ के 15 माइक्रोल में डीएनए छर्रों को फिर से रीसुस्पेंड करें।
    6. निकाले गए डीएनए नमूनों को डीएनए सीढ़ी के साथ, 120−180 वी पर 1.5% एगर उठे जेल में चलाएं और सोनिकेटेड डीएनए के आकार की जांच करें।

5. मोतियों के साथ एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

नोट: इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित कदम माउस ईएस कोशिकाओं से विभेदित लगभग 2 x10 7 न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए हैं। ChIP-exo प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी बिंदु पर चुंबकीय मोतियों को फ्रीज और गल न करें क्योंकि मोती नमूने के प्रदूषण के कारण दरार कर सकते हैं या एंटीबॉडी के प्रदर्शन से समझौता किया जा सकता है।

  1. सेल लाइसिस और सोनीफिकेशन के बाद, चिप के लिए प्रोटीन जी चुंबकीय मोती(सामग्री की तालिका)तैयार करें, समरूप होने तक चुंबकीय मोतियों को मिलाएं, फिर 2 मिली प्रोटीन कम बाइंड ट्यूब में 25 माइक्रोन चुंबकीय मोतियों को जोड़ें।
    नोट: चुंबकीय मोतियों का प्रकार एंटीबॉडी की प्रजातियों पर निर्भर करेगा।
  2. ब्लॉकिंग सॉल्यूशन(टेबल 2)के 1 एमएल के साथ मोतियों को धोएं, अच्छी तरह से मिलाएं, फिर 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। जबकि अभी भी एक चुंबकीय रैक पर, सुपरनिटेंट को हटा दें एक बार यह स्पष्ट है।
  3. चुंबकीय मोतियों के लिए अवरुद्ध समाधान के 1 एमएल जोड़ें। एक कमाल के मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रॉक ट्यूब। संक्षेप में स्पिन, तो एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब जगह है और सुपरनैंट निकालें।
  4. दो बार 5.3 कदम दोहराएं।
  5. चुंबकीय मोतियों के लिए अवरुद्ध समाधान के 500 μL जोड़ें। संक्षेप में Isl1 (0.04 μg/μL, सामग्री की तालिका) केखिलाफ एंटीबॉडी स्पिन, तो समाधान अवरुद्ध में चुंबकीय मोती युक्त इसी 2 एमएल प्रोटीन कम बांध ट्यूबों के लिए एंटीबॉडी के 4 μg जोड़ें ।
  6. एंटीबॉडी के बिना चरण 5.5 दोहराएं (यानी, ChIP के लिए कोई एंटीबॉडी नियंत्रण नहीं)।
    नोट: एंटीबॉडी की मात्रा को जोड़ने के लिए एंटीबॉडी की गुणवत्ता और ChIP के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं की संख्या पर विचार करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है ।
  7. कमाल के मंच पर 6−24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक नमूने।

6. क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (सीआईपी)

  1. ब्लॉकिंग समाधान के 1 मिलील के साथ स्टेप 5.8 से एंटीबॉडी-कोटेड मोतियों को धोएं। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर नमूने रखें। सुपरनेट निकालें।
  2. दो बार 6.1 कदम दोहराएं।
  3. अवरुद्ध समाधान के 50 माइक्रोन में एंटीबॉडी-लेपित मोती को फिर से ढिंढा करें, फिर नए 2 एमएल प्रोटीन कम बाइंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक चैप नमूने के लिए, 2 एमएल प्रोटीन कम बाइंड ट्यूब में एंटीबॉडी-कोटेड मोतियों में सोनिकेटेड lysates (चरण 3.6 से ~ 1.0 एमएल) जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक कमाल के मंच पर प्रत्येक नमूने को इनक्यूबेट करें।

7. चिप वॉश

नोट: बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें ताकि चिप वॉश के दौरान प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग बनाए रखा जा सके।

  1. तालिका 3 में वर्णित उच्च नमक वॉश बफर, एलआईसीएल वॉश बफर और 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 7.4)बनाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब में स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले सभी बफ़र्स में 1000x सीपीआई स्टॉक के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  2. कैप से तरल एकत्र करने के लिए 2 एमएल प्रोटीन कम बाइंड ट्यूबों में संक्षेप में नमूनों को स्पिन करें, फिर 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें और एक पिपेट के साथ सावधानी से सुपरनेट निकालें।
  3. ChIP वॉश के लिए, प्रत्येक ट्यूब में लाइसिस बफर 3 (4 डिग्री सेल्सियस पर) का 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर मिलाएं। संक्षेप में नमूनों स्पिन, तो 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है और एक पिपेट के साथ सुपरनेट हटा दें ।
  4. प्रत्येक ट्यूब में कोल्ड हाई साल्ट वॉश बफर का 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर मिलाएं। संक्षेप में नमूनों स्पिन, तो 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है और एक पिपेट के साथ सुपरनेट हटा दें ।
  5. प्रत्येक ट्यूब में कोल्ड लिसिल वॉश बफर का 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर मिलाएं। संक्षेप में नमूनों स्पिन, तो 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है और एक पिपेट के साथ सुपरनेट हटा दें ।
  6. प्रत्येक ट्यूब में ठंड 10 mM Tris-HCl बफर (पीएच 7.4) के 1 ml जोड़ें। 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर मिलाएं। संक्षेप में नमूनों स्पिन, तो 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है और एक पिपेट के साथ सुपरनेट हटा दें ।
    नोट: Tris-EDTA बफर (पीएच 8.0) के बजाय Tris-HCl बफर (पीएच 7.4) का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. तीन बार 7.4−7.6 कदम दोहराएं।
  8. 500 माइक्रोन के साथ नमूना मोतियों को ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 7.4) को ताजा 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। संक्षेप में नमूनों स्पिन, तो 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है और एक पिपेट के साथ सुपरनेट हटा दें ।

8. मोतियों पर अंत मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया

नोट: सोनीशन अक्सर गैर कुंद समाप्त dsDNA उत्पन्न करता है। एक अंत की मरम्मत प्रतिक्रिया के लिए कुंद-डीए समाप्त डीएनए बनाने के लिए आवश्यक है डीए से पहले-टेलिंग प्रतिक्रिया सूचकांक एडाप्टर ligation कदम के बाद । इंडेक्स एडाप्टर डीएनए के साथ चिपचिपा अंत डीएनए लिगेशन के लिए, डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया द्वारा एक कुंद, डीएसडीएनए टुकड़े के 3 ' अंत में डैटपी जोड़ा जाता है। एंड प्रेप रिएक्शन मिक्स में डैटपी होता है।

  1. ChIP धोता के बाद, अंत मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया के लिए 1.5 एमएल ट्यूबों में नमूना मोतियों में ऑटोक्लेवेड डीडीएच2ओ के 38 माइक्रोन जोड़ें।
  2. प्रत्येक नमूने में 5.6 माइक्रोन एंड प्रेप रिएक्शन मिक्स और 2.4 माइक्रोन ऑफ एंड प्रेप एंजाइम मिक्स(सामग्री की तालिका)जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 46 माइक्रोन)। 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेट।
  3. पिछले ChIP धोने चरण 7.4−7.6 में वर्णित मोतियों को धोएं।

9. मोतियों पर इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन

नोट: इंडेक्स एडाप्टर में बारकोडेड इंडेक्स सीक्वेंस के 6−10 बेस होते हैं, जो हाई-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग में कई नमूनों को मल्टीप्लेक्स करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले दिए गए नमूने के लिए विशिष्ट होते हैं । इंडेक्स एडाप्टर डीएनए सीक्वेंस तालिका 1में वर्णित हैं।

  1. इंडेक्स एडाप्टर लिगेशन के लिए, नमूना मोतियों में 27 माइक्रोन कोल्ड 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर (पीएच 7.4) जोड़ें। प्रत्येक नमूने में 15 माइक्रोन इंडेक्स एडाप्टर के 2 माइक्रोन, लिगेशन एन्हांसर के 0.5 माइक्रोन, और लिगाज़ मास्टर मिक्स(सामग्री की तालिका) के15 माइक्रोन जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 44.5 माइक्रोन)।
  2. 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेट। कदम 7.4−7.6 में वर्णित मोतियों को धोएं।

10. मोतियों पर प्रतिक्रिया भरें

नोट: एडाप्टर लिगेशन के बाद, एडाप्टर के 5 ' अंत और Chip डीएनए के 3 ' अंत के बीच कोई फॉस्फोडिएस्टर बांड नहीं है । निक की मरम्मत एक फिल-इन रिएक्शन से की जा सकती है ।

  1. नमूना मोतियों में ठंड 10 mM Tris-HCl बफर (पीएच 7.4) के 47 माइक्रोन जोड़ें।
  2. बर्फ पर फिल-इन रिएक्शन मिक्स(टेबल 4 और टेबल ऑफ मैटेरियल)बनाएं।
  3. प्रत्येक नमूने में 11.1 μL फिल-इन मिक्स जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 58.1 माइक्रोन)। 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेट। कदम 7.4−7.6 में वर्णित मोतियों को धोएं।

11. मोतियों पर लैम्ब्डा एक्सोकल्यूज पाचन

  1. मोतियों पर भरने की प्रतिक्रिया के बाद, नमूना मोतियों में 50 माइक्रोन कोल्ड ऑटोक्लेव डीएच2ओ जोड़ें।
  2. 5'से 3' दिशा में चिप डीएनए को पचाने के लिए, 10x लैम्ब्डा एक्सोक्यूलेस बफर के 6 माइक्रोन और 5 यू/माइक्रोन लैम्बडा एक्सोक्यूलेस(सामग्री की तालिका,कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 58 माइक्रोन) जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने। कदम 7.4−7.6 में वर्णित मोतियों को धोएं।

12. एल्यूशन और रिवर्स क्रॉसलिंकिंग

  1. तालिका 5में वर्णित के रूप में ChIP elution बफर बनाओ ।
    नोट: सीपीआई को चिप एल्यूशन बफर में न जोड़ें।
  2. मोतियों से चित के नमूनों को एल्यूट करने के लिए, 75 माइक्रोन में नमूने रीसस्लपेंड करें, 75 माइक्रोन में सीआईपी एलयूशन बफर और 130 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. नमूनों में 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के 2.5 माइक्रोन(सामग्री की तालिका)जोड़ें। संक्षेप में भंवर, तो 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूनों को इनक्यूबेट।

13. डीएनए निष्कर्षण

  1. नमूनों के बाद 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया है, संक्षेप में स्पिन नमूने, 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर जगह है, तो नए १.५ एमएल ट्यूबों के लिए प्रत्येक नमूने से supernatant हस्तांतरण ।
  2. नमूनों में 10 मिलीग्राम/एमएल आरएनएईई ए का 1 माइक्रोन जोड़ें । संक्षेप में भंवर, तो 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट। 100 माइक्रोन तक की मात्रा में ऑटोक्लेवेड डीडीएच 2 ओ के ~25माइक्रोन जोड़ें।
  3. चुंबकीय मोतियों(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें। ऑटोक्लेवेड डीडीएच 2 ओ या न्यूक्लियस-फ्रीडीडीएच2ओ के 16 माइक्रोल के साथ एल्यूट डीएनए।

14. डेनाटरिंग, प्राइमर एनीलिंग और प्राइमर एक्सटेंशन

  1. सीएचआईपी एल्यूशन और रिवर्स क्रॉसलिंकिंग के बाद निकाले गए डीएनए नमूनों में से 16 माइक्रोन को स्टेप १३.३ से पीसीआर ट्यूब में ट्रांसफर करें ।
  2. बर्फ पर डेन्चरिंग और प्राइमर एनीलिंग मिक्स(टेबल 6 और टेबल ऑफ मैटेरियल)बनाएं। प्रत्येक नमूने में 1.2 माइक्रोन और प्राइमर एनीलिंग मिश्रण जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 17.2 माइक्रोन)। टेम्पलेट डीएनए के लिए denature और anneal प्राइमर के लिए तालिका 6 में वर्णित कार्यक्रम का उपयोग कर नमूने चलाएं ।
  3. बर्फ पर प्राइमर एक्सटेंशन मिक्स(टेबल 7 और टेबल ऑफ मैटेरियल)बनाएं।
  4. एक बार जब प्रोग्राम डिनेचर और एनियल प्राइमर पूरा हो जाता है, तो नमूनों में प्राइमर एक्सटेंशन मिक्स के 3 माइक्रोन जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 20.2 माइक्रोन)। टेबल 7में वर्णित प्राइमर एक्सटेंशन के लिए कार्यक्रम का उपयोग करके नमूने चलाएं।
  5. तुरंत डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया के लिए आगे बढ़ें।

15. डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया

नोट: यूनिवर्सल एडाप्टर डीएनए के साथ चिपचिपा अंत डीएनए बंधन के लिए, DATP कुंद के 3 ' अंत में जोड़ा जाता है, DsDNA डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया द्वारा ।

  1. बर्फ पर डीए-टेलिंग मिक्स(टेबल 8 और टेबल ऑफ मैटेरियल)बनाएं।
  2. प्रत्येक नमूने में डीए-टेलिंग मिश्रण का 4.1 माइक्रोन जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 24.3 माइक्रोन)। डीए-टेलिंग(टेबल 8)के लिए कार्यक्रम का उपयोग करके नमूने चलाएं।
  3. तुरंत यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन के लिए आगे बढ़ें।

16. यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन

नोट: यूनिवर्सल एडाप्टर अनुक्रमण रसायन विज्ञान के लिए डीएनए नमूना मांयता के लिए उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण विशिष्ट दृश्यों भी शामिल है । यूनिवर्सल एडाप्टर डीएनए सीक्वेंस टेबल 1में वर्णित हैं ।

  1. डीए-टेलिंग रिएक्शन के बाद यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन के लिए यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन मिक्स(टेबल 9 और टेबल ऑफ मैटेरियल्स)बनाएं ।
  2. प्रत्येक नमूने में 21.5 माइक्रोन जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 45.8 माइक्रोन) और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।

17. डीएनए सफाई

  1. चुंबकीय मोतियों(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें। ऑटोक्लेव डीएच 2 ओ या न्यूक्लियस-फ्री डीडीएच 2 ओ के21माइक्रोल के साथ एल्यूट डीएनए।
  2. लिगामेंट-मध्यस्थता पीसीआर (एलएम-पीसीआर) और पीसीआर शुद्धिकरण करने के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।

18. लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर

नोट: एलएम-पीसीआर प्राइमर सीक्वेंस टेबल 1में वर्णित हैं ।

  1. डीएनए सफाई के बाद, बर्फ पर एलएम-पीसीआर मिक्स(टेबल 10 और सामग्री की तालिका)बनाएं।
  2. प्रत्येक नमूने में एलएम-पीसीआर मिश्रण के 29 माइक्रोन जोड़ें (कुल प्रतिक्रिया मात्रा: 50 माइक्रोन) और एलएम-पीसीआर(तालिका 10)के लिए कार्यक्रम का उपयोग करके नमूने चलाएं।
  3. तुरंत पीसीआर परिलक्षित डीएनए के जेल शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें, उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए डीएनए शुद्धि के बाद।

19.एलएम-पीसीआर परिलक्षित डीएनए का डीएनए पी यूआरिफिकेशन

  1. एलएम-पीसीआर परिलक्षित डीएनए नमूनों को चलाएं, डीएनए सीढ़ी के साथ, 120−180 वी और एक्साइज 200-400 बीपी बैंड पर 1.5% एगरेग्यारेड जेल में।
  2. एक जेल निष्कर्षण किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग कर उत्पादित जेल से डीएनए शुद्ध ।
  3. डीएनए शुद्धिकरण के बाद, प्रत्येक चैप-एक्सो लाइब्रेरी नमूने की एकाग्रता(सामग्रीकी तालिका) की जांच करें। एकल-पठन अनुक्रमण के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए नमूने प्रस्तुत करें।
    नोट: एकल पढ़ने अनुक्रमण के लिए पसंदीदा पढ़ें लंबाई कम से कम 35 बीपी है, जो विशिष्ट रूप से संरेखित करने के लिए पर्याप्त है अनुक्रमण माउस या मानव कोशिकाओं में संदर्भ जीनोम को पढ़ता है। माउस या मानव कोशिकाओं में अधिकांश प्रतिलेखन कारकों के लिए, 10−20 मिलियन पढ़ता है प्रति Ch-एक्सो नमूना उनके जीनोमिक बाध्यकारी स्थानों की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में हिस्टोन के निशान में समृद्ध जीनोमिक क्षेत्रों को मैप करने के लिए प्रति नमूना कम से ३०,०००,० पढ़ता है ।

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Representative Results

चित्रा 2 ए माउस ईएस कोशिकाओं से विभेदित मोटर न्यूरॉन कोशिकाओं के विभिन्न चक्रों के साथ सेल लाइसिस और सोनीशन के बाद सोनीशन परिणाम दिखाता है। सोनीशन चक्र की इष्टतम संख्या (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 ए में 12चक्र) ने 100−400 बीपी डीएनए टुकड़ों में मजबूत डीएनए तीव्रता उत्पन्न की। उच्च गुणवत्ता वाले चिप-एक्सो पुस्तकालय खंडित क्रोमेटिन डीएनए के आकार और मात्रा पर आधारित होते हैं। इस प्रकार, Ch-एक्सो शुरू करने से पहले प्रत्येक सेल प्रकार और कोशिकाओं के बैच के लिए सोनीशन के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है।

चित्रा 2B 18−21 पीसीआर चक्रों द्वारा परिलक्षित छग-एक्सो डीएनए नमूनों के लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर (एलएम-पीसीआर) उत्पादों को दिखाता है। एलएम-पीसीआर चैआईपी-एक्सो डीएनए टुकड़ों को बढ़ाती है जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए डीएनए एडाप्टर के साथ लिगा होते हैं। पीसीआर प्राइमर डीएनए एडाप्टर सीक्वेंस का एक हिस्सा है। सोनिकेटेड डीएनए के टुकड़ों का आकार लगभग 100−400 बीपी(चित्रा 2 ए)है। लैम्ब्डा एक्सोक्यूलस पाचन के बाद, डीएनए टुकड़ों का आकार शुरुआती सामग्री (50−200 बीपी) का आधा आकार बन जाएगा। डीएनए एडाप्टर के लगभग 125 बीपी को चपी-एक्सो डीएनए टुकड़ों में लिगा किया गया था, इस प्रकार एलएम-पीसीआर उत्पादों का अपेक्षित आकार 175−325 बीपी है। पीसीआर चक्र की न्यूनतम संख्या, जबकि अभी भी ChIP-exo पुस्तकालय को बढ़ाना करने के लिए पर्याप्त किया जा रहा है, ChIP-exo डीएनए के अधिक प्रवर्धन से बचने के लिए किया जाता है ।

यहां, Isl1 के लिए ChIP-exo माउस ES सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स में प्रदर्शन किया गया था । Isl1 एक मोटर न्यूरॉन प्रोग्रामिंग ट्रांसक्रिप्शन कारक है, जो विशेष रूप से पोस्टमिटोटिक मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है। Isl1 ChIP-exo के परिणाम 200−400 बीपी एलएम-पीसीआर परिलक्षित ChIP-exo डीएनए(चित्रा 2B)की महत्वपूर्ण मात्रा में दिखाते हैं । 100 बीपी के आसपास बैंड एडाप्टर और पीसीआर प्राइमर से पीसीआर कलाकृतियों को इंगित करता है। एक प्रयोगात्मक नमूने के साथ कोई एंटीबॉडी नियंत्रण चलाना भी गैर विशिष्ट सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, पृष्ठभूमि डीएनए लैम्ब्डा एक्सोकलेस उपचार द्वारा पचा गया था । एक उदाहरण के रूप में, हमने सीआईपी-एक्सो और सीआईपी-एसईक्यू(चित्र 3)का उपयोग करके माउस ईएस सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स में Isl1 बाउंड स्थानों की पहचान की। ChIP-exo संकेत अत्यधिक Isl1-बाध्यकारी साइटों पर ध्यान केंद्रित किया गया था, कई संकुल Isl1 प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी पैटर्न का पता लगाने । सीआईपी-एसईक्यू सिग्नल ने व्यापक संकेतों को प्रदर्शित किया, जो यह दर्शाता है कि Isl1 के ChIP-exo में Isl1 के ChIP-seq की तुलना में अधिक मैपिंग रिज़ॉल्यूशन है।

Figure 1
चित्रा 1: ChIP-exo प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध। ChIP (चरण 1−7) के बाद, अंत-मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रियाएं डीएनए के 5 ' अंत में फॉस्फेट समूह जोड़कर और डीएनए के 3 ' अंत (चरण 8) में डैटपी जोड़कर चैप डीएनए को कुंद कर देती हैं। चित डीएनए के सोनिकेटेड सिरों, मोतियों पर इंडेक्स एडाप्टर (चरण 9) के साथ लिगा होते हैं। भरने की प्रतिक्रिया के बाद, 5 ' ओवरहांग के साथ एडाप्टर डीएनए कुंद-समाप्त हो जाता है (चरण 10) । लैम्ब्डा एक्सोन्यूक्लिज प्रोटीन (टीएफ) तक सोनिकेटेड डीएनए 5 'से 3' को पचाता है- डीएनए क्रॉसलिंकिंग पॉइंट्स (चरण 11)। एल्यूशन, रिवर्स-क्रॉसलिंकिंग और डीएनए निष्कर्षण (चरण 12 और 13) के बाद, एक फंसे डीएनए को इंडेक्स पीसीआर प्राइमर एक्सटेंशन (स्टेप 14) द्वारा डबल-फंसे बनाया जाता है, जिसके बाद डीए-टेलिंग (चरण 15) होता है । सार्वभौमिक एडाप्टर तो एक्सोक्यूलेस-इलाज अंत (चरण 16) के लिए लिगा हो जाता है। परिणामस्वरूप पुस्तकालय को साफ किया जाता है, पीसीआर-प्रवर्धित, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (चरण 17−19) के अधीन है। संदर्भ जीनोम के लिए जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रमण टैग के 5 ' सिरों मानचित्रण एक्सोक्यूक्लिज बाधा का सीमांकन करता है और इस प्रकार प्रोटीन-डीएनए क्रॉसलिंकिंग की सटीक साइट ।

Figure 2
चित्रा 2: एक ChIP-exo पुस्तकालय के Sonication और एलएम-पीसीआर प्रवर्धन । (A)इलेक्ट्रोफोरेस्ड सोनिकेटेड डीएनए का 1.5% एगरेग्याड जेल। माउस ईएस सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स की 2 x 107 कोशिकाओं के लिए इष्टतम सोनीशन चक्र खोजने के लिए 12, 18, और 24 चक्रों का संचालन किया गया था। सोनीशन के बाद, डीएनए नमूना रिवर्स क्रॉसलिंक किया गया था, और PCIA और इथेनॉल वर्षा का उपयोग कर निकाला । प्रत्येक नमूने में 4 x 105 सेल समकक्ष होते हैं, जो सोनिकेटेड कोशिकाओं का 2% होता है। सोनीसेंस के 12 चक्रों ने वांछित आकार (100−500 बीपी) के साथ सोनिकेटेड डीएनए की अधिक उपज का उत्पादन किया। (ख)माउस ईएस सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स में कोई एंटीबॉडी नियंत्रण (नो एबी) और Isl1 के लिए एलएम-पीसीआर के 18−21 चक्रों के बाद इलेक्ट्रोफोरेसेड चिप-एक्सो पुस्तकालयों का 1.5% एगरल्ड। प्रत्येक नमूने में माउस मोटर न्यूरॉन्स के 10 x10 6 सेल समकक्ष होते थे। कोई एंटीबॉडी ChIP-exo परिणाम (लेन 2) दर्शाता है कि गैर विशिष्ट, दूषित डीएनए लैम्ब्डा एक्सोन्यूलेस द्वारा समाप्त हो जाता है । Isl1 (लेन 3) के लिए ChIP-exo पुस्तकालयों 200−400 बीपी के आसपास परिलक्षित डीएनए पुस्तकालयों को दिखाते हैं, जो यह दर्शाता है कि ChIP-exo पुस्तकालयों को एडाप्टर लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर द्वारा सफलतापूर्वक परिलक्षित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: विशिष्ट लोकी पर Isl1 के लिए ChIP-exo की तुलना ChIP-seq। नीले और लाल भरे भूखंडों में क्रमशः, माउस ईएस कोशिकाओं से विभेदित नवजात स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स में Slit3 और Fgfr1 जीन के लिए सीआईपी-seq और ChIP-exo Isl1-बाउंड स्थानों के लिए अनुक्रमण टैग का वितरण दिखाया गया है ।

तालिका 1: ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है।

ओलिगो नाम लंबाई (एनटी) अनुक्रम नोट
इंडेक्स एडाप्टर-फॉरवर्ड * 66 5'/Phos/CAAGCAAGACGGCATACGATGATXXXXXXXXGTGACTAGTTCAGACGTGGTCTCTCTCTCTC 3 ' 5 ' फॉस्फेट, इंडेक्स (XXXXXXXX), 3 ' टी-ओवरहांग
इंडेक्स एडाप्टर-रिवर्स * 33 5'GATCGGAGACACACTCTCTAGAACTCCTCAC 3'
लिगेशन एडाप्टर-फॉरवर्ड * 58 5'AATGATACGGCACCACCGATCTACACTCTCTCTCTCTCCCCCCCCACACACGACTCTCTCTCTCTCTC
लिगेशन एडाप्टर-रिवर्स * 34 5'GATCggAGAGCGTCTAGTTAGTAGAGAAGATAGTAGTAGTAG 3'
इंडेक्स पीसीआर प्राइमर * 22 5'CAAGCAAGACGGCATACGAG 3'
यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर * 19 5'AATGATACGGCGACCACCG 3'
* उपरोक्त अनुक्रमण एडाप्टर और पीसीआर प्राइमर इलुमिना हिसेक्यू और नेक्स्टसेक्यू सीक्वेंसिंग प्लेटफॉर्म के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।

तालिका 2: लाइसिस बफ़र्स 1−3 और ब्लॉकिंग बफर के लिए व्यंजन। 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब में स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले सभी बफ़र्स में 1000x सीपीआई (पूर्ण प्रोटीज अवरोधक) स्टॉक के 50 माइक्रोल जोड़ें।

लाइसिस बफर 1
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम HEPES (पीएच 7.3) 2.5 50mm
5 एम एनएसीएल 1.4 140 एमएमएम
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 0.1 1 mm
50% ग्लाइसरोल 10 10%
10% ऑक्टाइलफेनॉल एथॉक्सीलेट 2.5 0.50%
10% 2-[4-(2,4,4-ट्राइमेथाइलपेन्टन-2-yl) फिनोक्सी] इथेनॉल 1.25 0.25%
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें
लाइसिस बफर 2
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) 1 10 mm
5 एम एनएसीएल 2 200 एमएमएम
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 0.1 1 mm
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें
लाइसिस बफर 3
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) 0.5 10 mm
5 एम एनएसीएल 1 100 एमएमएम
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 0.1 1 mm
10% डेऑक्सीचोलिक एसिड 0.5 0.10%
30% एन-लॉरॉयलसरकोसिन सोडियम नमक समाधान 0.83 0.50%
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें
समाधान अवरुद्ध करना
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) कुल धनराशि [अंतिम]
गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 250 मिलीग्राम 0.50%
पूर्ण प्रोटीज़ अवरोधक (सीपीआई, 1000x) 50 माइक्रोन 1x
फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 50 एमएल तक भरें

तालिका 3: ChIP वॉश के लिए व्यंजनों: उच्च नमक धोने बफर, LiCl वॉश बफर और 10 mM Tris-HCl बफर (पीएच 7.4) । 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब में स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले सभी बफ़र्स में 1000x सीपीआई स्टॉक के 50 माइक्रोन जोड़ें।

हाई साल्ट वॉश बफर
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम HEPES (पीएच 7.3) 2.5 50mm
5 एम एनएसीएल 5 500 एमएमएम
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 0.1 1 mm
10% 2-[4-(2,4,4-ट्राइमेथाइलपेन्टन-2-yl) फिनोक्सी] इथेनॉल 5 1%
5% डिऑक्सीचोलिक एसिड 1 0.10%
5% एसडीएस 1 0.10%
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें
लिसल वॉश बफर
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) 2 20 एमएमएम
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 0.1 1 mm
1 एम एलआईसीएल 12.5 250 एमएमएम
10% ऑक्टाइलफेनॉल एथॉक्सीलेट 2.5 0.50%
5% डिऑक्सीचोलिक एसिड 5 0.50%
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें
10 एमएमएम ट्रिस-एचसीएल बफर
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4) 0.5 10 mm
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 तक भरें

तालिका 4: भरें-इन रिएक्शन मास्टर मिक्स।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.6 0.2 मिलीग्राम/एमएल
10x phi29 डीएनए पॉलीमरेज बफर 6 1x
3 एमएमएम डीएनटीपीएस 2.5 150 माइक्रोन
10 U/μL phi29 डीएनए बहुलक 2 10 यू
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 11.1

तालिका 5: ChIP Elution बफर के लिए नुस्खा। आरटी में 50 एमएल ट्यूब में स्टोर करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (एमएल) [अंतिम]
0.5 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) 5 50mm
0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) 1 10 mm
10% एसडीएस 5 1%
ऑटोक्लेवेड डीएच2ओ 50 एमएल तक

तालिका 6: डेनैचिंग और प्राइमर एनीलिंग रिएक्शन मास्टर मिक्स और प्रोग्राम।

डेनैचिंग और प्राइमर एनीलिंग मिक्स
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
20 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 0.2 0.2 मिलीग्राम/एमएल
3 एमएमएम डीएनटीपीएस 0.5 75 माइक्रोन
10 माइक्रोन इंडेक्स पीसीआर प्राइमर 0.5 0.25 माइक्रोन
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 1.2
डेनैचिंग और प्राइमर एनीलिंग प्रोग्राम
तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय
95 5 मिनट
65 3 मिनट
60 3 मिनट
57 3 मिनट
54 3 मिनट
51 3 मिनट
30 सदैव

तालिका 7: प्राइमर एक्सटेंशन रिएक्शन मास्टर मिक्स और प्रोग्राम।

प्राइमर एक्सटेंशन मिक्स
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
10x phi29 डीएनए पॉलीमरेज बफर 2 1x
10 U/μL phi29 डीएनए बहुलक 1 75 माइक्रोन
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 3
प्राइमर एक्सटेंशन प्रोग्राम
तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय
30 20 मिनट
65 10 मिनट
4 सदैव

तालिका 8: डीए-टेलिंग रिएक्शन मास्टर मिक्स और प्रोग्राम।

डीए-टेलिंग मिक्स
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
3 एमएमएम डैटपी 0.7 120 माइक्रोन
Klenow टुकड़ा बफर 2.4 1x
5 यू/μL Klenow टुकड़ा 1 5 यू
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 4.1
डीए-टेलिंग कार्यक्रम
तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय
37 30 मिनट
75 20 मिनट
4 सदैव

तालिका 9: यूनिवर्सल एडाप्टर लिगेशन रिएक्शन मास्टर मिक्स।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
ऑटोक्लेवित पानी 5
15 माइक्रोन यूनिवर्सल एडाप्टर * 1 320 एनएम
लिगेशन बढ़ाने वाला 0.5 1x
लिगाज़ मास्टर मिक्स 15 1x
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 21.5
* यूनिवर्सल एडाप्टर डीएनए अनुक्रम तालिका 1में वर्णित है ।

तालिका 10: लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर मास्टर मिक्स और कार्यक्रम।

एलएम-पीसीआर मिक्स
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) 1x (μL) [अंतिम]
10 माइक्रोन इंडेक्स पीसीआर प्राइमर * 2 0.2 माइक्रोनएम
10 माइक्रोन यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमर * 2 0.2 माइक्रोनएम
2x Taq डीएनए पॉलीमरेज पीसीआर मास्टर मिक्स 25 1x
रिएक्शन मिक्स वॉल्यूम 29
* पीसीआर प्राइमर सीक्वेंस टेबल 1में वर्णित हैं ।
एलएम-पीसीआर कार्यक्रम
तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय चक्र
98 30 एस 1
98 10 एस 15−25
65 75 एस
65 5 मिनट 1
4 पकड़

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, एक्सोक्यूल्यूलेज पाचन के बाद चIP का उपयोग अल्ट्रा-हाई मैपिंग रिज़ॉल्यूशन पर स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान के लिए डीएनए पुस्तकालयों को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। कई चर ChIP-exo प्रयोग की गुणवत्ता में योगदान करते हैं। महत्वपूर्ण प्रायोगिक मापदंडों में एंटीबॉडी की गुणवत्ता, सोनीशन का अनुकूलन और एलएम-पीसीआर चक्रों की संख्या शामिल है। ये महत्वपूर्ण प्रायोगिक पैरामीटर भी हैं जो ChIP-exo प्रयोगों को सीमित कर सकते हैं और नीचे चर्चा की जाएगी।

किसी भी ChIP प्रोटोकॉल में, एंटीबॉडी गुणवत्ता सबसे महत्वपूर्ण विचारों में से एक है। ChIP-exo के लिए ChIP-ग्रेड एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है। चपी-एक्सो प्रोटोकॉल आयोजित करने से पहले एंटीबॉडी गुणवत्ता की जांच की जा सकती है। चिप-एसईक्यू या सीआईपी-क्यूपीसीआर का उपयोग ब्याज के प्रोटीन के विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी स्थानों की पुष्टि करके ChIP-ग्रेड एंटीबॉडी को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। इसके बाद, मोतियों में जोड़े गए एंटीबॉडी की सांद्रता को अनुकूलित करना यह सुनिश्चित करने के लिए आदर्श है कि प्रोटीन-डीएनए परिसरों को इम्यूनोप्रिपिटेटेड22,23हैं।

क्रोमेटिन का सोनीशन चिप-एक्सो प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम है। सोनीशन क्रोमेटिन के गैर-विशिष्ट कतरन के लिए महत्वपूर्ण है, जो ब्याज24के प्रोटीन के लिए इष्टतम इम्यूनोप्रिपिफिकेशन के लिए आवश्यक है। सोनिकेटेड डीएनए का आकार और मात्रा सोनिकेशन चक्रों की संख्या पर निर्भर करती है। खंडित डीएनए की एक उच्च एकाग्रता यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त डीएनए एक ChIP-exo डीएनए पुस्तकालय के लिए ब्याज के प्रोटीन के लिए इम्यूनोप्रिपिटेटेड है बनाया जाएगा । 100−500 बीपी खंडित डीएनए प्राप्त करना आदर्श है क्योंकि यदि सोनिकेटेड क्रोमेटिन के टुकड़ों में छोटे शुरुआती आकार हैं तो सीआईपी-एक्सो का संकल्प बेहतर है। इसलिए, इष्टतम क्रोमेटिन सोनीशन प्रत्येक प्रकार और कोशिकाओं के बैच के लिए सोनीशन चक्र और सोनीशन बफ़र्स की संख्या को अलग करके निर्धारित किया जाना चाहिए।

अंतिम महत्वपूर्ण पैरामीटर पीसीआर कलाकृतियों के अधिक प्रवर्धन से बचने के लिए एलएम-पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या के साथ ChIP-exo पुस्तकालय डीएनए का प्रवर्धन प्राप्त कर रहा है । ChIP-exo डीएनए बढ़ाना करने के लिए पीसीआर चक्रों की न्यूनतम संख्या निर्धारित करने के लिए, ChIP-exo डीएनए का एक छोटा सा हिस्सा कई पीसीआर चक्र (उदाहरण के लिए, 10, 15, और 20 चक्र) चलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पीसीआर उत्पादों की तुलना करें ।

ChIP-exo में पारंपरिक सीआईपी-एसईक्यू की तुलना में कई और कदम हैं और नतीजतन, प्रत्येक चरण को सावधानीपूर्वक और ठीक से काम करने के लिए ChIP-exo प्रोटोकॉल के लिए किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात यह है कि एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं में हर अभिवाक की सही मात्रा प्रत्येक प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण21में जोड़ी जानी चाहिए । इस प्रकार, प्रत्येक मास्टर मिश्रण के लिए आवश्यक प्रत्येक अभिवात की मात्रा की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट बनाना, फिर टेबल प्रिंट करना और मास्टर मिक्स के अलावा प्रत्येक अभिवाक की जांच करने की सिफारिश की जाती है। प्रवर्धित डीएनए का सावधानीपूर्वक उत्तेजन भी महत्वपूर्ण है; 200 बीपी से नीचे के टुकड़ों में अक्सर एडाप्टर डिमीटर होते हैं, जिन्हें अगली पीढ़ी के अनुक्रमण से पहले हटाने की आवश्यकता होती है।

विशेष रूप से, सीआईपी-एक्सो के अधिकांश महत्वपूर्ण पैरामीटर और सीमाएं सीआईपी-एसईक्यू के समान हैं। हालांकि, ChIP-seq के विपरीत, ChIP-exo कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च संकल्प जीनोम मानचित्रण बचाता है । इस प्रकार, ChIP-exo विभिन्न प्रणालियों और जीवों में सटीक प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए आदर्श तरीका है, जिससे कोशिका में डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन की महत्वपूर्ण भूमिकाओं को प्रकट करने में मदद होती है। ऊपर वर्णित चिप-एक्सो विधि का उपयोग प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधन चिह्नों और जीवित कोशिकाओं में क्रोमेटिन नियामक प्रोटीन की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो चैपी-एसईक्यू25,26, 27की तुलना में उच्च मानचित्रण संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में है। इसके अलावा, ChIP-exo एक क्लस्टर के भीतर डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के व्यक्तिगत बाध्यकारी स्थानों का पता लगा सकते हैं, जबकि ChIP-seq अपने मानचित्रण संकल्प के कारण नहीं कर सकते । महत्वपूर्ण बात यह है कि सीआईपी-एक्सो सीआईपी-एसईक्यू की तुलना में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदर्शित करता है। ChIP-exo के ये फायदे हमें जीनोम में बंधे स्थानों के एक व्यापक सेट की पहचान करने की अनुमति देते हैं । यह प्रोटोकॉल निकट आधार-जोड़ी संकल्प पर जीनोम भर में विभिन्न प्रोटीन के डीएनए-बाध्यकारी स्थानों की जांच करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक नींव प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अप्रकाशित डेटा और मूल्यवान चर्चाओं को साझा करने के लिए री प्रयोगशाला के सदस्य को धन्यवाद देते हैं । इस काम को नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (एनएसईआरसी) ग्रांट आरजीपिन-2018-06404 (एचआर) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose, UltraPure Invitrogen 16500 Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% BioShop ALB003 Blocking Solution
Antibody against Isl1 DSHB 39.3F7 Antibody incuation with beads (Section 5.6)
Bioruptor Pico  Diagenode B01060010 Sonicating Chromatin (Section 3.3)
Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade New England BioLabs B9000S Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138 Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4)
Centrifuge 5804 R Eppendorf 22623508 Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer
dATP Solution New England BioLabs N0440S dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Deoxycholic Acid Sodium Salt fisher scientific BP349 Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer
dNTP Mix, Molecular Biology Grade Thermo Scientific R0192 Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x  Thermo Scientific K1081 Ligation-Mediated PCR (Section 18.1)
EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 BioShop EDT111 Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% Commercial alcohols P006EAAN Checking Sonication (Section 4.3.3)
Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol Sigma F8775 Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1)
Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% BioShop GLY002 Lysis Buffer 1
Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% BioShop GLN001 Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2)
Glycogen, RNA Grade Thermo Scientific R0551 Checking Sonication (Section 4.3.3)
HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3  BioShop HEP003 Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer
Klenow Fragment (3->5 exo-) New England BioLabs M0212S dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Lambda exonuclease New England BioLabs M0262S Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2)
Ligase Enhancer New England BioLabs E7645S NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Ligase Master Mix New England BioLabs E7645S NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade Bioshop LIT704 LiCl Wash Buffer
Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) Antibody incubation with beads (Section 5)
Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) Beckman Coulter A63880 DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1)
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) Invitrogen 12321D Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen  28604 Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2)
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) Sigma 61747 Lysis Buffer 3
Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) BioShop NON999 Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) BioShop PHE512 Checking Sonication (Section 4.3.1)
phi29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269L Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4)
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x  Corning 21040CV Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1)
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
ProFlex PCR System Applied Biosystems ProFlex PCR System Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2
Protein LoBind Tube, 2.0 mL  Eppendorf 22431102 Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)
Proteinase K Solution, RNA Grade Invitrogen 25530049 Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)
Qubit 4.0 Fluorometer Invitrogen Q33226 Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assay kit Invitrogen Q32853 Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Rnase A, Dnase and Protease-free Thermo Scientific EN0531 Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2)
Sodium chloride (NaCl), BioReagent  Sigma S5886 Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade BioShop SDS001 Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes Diagenode C01020031 Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2)
ThermoMixer F1.5  Eppendorf 5384000020 Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 Sigma T2194 10 mM Tris-HCl Buffer
Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 Sigma T2694 Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) New England BioLabs E7546S End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed VWR 10159-752 Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7
2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade BioShop TRX506 Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer

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References

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