Summary
Exakt bestämning av proteinbindande platser i genomet är viktigt för att förstå genreglering. Här beskriver vi en genomisk kartläggningsmetod som behandlar chromatin-immunoprecipitated DNA med exonuklease matsmältning (ChIP-exo) följt av hög genomströmning sekvensering. Denna metod detekterar protein-DNA interaktioner med nära bas-par mappning upplösning och hög signal-till-brus förhållandet i däggdjur nervceller.
Abstract
Identifiering av specifika protein-DNA-interaktioner på genomet är viktigt för att förstå genreglering. Kromatinimmunprecipitation i kombination med sekvensering med hög genomströmning (ChIP-seq) används ofta för att identifiera genomomfattande bindande platser för DNA-bindande proteiner. ChIP-seq-metoden begränsas dock av dess heterogenitet i längd av sonikerade DNA-fragment och icke-specifikt bakgrunds-DNA, vilket resulterar i låg kartupplösning och osäkerhet i DNA-bindande platser. För att övervinna dessa begränsningar använder kombinationen av ChIP med exonukleas matsmältning (ChIP-exo) 5' till 3 ' exonuklease matsmältning för att trimma den heterogent stora immunfällda DNA till protein-DNA crosslinking webbplats. Exonukleasbehandling eliminerar också icke-specifikt bakgrunds-DNA. Det biblioteksberedda och exonukleassmälta DNA:t kan skickas för sekvensering med hög genomströmning. ChIP-exo-metoden möjliggör mappningsupplösning nära baspar med större detektionskänslighet och minskad bakgrundssignal. Nedan beskrivs ett optimerat ChIP-exo-protokoll för däggdjursceller och nästa generations sekvensering.
Introduction
Platserna för protein-DNA-interaktioner ger insikt i mekanismerna för genreglering. Kromatinimmunprecipitation i kombination med hög genomströmningssekvensering (ChIP-seq) har använts i ett decennium för att undersöka genomomfattande protein-DNA-interaktioner i levande celler1,2. ChIP-seq-metoden begränsas dock av heterogenitet i DNA-fragmentering och obunden DNA-kontaminering som leder till låg kartupplösning, falska positiva identifieringar, missade samtal och icke-specifik bakgrundssignal. Kombinationen av ChIP med exonukleas matsmältning (ChIP-exo) förbättras på ChIP-seq-metoden genom att trimma ChIP DNA till protein-DNA-korslänkningspunkterna, vilket ger nära basparupplösning och en låg bakgrundssignal3,4,5. Den kraftigt förbättrade kartupplösningen och den låga bakgrunden från ChIP-exo gör det möjligt att bestämma exakta och omfattande protein-DNA-bindningsplatser över hela genomet. ChIP-exo kan avslöja funktionellt distinkta DNA-bindande motiv, samarbetsinteraktioner mellan transkriptionsfaktorer (TF) och flera protein-DNA-korslänkningsplatser på en viss genomisk bindningsplats, som inte kan detekteras med andra genomiskakartläggningsmetoder 3,4,6,7.
ChIP-exo användes ursprungligen i spirande jäst för att undersöka den sekvensspecifika DNA-bindningen av TFs, för att studera den exakta organisationen av transkriptionskomplexet före initiering och subkärnansomstrukturen hos enskilda histoner övergenomet 4,8,9. Sedan introduktionen 20114har ChIP-exo framgångsrikt använts i många andra organismer inklusive bakterier, möss och mänskliga celler7,10,11,12,13,14,15,16,17. År 2016 använde Rhee et al.14 ChIP-exo i däggdjursneuroner för första gången för att förstå hur neuronalt genuttryck bibehölls efter nedregleringen av programmeringen TF Lhx3, som bildar ett heterodimerkomplex med en annan programmering TF Isl1. Denna studie visade att i avsaknad av Lhx3 rekryteras Isl1 till nya neuronala förstärkare bundna av Onecut1 TF för att upprätthålla genuttryck av neuronala effektorgener. I denna studie visade ChIP-exo hur flera TFs dynamiskt känner igen celltyp och cellstadiet-specifika DNA-reglerande element på ett kombinatoriskt sätt vid nära nukleotid mappning upplösning. Andra studier använde också ChIP-exo-metoden för att förstå samspelet mellan proteiner och DNA i andra däggdjurscelllinjer. Han et al.7 använde ChIP-exo för att undersöka genomomfattande organisation av GATA1 och TAL1 TFs i mus erytroida celler med ChIP-exo. Denna studie fann att TAL1 rekryteras direkt till DNA snarare än indirekt genom proteinproteininteraktioner med GATA1 under hela erytroida differentiering. Nyligen genomförda studier använde också ChIP-exo för att profilera genomomfattande bindande platser för CTCF, RNA Polymerase II och histonmärken för att studera epigenomiska och transkriptionella mekanismer i mänskligacellinjer 18,19.
Det finns flera versioner av ChIP-exo-protokollet tillgängligt3,5,20. Dessa ChIP-exo-protokoll är dock svåra att följa för forskning som inte är bekanta med nästa generations sekvensering av biblioteksförberedelser. En utmärkt version av ChIP-exo-protokollet publicerades med enkla instruktioner och en video21, men innehöll många enzymatiska steg som kräver en betydande tid att slutföra. Här rapporterar vi en ny version av ChIP-exo-protokollet som innehåller reducerade enzymatiska steg och inkubationstider och förklaringar till varje enzymatiskt steg21. Slutreparation och dA-tailing reaktioner kombineras i ett enda steg med hjälp av slutförberedande enzym. Inkubationstiderna för index- och universaladapterligeringssteg minskas från 2 timmar till 15 min med hjälp av en ligationsförstärkare. Kinasreaktionen efter indexadapterns ligatursteg som beskrivs i det tidigare ChIP-exo-protokollet tas bort. Istället tillsätts en fosfatgrupp under oligo-DNA-syntesen till en av indexadapterns 5 ändar (tabell 1), som kommer att användas för lambda exonukleas matsmältningssteget. Medan det tidigare ChIP-exo-protokollet använde RecJf exonukleas matsmältning för att eliminera enkelsträngade DNA-föroreningar, tas detta matsmältningssteg bort här eftersom det inte är avgörande för kvaliteten på ChIP-exo-biblioteket. Dessutom, för att rena omvända korslänkade DNA efter ChIP eluering, används en magnetisk pärlor rening metod i stället för fenol:kloroform:isoamyl alkohol (PCIA) extraktionsmetod. Detta minskar inkubationstiden för DNA-extraktion. Det är viktigt att den tar bort de flesta adapter dimers som bildas under indexadapter ligatur, vilket kan påverka effektiviteten hos ligation-medierad PCR.
ChIP-exo-protokollet som presenteras här är optimerat för detektion av exakta protein-DNA-interaktioner i däggdjursneuroner differentierade från mus embryonala stamceller (ES). Kort, skördade och korslänkade neuronala celler lysas, så att kromatin utsätts för ultraljudsbehandling, sedan ultraljudsbehandling så att lämpligt stora DNA-fragment erhålls (Figur 1). Antikroppsbelagda pärlor används sedan för att selektivt immunoprecipitate fragmenterade, lösliga kromatin till proteinet av intresse. Medan immunoprecipitated DNA är fortfarande på pärlor, end-repair, ligatur av sekvensering adaptrar, fyll-i reaktion och 5' till 3 ' lambda exonuclease matsmältning steg utförs. Exonukleas matsmältningssteget är det som ger ChIP-exo dess ultrahög upplösning och höga signal-till-brus-förhållande. Lambda exonukleas trimmar det immunutfällda DNA:t några baspar (bp) från korslänkningsstället, vilket gör att förorenande DNA försämras. Det exonukleasbehandlade ChIP-DNA:t framkallas från de antikroppsbelagda pärlorna, protein-DNA-korslänkar vänds och proteiner bryts ned. DNA extraheras och denatureras till enkelsträngat ChIP-DNA, följt av primerglödgning och förlängning för att göra dubbelsträngat DNA (dsDNA). Därefter utförs ligatur av en universaladapter till de exonukleasbehandlade ändarna. Det resulterande DNA:t renas, sedan förstärks PCR, gel renas och utsätts för nästa generations sekvensering.
ChIP-exo-protokollet är längre än ChIP-seq-protokollet, men är inte särskilt tekniskt utmanande. Alla framgångsrikt immunoprecipitated ChIP DNA kan utsättas för ChIP-exo, med flera ytterligare enzymatiska steg. De anmärkningsvärda fördelarna med ChIP-exo, såsom ultrahög kartupplösning, en reducerad bakgrundssignal och minskade falska positiva och negativa, när det gäller genomiska bindningsställen, överväger tidskostnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Autoklaverat destillerat och avjoniserat vatten (ddH2O) rekommenderas för att göra buffertar och reaktionsmästareblandningar. Avsnitten 1−4 beskriver celllys och ultraljudsbehandling, avsnitt 5−7 beskriver kromatinimmunprecipitation (ChIP), avsnitt 8−11 beskriver enzymatiska reaktioner på pärlor, avsnitten 12 och 13 beskriver ChIP eluering och DNA-rening, och avsnitten 14−19 beskriver biblioteksberedning.
1. Skörda och korslänka celler
- Efter att ha differentierat mus ES-celler till postmitotiska nervceller, tillsätt 11% formaldehyd till de skördade cellerna till en slutlig koncentration på 1% (v/v). Bergceller på en gungplattform (en vippmaskin, skakapparat eller rotator) i 15 minuter vid rumstemperatur (RT, 25 °C).
OBS: Beroende på vilket målprotein som ska korslänkas, mindre formaldehydkorslänkning (till exempel en slutlig koncentration på 0,5 %) eller dubbel korskoppling med disuccinimidyl glutarat (DSG) kan användas. - Tillsätt 2,5 M glycin till en slutlig koncentration på 150 mM för att stoppa korslänkningsreaktionen. Rockceller på en gungplattform på RT, i 5 min.
- Centrifugera de korslänkade cellerna i 15 ml koniska rör vid RT i 6 minuter vid 1 350 x g. Aspirera lösningen och återanvänd sedan celler i 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: De korslänkade cellpelletsen kan förvaras vid -80 °C efter blixtfrysning med flytande kväve.
2. Celllys
OBS: Följande steg i detta protokoll är för cirka 2 x 107 neuronala celler differentierade från mus ES-celler. För att bryta öppna celler kommer lysbuffertar som innehåller olika tvättmedel att användas. Tillsätt 50 μL 1000x komplett proteashämmare (CPI) lager till 50 ml buffert strax före användning.
- Förbered lysbuffertarna 1−3 enligt beskrivningen i tabell 2.
- Tina tvärlänkade cellpellets på is och återanvänd sedan cellpellets noggrant i 3 ml lysbuffert 1 i 15 ml koniska rör. Sten vid 4 °C i 15 min på en gungplattform. Centrifug vid 1 350 x g i 5 min vid 4 °C och aspirat supernatant.
- Återanvänd noggrant pelleterade celler i 3 ml lysbuffert 2. Sten vid 4 °C i 10 min på en gungplattform. Centrifug vid 1 350 x g i 5 min vid 4 °C och aspirat supernatant.
- Tillsätt 1 ml lysbuffert 3 till varje pellet och håll sedan på is. Fortsätt omedelbart till ultraljudsbehandling.
3. Ultraljudsbehandling kromatin
OBS: Förvara proverna på is eller vid 4 °C under denna ultraljudsbehandling för att minska återföringen av tvärlänken.
- Tillsätt ultraljudsbehandlingar (Table of Materials) med hjälp av en steril spatel upp till 0,2 ml graderingsmärket på 15 ml polystyrenrör. Tvätta ultraljudspärlor genom att virvla i 600 μL 1x PBS tills inga torra fläckar är synliga. Centrifugera rören i 5 s vid 30 x g och aspirera 1x PBS.
OBS: Ultraljudsbehandling i polystyrenrör är effektivare än ultraljudsbehandling i polypropylenrör. Om ett mindre antal celler (till exempel <106 celler) är sonikerade, använd 1,5 ml polystyrenrör utan att tillsätta ultraljudsbehandlingspärlor. - Återanvänd kraftigt kärnlyssnorna i 1 ml lysbuffert 3 (från steg 2.4) och överför sedan till de 15 ml polystyrenrör som innehåller ultraljudsbehandlingspärlor. Virvel kort polystyrenrören.
- För att fragmentera det korslänkade kromatin-DNA: tärningen lyser nukleärt vid 4 °C för ett optimerat antal cykler, med effektamplitude vid 30 W, och ultraljudsbehandlingscykler inställda på 30 s på / 30 s av.
OBS: Optimering av ultraljudsbehandling för varje cell typ och batch kommer att resultera i den bästa ChIP-exo avkastning. För 2 x 107 mus neuronala celler, 20−30 ultraljudsbehandling cykler vid de nämnda inställningarna kommer att fragment chromatin i intervallet 100−500 bp. - När ultraljudsbehandlingen är klar, överför alla övernaturliga (sonifierade lysater), från varje prov, till 1,5 ml rör. Tillsätt 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxi]etanol) till varje prov vid en slutlig koncentration på 1%. Blanda genom pipetting.
- För pelletscellsskräp, centrifugprover vid 13 500 x g i 10 min vid 4 °C. Överför alla soniska lysater (övernatant) från varje prov till nya 1,5 ml-rör.
- Ta 30 μL sonikerat lysat från varje prov (~ 3% av ultraljudssäcken) och lägg till nya 1,5 ml-rör för att kontrollera ultraljudsbehandling. Förvara återstående soniska lysater vid 4 °C tills de är klara för inkubation med antikroppsbelagda pärlor.
4. Kontrollera ultraljudsbehandling
- Gör 20 ml 2x proteinas K-buffert genom att tillsätta 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M EDTA, 10 ml 10% natriumddecylsulfat (SDS) och 6 ml autoklaverat ddH2O. Lägg inte till KPI i den här bufferten. Förvara i 50 ml rör på RT.
- För att vända protein-DNA-tvärlänken, genom att ta bort proteinerna, ta 30 μL sonikerat kromatin från varje prov (från steg 3.6), tillsätt 166 μL autoklaverat ddH2O, 200 μL 2x proteinas K-buffert och 4 μL 20 mg/ml proteinas K. Vixla kort proverna och inkubera sedan vid 65 °C i 1−3 timmar vid 24 x g.
- OBS: De soniska lysaterna kan vändas tvärs över natten vid 65 °C.
- Extrahera DNA med PCIA (25:24:1) och etanolutfällningsmetod enligt följande.
VARNING: PCIA är giftigt. Använd under en rökhuv med personlig standardskyddsutrustning (PPE).- Tillsätt 400 μL PCIA till varje prov i 1,5 ml-rör, ställ in virveln på maximal hastighet och virvelprover för 20 s. Centrifug vid 18 400 x g i 6 min på RT. Två faser kommer att observeras. Överför försiktigt det övre vattenskiktet (klar fas) av varje prov till nya 1,5 ml-rör.
- Tillsätt 1 μL 10 mg/ml RNase A. Inkubera prover vid 37 °C i 30 min.
- Tillsätt 1 μL 20 mg/ml glykogen till varje prov och fäll sedan ut med 1 ml 100% etanol (lagrad i en -20 °C frys). Blanda kort och inkubera sedan proverna i -80 °C frys i 30 min till 1 timme. Centrifugprover vid 18 400 x g i 10 min vid 4 °C och häll försiktigt ut 100% etanol.
- Tvätta pellets med 500 μL iskallt 70% etanol (förvaras i en -20 °C frys). Centrifug vid 18 400 x g i 5 min vid 4 °C. Häll försiktigt ut 70% etanol.
- Inkubera prover i 1,5 ml rör vid 50 °C tills återstående etanol avdunstas. Återanvänd DNA-pellets i 15 μL autoklaverat ddH2O eller nukleasfritt ddH2O.
- Kör de extraherade DNA-proverna, tillsammans med en DNA-stege, i en 1,5% agarose gel vid 120−180 V och kontrollera storleken på det sonikerade DNA.
5. Antikroppsinkubation med pärlor
OBS: Följande steg i detta protokoll är för cirka 2 x 107 neuronala celler differentierade från mus ES-celler. Frys inte och tina magnetiska pärlor vid någon tidpunkt under ChIP-exo-protokollet eftersom pärlorna kan spricka och orsaka kontaminering av provet eller antikroppens prestanda kan äventyras.
- Efter celllys och ultraljudsbehandling, förbered Protein G magnetiska pärlor(Table of Materials)för ChIP, blanda magnetiska pärlor tills de är homogena och tillsätt sedan 25 μL magnetiska pärlor till 2 ml protein lågbindningsrör.
OBS: Vilken typ av magnetiska pärlor som används beror på antikropparna. - Tvätta pärlor med 1 ml blockeringslösning (tabell 2), blanda väl och placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 min. Medan du fortfarande är på ett magnetiskt rack, ta bort supernatant när det är klart.
- Tillsätt 1 ml blockeringslösning till de magnetiska pärlorna. Bergrör i 10 min vid 4 °C på en gungplattform. Snurra kort, placera sedan rören på ett magnetiskt rack och ta bort supernatant.
- Upprepa steg 5.3 två gånger till.
- Tillsätt 500 μL blockeringslösning till magnetiska pärlor. Snurra kort antikroppen mot Isl1 (0,04 μg/μL, Table of Materials), tillsätt sedan 4 μg antikropp till motsvarande 2 ml protein lågbindningsrör som innehåller de magnetiska pärlorna i blockeringslösningen.
- Upprepa steg 5.5 utan antikroppar (dvs. ingen antikroppskontroll för ChIP).
OBS: Mängden antikroppar att tillsätta kan bestämmas empiriskt genom att beakta antikroppens kvalitet och antalet celler som används för ChIP. - Stenprover vid 4 °C i 6−24 timmar på en gungplattform.
6. Kromatinimmunprecipitation (ChIP)
- Tvätta antikroppsbelagda pärlor från steg 5,8 med 1 ml blockeringslösning. Placera proverna på en gungplattform vid 4 °C i 5 minuter.
- Upprepa steg 6.1 två gånger till.
- Återanvänd antikroppsbelagda pärlor i 50 μL blockeringslösning och överför sedan till nya 2 ml protein låga bindrör. För varje ChIP-prov, tillsätt soniska lysater (~ 1,0 ml från steg 3,6) till antikroppsbelagda pärlor i 2 ml protein låga bindrör.
- Inkubera varje prov på en gungplattform över natten vid 4 °C.
7. ChIP tvättar
OBS: Förvara prover på is eller vid 4 °C för att bibehålla protein-DNA-korslänkning under ChIP-tvättar.
- Gör hög salttvättbuffert, LiCl-tvättbuffert och 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7.4) enligt tabell 3. Förvara i 50 ml rör vid 4 °C. Tillsätt 50 μL 1000x KPI-lager till alla buffertar precis före användning.
- Snurra kort prover i 2 ml protein lågbindningsrör för att samla vätska från locken, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 min och ta bort supernatant noggrant med en pipett.
- För ChIP-tvättar, tillsätt 1 ml lysbuffert 3 (vid 4 °C) till varje rör. Blanda på en gungplattform vid 4 °C i 5 min. Snurra kort prover, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 minut och ta bort supernaten med en pipett.
- Tillsätt 1 ml kall hög salttvättbuffert till varje rör. Blanda på en gungplattform vid 4 °C i 5 min. Snurra kort prover, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 minut och ta bort supernaten med en pipett.
- Tillsätt 1 ml kall LiCl-tvättbuffert till varje rör. Blanda på en gungplattform vid 4 °C i 5 min. Snurra kort prover, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 minut och ta bort supernaten med en pipett.
- Tillsätt 1 ml kall 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7.4) till varje rör. Blanda på en gungplattform vid 4 °C i 5 min. Snurra kort prover, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 minut och ta bort supernaten med en pipett.
OBS: Tris-EDTA-buffert (pH 8.0) kan användas istället för Tris-HCl-buffert (pH 7.4). - Upprepa steg 7,4−7,6 tre gånger.
- Överför provpärlorna med 500 μL Tris-HCl-buffert (pH 7.4) till färska 1,5 ml-rör. Snurra kort prover, placera sedan på ett magnetiskt rack i 1 minut och ta bort supernaten med en pipett.
8. Slutreparation och dA-tailing reaktion på pärlor
OBS: Ultraljudsbehandling genererar ofta icke-trubbiga dsDNA. En end-repair reaktion krävs för att göra trubbigt-slutet DNA före dA-tailing reaktion följt av index adapter ligatur steg. För klibbig slut-DNA-ligatur med indexadapter-DNA läggs dATP till 3' änden av ett trubbigt dsDNA-fragment genom dA-tailing-reaktionen. End prep reaktion mix innehåller dATP.
- När ChIP har tvättats, tillsätt 38 μL autoklaverat ddH2O till provpärlorna i 1,5 ml-rör för slutreparation och dA-tailing-reaktion.
- Tillsätt 5,6 μL ändförberedande reaktionsblandning och 2,4 μL ändförberedande enzymblandning(materialförteckning)till varje prov (total reaktionsvolym: 46 μL). Inkubera prover vid 20 °C i 30 minuter.
- Tvätta pärlor enligt beskrivningen i tidigare ChIP tvättsteg 7,4−7,6.
9. Indexadapter ligatur på pärlor
OBS: Indexadaptern har 6−10 baser av streckkodade indexsekvenser, som är specifika för ett givet prov som används för multiplexering av flera exempel vid sekvensering med högt genomströmning. DNA-sekvenser för indexadaptrar beskrivs i tabell 1.
- För indexadapterligering, tillsätt 27 μL kall 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7.4) till provpärlorna. Tillsätt 2 μL 15 μM indexadapter, 0,5 μL ligationsförstärkare och 15 μL ligas master mix(Table of Materials)till varje prov (total reaktionsvolym: 44,5 μL).
- Inkubera prover vid 20 °C i 15 minuter. Tvätta pärlor enligt beskrivningen i steg 7.4−7.6.
10. Fyll-i-reaktion på pärlor
OBS: Efter adapterligantion finns det ingen fosfodiesterbindning mellan adapterns 5' ände och 3' änden av ChIP DNA. Hacket kan repareras av en fyll-i-reaktion.
- Tillsätt 47 μL kall 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7.4) till provpärlorna.
- Gör fyllningsreaktionsblandningen (tabell 4 och materialförteckning )på is.
- Tillsätt 11,1 μL fyllnadsblandning till varje prov (total reaktionsvolym: 58,1 μL). Inkubera prover vid 30 °C i 20 minuter. Tvätta pärlor enligt beskrivningen i steg 7.4−7.6.
11. Lambda exonukleas matsmältning på pärlor
- Efter fyll-i-reaktion på pärlor, tillsätt 50 μL kall autoklaverad ddH2O till provpärlorna.
- För att smälta ChIP-DNA:t i 5' till 3' riktning, tillsätt 6 μL 10x lambda exonukleasbuffert och 2 μL 5 U/μL lambdaexonukleas(Materialförteckning,total reaktionsvolym: 58 μL). Inkubera prover vid 37 °C i 30 min. Tvätta pärlor enligt beskrivningen i steg 7.4−7.6.
12. Eluering och omvänd korslänkning
- Gör ChIP-elueringsbuffert enligt beskrivningen i tabell 5.
OBS: Lägg inte till KPI i ChIP elueringsbuffert. - För att framkalla ChIP-prover från pärlorna, återanvända prover i 75 μL ChIP-elueringsbuffert och inkubera vid 65 °C i 15 min vid 130 x g.
- Tillsätt 2,5 μL 20 mg/ml proteinas K (Materialförteckning )till proverna. Kort virvel, inkubera sedan proverna över natten vid 65 °C.
13. DNA-extraktion
- Efter att proverna har inkuberats över natten vid 65 °C, snurra kort prover, placera på ett magnetiskt rack i 1 min och överför sedan supernatanten från varje prov till nya 1,5 ml-rör.
- Tillsätt 1 μL 10 mg/ml RNase A till proverna. Kort virvel, inkubera sedan proverna vid 37 °C i 30 min. Tillsätt ~25 μL autoklaverat ddH2O till volym upp till 100 μL.
- Rena DNA med hjälp av magnetiska pärlor (Materialförteckning ). Elute DNA med 16 μL autoklaverat ddH2O eller nukleasfritt ddH2O.
14. Denaturering, primerglödgning och primerförlängning
- Efter ChIP-eluering och omvänd korslänkning överför du 16 μL av de extraherade DNA-proverna från steg 13.3 till PCR-rör.
- Gör denaturerings- och primerglödgblandning(tabell 6 och materialförteckning)på is. Tillsätt 1,2 μL denaturerings- och primerglödgningsblandning till varje prov (total reaktionsvolym: 17,2 μL). Kör prover med hjälp av programmet som beskrivs i tabell 6 för att denaturera och glödgprimrar till mallens DNA.
- Gör primerförlängningsblandningen(tabell 7 och materialtabellen)på is.
- När programmet för att denaturera och glödgprimrar är klart, tillsätt 3 μL primerförlängningsblandning till proverna (total reaktionsvolym: 20,2 μL). Kör exempel med hjälp av programmet för primerförlängning som beskrivs i tabell 7.
- Fortsätt omedelbart till dA-tailing reaktion.
15. dA-tailing reaktion
OBS: För klibbig slut-DNA-ligatur med universell adapter-DNA tillsätts dATP till 3' änden av trubbig, dsDNA av dA-tailing-reaktionen.
- Gör dA-tailing mix(tabell 8 och materialbord)på is.
- Tillsätt 4,1 μL dA-tailing mix till varje prov (total reaktionsvolym: 24,3 μL). Kör prover med hjälp av programmet för dA-tailing(tabell 8).
- Fortsätt omedelbart till universaladapter ligatur.
16. Universal adapter ligatur
OBS: Universaladaptern innehåller sekvenseringsspecifika sekvenser med hög genomströmning för DNA-provigenkänning för sekvensering av kemi. DNA-sekvenserna för universaladaptern beskrivs i tabell 1.
- Efter dA-tailing reaktion, gör universal adapter ligation mix(tabell 9 och tabell av material)för universell adapter ligatur.
- Tillsätt 21,5 μL till varje prov (total reaktionsvolym: 45,8 μL) och inkubera prover i 15 minuter vid 20 °C.
17. DNA-rensning
- Rena DNA med hjälp av magnetiska pärlor (Materialförteckning ). Elute DNA med 21 μL autoklaverat ddH2O eller nukleasfritt ddH2O.
- Förvara proverna vid -20 °C tills de är klara att utföra LM-PCR-rening (ligationsmedierad PCR) och PCR-rening.
18. Ligationsmedling av PCR
OBS: LM-PCR primer sekvenser beskrivs i tabell 1.
- Efter DNA-rensning, gör LM-PCR-blandning(tabell 10 och materialförteckning)på is.
- Tillsätt 29 μL LM-PCR-blandning till varje prov (total reaktionsvolym: 50 μL) och kör prover med programmet för LM-PCR (Tabell 10).
- Fortsätt omedelbart till gelrening av PCR-förstärkt DNA, följt av DNA-rening för sekvensering med hög genomströmning.
19. DNA-purifiering av LM-PCR-förstärkt DNA
- Kör LM-PCR-förstärkta DNA-prover, tillsammans med en DNA-stege, i en 1,5% agarose gel vid 120−180 V och punktskatter 200-400 bp band.
- Rena DNA från den strukna gelén med hjälp av en gelextraktionssats (Table of Materials).
- Efter DNA-rening, kontrollera koncentrationen (Table of Materials) av varje ChIP-exo biblioteksprov. Skicka exempel för sekvensering med hög genomströmning för enkelläsningssekvensering.
OBS: Den önskade läslängden för enkelläst sekvensering är minst 35 bp, vilket är tillräckligt för att unikt justera sekvenseringsläsningarna till referensgenomet i mus- eller mänskliga celler. För de flesta transkriptionsfaktorer i mus- eller mänskliga celler är 10−20 miljoner läsningar per ChIP-exo-prov tillräckliga för att identifiera deras genomiska bindningsplatser. Minst 30 miljoner läsningar per prov krävs för att kartlägga genomiska regioner berikade i histonmärken i däggdjursceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A illustrerar ultraljudsbehandling resultat efter cell lysis och ultraljudsbehandling, med olika cykler, av motor neuron celler differentierade från mus ES celler. Det optimala antalet ultraljudsbehandling cykler (till exempel 12 cykler i figur 2A)genererade stark DNA-intensitet i 100−400 bp DNA fragment. Högkvalitativa ChIP-exo-bibliotek baseras på storleken och mängden fragmenterat kromatin-DNA. Således rekommenderas optimering av ultraljudsbehandling för varje celltyp och sats av celler innan du startar ChIP-exo.
Figur 2B visar ligaturmedierade PCR-produkter (LM-PCR) från ChIP-exo DNA-proverna förstärkta med 18−21 PCR-cykler. LM-PCR förstärker ChIP-exo DNA-fragment som är ligated med DNA-adaptrar för nästa generations sekvensering. PCR primer är en del av DNA-adaptersekvenserna. Storleken på sonikerade DNA-fragment är cirka 100−400 bp (Figur 2A). Efter lambda exonuklease matsmältning, storleken på DNA fragment skulle bli hälften storleken på startmaterialet (50−200 bp). Cirka 125 bp DNA-adaptrar var ligated till ChIP-exo DNA fragment således, den förväntade storleken på LM-PCR produkter är 175−325 bp. Det minimala antalet PCR cyclesc samtidigt som det är tillräckligt för att förstärka ChIP-exo biblioteket, utförs för att undvika överförstärkning av ChIP-exo DNA.
Här utfördes ChIP-exo för Isl1 i mus ES cell-härledda motoriska nervceller. Isl1 är en motorisk neuron programmering transkription faktor, som uttrycks specifikt i postmitotic motor nervceller. Resultaten för Isl1 ChIP-exo visar betydande mängder 200−400 bp LM-PCR förstärkt ChIP-exo DNA (Figur 2B). Bandet cirka 100 bp indikerar PCR-artefakter från adaptrar och PCR-primers. Att köra en no antikroppskontroll tillsammans med ett experimentellt prov är också viktigt för att säkerställa att icke-specifikt, bakgrunds-DNA smältes av lambda exonukleasbehandlingen. Som ett exempel identifierade vi Isl1-bundna platser i mus ES cell-härledda motoriska nervceller med ChIP-exo och ChIP-seq (Figur 3). ChIP-exo-signalen var mycket fokuserad på Isl1-bindande platser och upptäckte flera klustrade Isl1-transkriptionsfaktorbindningsmönster. ChIP-seq-signalen visade bredare signaler, vilket indikerar att ChIP-exo av Isl1 har högre kartupplösning än ChIP-seq på Isl1.
Figur 1: Schematiskt för ChIP-exo-protokollet. Efter ChIP (steg 1−7) gör slutreparations- och dA-tailingreaktionerna ChIP DNA trubbigt genom att lägga till en fosfatgrupp till 5' änden av DNA och lägga till dATP till 3' slutet av DNA (steg 8). Soniska ändar av ChIP DNA, på pärlorna är ligated med indexadaptern (steg 9). Efter fyllnadsreaktionen blir adapterns DNA med 5' överhäng trubbigt (steg 10). Lambda exonukleas smälter det sonikerade DNA 5' till 3' upp till proteinet (TF)-DNA-korslänkningspunkter (steg 11). Efter eluering, omvänd korskoppling och DNA-extraktion (steg 12 och 13) görs denaturerat enkelsträngat DNA dubbelsträngat av index PCR primer förlängning (steg 14), följt av dA-tailing (steg 15). Universaladaptern ligateras sedan till den exonukleasbehandlade änden (steg 16). Det resulterande biblioteket städas upp, PCR-förstärks och utsätts för nästa generations sekvensering (steg 17−19). Genom att mappa de 5' ändarna av de resulterande sekvenseringstaggar till referensgenomet avgränsas exonukleasbarriären och därmed den exakta platsen för protein-DNA-korslänkning.
Figur 2: Ultraljudsbehandling och LM-PCR-förstärkning av ett ChIP-exo-bibliotek. A)1,5 % agarosgel av det elektroforerade sonikerade DNA:t. 12, 18 och 24 cykler av ultraljudsbehandling genomfördes för att hitta optimal ultraljudsbehandling cykler för 2 x 107 celler av mus ES cell-härledda motor nervceller. Efter ultraljudsbehandling var DNA-provet omvända tvärlänkade och extraheras med PCIA och etanol nederbörd. Varje prov innehöll 4 x 105 cellekvivalenter, vilket är 2% av sonikerade celler. 12 cykler av ultraljudsbehandling producerade ett större utbyte av sonikerat DNA med önskad storlek (100−500 bp). (B) 1,5% agarose gel av elektroforerade ChIP-exo bibliotek efter 18−21 cykler av LM-PCR för ingen antikroppskontroll (No Ab) och Isl1 i mus ES cell-härledda motoriska nervceller. Varje prov innehöll 10 x 106 cell motsvarighet till mus motor nervceller. Det inga antikropps-ChIP-exo-resultatet (körfält 2) visar att icke-specifikt, förorenande DNA elimineras genom lambdaexonukleas. ChIP-exo-biblioteken för Isl1 (körfält 3) visar förstärkta DNA-bibliotek runt 200−400 bp, vilket indikerar att ChIP-exo-biblioteken framgångsrikt förstärktes av adapterligantionsmedierad PCR. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Jämförelse av ChIP-exo med ChIP-seq för Isl1 vid specifik lokus. De blå och röda fyllda tomterna visar fördelningen av sekvenseringstaggar för ChIP-seq respektive ChIP-exo Isl1-bundna platser, proximala till Slit3- och Fgfr1-genen i begynnande spinalmotorneuroner differentierade från musens ES-celler.
Tabell 1: Oligonukleotider som används i detta protokoll.
| Oligo namn | Längd (nt) | Sekvens | Observera | |||||
| Indexadapter framåt* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGACGGACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGAGCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' fosfat, index (XXXXXXXX), 3' T-overhang | |||||
| Indexadapter-omvänd* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Ligaturadapter-forward* | 58 | 5 "AATGATACGGCGACCAGAGATCTACACTCTCCCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3" | ||||||
| Ligaturadapter-omvänd* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Index PCR primer* | 22 | 5'CAAGCAGACGGACGAG 3' | ||||||
| Universell PCR primer* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Ovanstående sekvenseringsadaptrar och PCR-primers är utformade för Illumina HiSeq- och NextSeq-sekvenseringsplattformar. | ||||||||
Tabell 2: Recept på lysbuffertar 1−3 och blockeringsbuffert. Förvara i 50 ml rör vid 4 °C. Tillsätt 50 μL 1000x CPI -lager (komplett proteashämmare) till alla buffertar strax före användning.
| Lysis buffert 1 | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 50% Glycerol | 10 | 10% |
| 10% Octylfenol etyloxylat | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxi]etanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
| Lysis buffert 2 | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
| Lysis buffert 3 | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% deoxykolsyra | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Lauroylsarkosin natriumsaltlösning | 0.83 | 0.50% |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
| Blockera lösning | ||
| Reagens | Belopp | [Slutlig] |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Komplett proteashämmare (KPI, 1000x) | 50 μL | 1x |
| Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) | Fyll till 50 ml | |
Tabell 3: Recept för ChIP-tvättar: Hög salttvättbuffert, LiCl-tvättbuffert och 10 mM Tris-HCl-buffert (pH 7.4). Förvara i 50 ml rör vid 4 °C. Tillsätt 50 μL 1000x KPI-lager till alla buffertar precis före användning.
| Hög salttvättbuffert | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxi]etanol | 5 | 1% |
| 5% Deoxykolsyra | 1 | 0.10% |
| 5% SDS | 1 | 0.10% |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
| LiCl tvättbuffert | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| 10% Octylfenol etyloxylat | 2.5 | 0.50% |
| 5% Deoxykolsyra | 5 | 0.50% |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
| 10 mM Tris-HCl buffert | ||
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoklaverad ddH2O | Fyll till 50 | |
Tabell 4: Fyllning reaktion master mix.
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.6 | 0,2 mg/ml |
| 10x phi29 DNA-polymerasbuffert | 6 | 1x |
| 3 mM dNTPs | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 DNA-polymeras | 2 | 10 U (på 10 U) |
| Volym för reaktionsblandning | 11.1 |
Tabell 5: Recept på ChIP Elution buffert. Förvara i 50 ml rör på RT.
| Reagens | Volym (ml) | [Slutlig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoklaverad ddH2O | upp till 50 ml |
Tabell 6: Denaturing och Primer Annealing reaktion master mix och program.
| Denaturerings- och primerglödgningsblandning | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.2 | 0,2 mg/ml |
| 3 mM dNTPs | 0.5 | 75 μM |
| 10 μM Index PCR primer | 0.5 | 0,25 μM |
| Volym för reaktionsblandning | 1.2 | |
| Denaturerings- och primerglödgningsprogram | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 95 | 5 min | |
| 65 | 3 min | |
| 60 | 3 min | |
| 57 | 3 min | |
| 54 | 3 min | |
| 51 | 3 min | |
| 30 | Forever | |
Tabell 7: Primer Extension reaktion master mix och program.
| Förlängningsblandning för primer | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| 10x phi29 DNA-polymerasbuffert | 2 | 1x |
| 10 U/μL phi29 DNA-polymeras | 1 | 75 μM |
| Volym för reaktionsblandning | 3 | |
| Primer förlängningsprogram | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 30 | 20 min | |
| 65 | 10 min | |
| 4 | Forever | |
Tabell 8: dA-Tailing reaktion master mix och program.
| dA-Tailing blandning | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Klenow fragment buffert | 2.4 | 1x |
| 5 U/μL Klenow fragment | 1 | 5 U (på 5 U) |
| Volym för reaktionsblandning | 4.1 | |
| dA-Tailing program | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 37 | 30 min | |
| 75 | 20 min | |
| 4 | Forever | |
Tabell 9: Universal Adapter Ligation reaktion master mix.
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| Autoklaverat vatten | 5 | |
| 15 μM Universaladapter* | 1 | 320 nM |
| Ligation förstärkare | 0.5 | 1x |
| Ligase mästermix | 15 | 1x |
| Volym för reaktionsblandning | 21.5 | |
| *DNA-sekvensen för universaladaptrar beskrivs i tabell 1. | ||
Tabell 10: Ligation-medierad PCR master mix och program.
| LM-PCR-blandning | ||
| Reagens | 1x (μL) | [Slutlig] |
| 10 μM Index PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 10 μM Universal PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polymeras PCR master mix | 25 | 1x |
| Volym för reaktionsblandning | 29 | |
| *PCR-primersekvenser beskrivs i tabell 1. | ||
| LM-PCR-program | ||
| Temperatur (°C) | Tid | Cykler |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15−25 |
| 65 | 75 s | |
| 65 | 5 min | 1 |
| 4 | Hålla | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll används ChIP följt av exonukleas matsmältning för att erhålla DNA-bibliotek för identifiering av protein-DNA interaktioner i däggdjursceller med ultrahög kartupplösning. Många variabler bidrar till kvaliteten på ChIP-exo-experimentet. Kritiska experimentella parametrar inkluderar kvaliteten på antikroppar, optimering av ultraljudsbehandling och antalet LM-PCR cykler. Dessa kritiska experimentella parametrar är också vad som kan begränsa ChIP-exo experiment och kommer att diskuteras nedan.
I alla ChIP-protokoll är antikroppskvalitet en av de viktigaste övervägandena. Användning av antikroppar av ChIP-klass rekommenderas för ChIP-exo. Antikroppskvaliteten kan kontrolleras innan ChIP-exo-protokollet dirigeras. ChIP-seq eller ChIP-qPCR kan användas för att validera antikroppar av ChIP-klass genom att bekräfta specifika DNA-bindande platser för det protein som är av intresse. Därefter är optimering av koncentrationen av antikroppar som tillsätts till pärlor idealisk för att säkerställa att protein-DNA-komplex är immunutfällda22,23.
Ultraljudsbehandling av kromatin är ett annat kritiskt steg i ChIP-exo protokollet. Ultraljudsbehandling är avgörande för icke-specifik shearing av kromatin, nödvändigt för optimal immunprecipitation till proteinet av intresse24. Storleken och mängden sonikerat DNA är beroende av antalet ultraljudsbehandling cykler. En hög koncentration av fragmenterat DNA är viktigt för att säkerställa att tillräckligt med DNA immunoprecipiteras till det protein som är av intresse för att ett ChIP-exo DNA-bibliotek ska skapas. Att få 100−500 bp fragmenterat DNA är idealiskt eftersom upplösningen av ChIP-exo är bättre om de sonikerade kromatinfragmenten har mindre startstorlekar. Därför bör den optimala kromatin ultraljudsbehandlingen bestämmas för varje typ och sats av celler genom att variera antalet ultraljudsbehandling cykler och ultraljudsbehandling buffertar.
Den sista kritiska parametern är att erhålla förstärkning av ChIP-exo bibliotek DNA med det minimala antalet LM-PCR cykler för att undvika överförstärkning av PCR artefakter. För att bestämma det minimala antalet PCR-cykler för att förstärka ChIP-exo DNA kan en liten del av ChIP-exo DNA användas för att köra flera PCR-cykler (till exempel 10, 15 och 20 cykler) och jämföra PCR-produkterna.
ChIP-exo har många fler steg än en traditionell ChIP-seq och som ett resultat bör varje steg utföras noggrant och exakt för chIP-exo-protokollet att fungera. Viktigt är att rätt volym för varje reagens i enzymatiska reaktioner måste läggas till varje reaktionsmästareblandning21. Att skapa ett kalkylblad för att beräkna volymen för varje reagens som krävs för varje huvudmix, sedan skriva ut tabellerna och kontrollera varje reagens efter tillägg till huvudblandningarna rekommenderas. Noggrann excision av det förstärkta DNA är också viktigt; fragment under 200 bp innehåller ofta adapter dimers, som måste tas bort före nästa generations sekvensering.
Noterbart är att de flesta kritiska parametrar och begränsningar för ChIP-exo är identiska med ChIP-seqs. Men till skillnad från ChIP-seq levererar ChIP-exo högupplöst genomkartläggning med låg bakgrund. ChIP-exo är således den idealiska metoden för att identifiera exakta protein-DNA-interaktioner i en mängd olika system och organismer, vilket hjälper till att avslöja de betydande rollerna för DNA-bindande proteiner i cellen. ChIP-exo-metoden som beskrivs ovan kan användas för att undersöka transkriptionsfaktorer, stenmodifieringsmärken och kromatinreglerande proteiner i levande celler med högre kartupplösning än ChIP-seq25,26,27. Dessutom kan ChIP-exo upptäcka de enskilda bindningsplatserna för DNA-bindande proteiner inom ett kluster, medan ChIP-seq inte kan på grund av dess mappningsupplösning. Viktigt är att ChIP-exo visar ett högre signal-till-brus-förhållande jämfört med ChIP-seq. Dessa fördelar med ChIP-exo gör det möjligt för oss att identifiera en omfattande uppsättning bundna platser över genomet. Detta protokoll kommer att utgöra en grund för forskare som är intresserade av att undersöka DNA-bindande platser för olika proteiner över hela genomet vid nära basparupplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmen i Rhee-laboratoriet för att ha delat opublicerade data och värdefulla diskussioner. Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) grant RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
