Summary
Nøyaktig bestemmelse av proteinbindende steder på tvers av genomet er viktig for å forstå genregulering. Her beskriver vi en genomisk kartleggingsmetode som behandler kromatin-immunoprecipitated DNA med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering. Denne metoden oppdager protein-DNA-interaksjoner med nær base-pair kartløsning og høyt signal-til-støy-forhold i pattedyrnevroner.
Abstract
Identifisering av spesifikke protein-DNA interaksjoner på genomet er viktig for å forstå genregulering. Kromatinimmunoprecipitation kombinert med høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) er mye brukt til å identifisere genom-wide bindende steder av DNA-bindende proteiner. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrenset av heterogeniteten i lengden av sonikerte DNA-fragmenter og ikke-spesifikk bakgrunns-DNA, noe som resulterer i lav kartløsning og usikkerhet i DNA-bindende steder. For å overvinne disse begrensningene benytter kombinasjonen av ChIP med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) 5' til 3' exonuclease fordøyelsen for å trimme den heterogeneouststore immunoprecipitated DNA til protein-DNA crosslinking site. Exonuclease behandling eliminerer også ikke-spesifikk bakgrunn DNA. Bibliotek-forberedt og exonuclease-fordøyd DNA kan sendes for høy gjennomstrømning sekvensering. ChIP-exo-metoden muliggjør nær base-pair kartløsning med større deteksjonsfølsomhet og redusert bakgrunnssignal. En optimalisert ChIP-exo-protokoll for pattedyrceller og neste generasjons sekvensering er beskrevet nedenfor.
Introduction
Plasseringen av protein-DNA interaksjoner gir innsikt i mekanismene for genregulering. Kromatin immunoprecipitation kombinert med høy gjennomstrømning sekvensering (ChIP-seq) har blitt brukt i et tiår for å undersøke genom-wide protein-DNA interaksjoner i levendeceller 1,2. ChIP-seq-metoden er imidlertid begrenset av heterogenitet i DNA-fragmentering og ubundet DNA-kontaminering som fører til lav kartløsning, falske positiver, tapte anrop og ikke-spesifikt bakgrunnssignal. Kombinasjonen av ChIP med exonuclease fordøyelse (ChIP-exo) forbedrer chip-seq-metoden ved å trimme ChIP DNA til protein-DNA crosslinking poeng, og gir nær base-pair oppløsning og et lavt bakgrunnssignal3,4,5. Den sterkt forbedrede kartleggingsoppløsningen og lav bakgrunn fra ChIP-exo gjør det mulig å bestemme nøyaktige og omfattende protein-DNA-bindende steder på tvers av genomet. ChIP-exo er i stand til å avsløre funksjonelt distinkte DNA-bindende motiver, samarbeidende interaksjoner mellom transkripsjonsfaktorer (TF) og flere protein-DNA krysskoblingssteder på et bestemt genomisk bindende sted, ikke påviselig ved andre genomiske kartmetoder3,4,6,7.
ChIP-exo ble opprinnelig brukt i spirende gjær for å undersøke sekvensspesifikk DNA-binding av TFs, for å studere den nøyaktige organiseringen av transkripsjonskomplekset før initieringskomplekset, og subnukleosomal struktur av individuelle histoner overgenomet 4,8,9. Siden introduksjonen i 20114har ChIP-exo blitt brukt i mange andre organismer, inkludert bakterier, mus og menneskeligeceller 7,10,11,12,13,14,15,16,17. I 2016 brukte Rhee et al.14 ChIP-exo i pattedyrnevroner for første gang for å forstå hvordan nevronalt genuttrykk ble opprettholdt etter nedreguleringen av programmering TF Lhx3, som danner et heterodimerkompleks med en annen programmering TF Isl1. Denne studien viste at i fravær av Lhx3 rekrutteres Isl1 til nye nevronale enhancers bundet av Onecut1 TF for å opprettholde genuttrykk av nevronale effektorgener. I denne studien avslørte ChIP-exo hvordan flere TFs dynamisk gjenkjenner celletype og cellestadsspesifikke DNA-regulatoriske elementer på en kombinatorisk måte ved nærkjerneotidkartløsning. Andre studier brukte også ChIP-exo-metoden for å forstå samspillet mellom proteiner og DNA i andre pattedyrcellelinjer. Han et al.7 brukte ChIP-exo til å undersøke genomet-wide organisering av GATA1 og TAL1 TFs i mus erythroid celler ved hjelp av ChIP-exo. Denne studien fant at TAL1 er direkte rekruttert til DNA i stedet for indirekte gjennom protein-protein interaksjoner med GATA1 gjennom erythroid differensiering. Nyere studier brukte også ChIP-exo til å profilere genomomfattende bindingssteder av CTCF, RNA Polymerase II og histonemerker for å studere epigenomiske og transkripsjonelle mekanismer i menneskeligecellelinjer 18,19.
Det finnes flere versjoner av ChIP-exo-protokollen tilgjengelig3,5,20. Disse ChIP-exo-protokollene er imidlertid vanskelige å følge for undersøkelser som ikke er kjent med neste generasjons sekvenseringsbibliotekforberedelse. En utmerket versjon av ChIP-exo-protokollen ble publisert med enkle å følge instruksjoner og en video21, men inneholdt mange enzymatiske trinn som krever en betydelig mengde tid å fullføre. Her rapporterer vi en ny versjon av ChIP-exo-protokollen som inneholder reduserte enzymatiske trinn og inkubasjonstider, og forklaringer for hvert enzymatisketrinn 21. Sluttreparasjon og dA-tailing reaksjoner kombineres i et enkelt trinn ved hjelp av end prep enzymet. Inkubasjonstidene for indeks- og universaladapter ligation trinn reduseres fra 2 t til 15 min ved hjelp av en ligation enhancer. Kinasereaksjonen etter indeksadapterens ligationtrinn som er beskrevet i den forrige ChIP-exo-protokollen, fjernes. I stedet tilsettes en fosfatgruppe under oligo DNA-syntese til en av de 5' endene av indeksadapteren (tabell 1), som vil bli brukt til lambda exonuclease fordøyelsestrinn. Mens den forrige ChIP-exo-protokollen brukte RecJf exonuclease fordøyelsen for å eliminere single-stranded DNA forurensninger, dette fordøyelsestrinnet fjernes her fordi det ikke er avgjørende for kvaliteten på ChIP-exo biblioteket. I tillegg, for å rense omvendt krysskoblet DNA etter ChIP-elitasjon, brukes en magnetisk perler rensemetode i stedet for fenol:kloroform:isoamylalkohol (PCIA) ekstraksjonsmetode. Dette reduserer inkubasjonstiden for DNA-ekstraksjon. Viktigere, det fjerner flertallet av adapter dimers dannet under indeks adapter ligation, noe som kan påvirke effektiviteten av ligation-mediert PCR.
ChIP-exo-protokollen som presenteres her er optimalisert for påvisning av presise protein-DNA-interaksjoner i pattedyrnevroner differensiert fra mus embryonale stamceller (ES). Kort, høstet og krysskoblet neuronal celler er lysed, slik at kromatin å bli utsatt for sonikering, deretter sonikert slik at riktig størrelse DNA fragmenter oppnås (Figur 1). Antistoffbelagte perler brukes deretter til selektivt immunprecipitate fragmentert, oppløselig kromatin til protein av interesse. Mens immunforeskrivet DNA er fortsatt på perlene, end-reparasjon, ligation av sekvensering adaptere, fill-in reaksjon og 5 ' til 3 ' lambda exonuclease fordøyelsen trinn utføres. Det eksonukleære fordøyelsestrinnet er det som gir ChIP-exo sin ultrahøy oppløsning og høyt signal-til-støy-forhold. Lambda exonuclease trimmer immunprecipitated DNA noen base-par (bp) fra krysskoblingsstedet, og dermed forårsaker forurensende DNA å bli degradert. Det eksonukleære ChIP DNA er eluted fra antistoffbelagte perler, protein-DNA krysskoblinger reverseres, og proteiner brytes ned. DNA ekstraheres og denatureres til en strandet ChIP DNA, etterfulgt av primer annealing og forlengelse for å lage dobbelttrådet DNA (dsDNA). Deretter utføres ligation av en universell adapter til de eksonuklelebehandlede endene. Det resulterende DNA renses, deretter PCR forsterket, gel renset, og utsatt for neste generasjons sekvensering.
ChIP-exo-protokollen er lengre enn ChIP-seq-protokollen, men er ikke veldig teknisk utfordrende. Enhver vellykket immunprecipitated ChIP DNA kan bli utsatt for ChIP-exo, med flere ekstra enzymatiske trinn. De bemerkelsesverdige fordelene med ChIP-exo, for eksempel ultrahøy kartleggingsoppløsning, et redusert bakgrunnssignal og reduserte falske positive og negativer, angående genomiske bindingssteder, oppveier tidskostnadene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Autoklavet destillert og deionisert vann (ddH2O) anbefales for å lage buffere og reaksjonsmasterblandinger. Avsnitt 1−4 beskriver cellelys og sonikering, avsnitt 5-7 beskriver kromatinimmunoprecipitation (ChIP), avsnitt 8-11 beskriver enzymatiske reaksjoner på perler, avsnitt 12 og 13 beskriver ChIP-renselse og DNA-rensing, og avsnitt 14−19 beskriver bibliotekforberedelse.
1. Høsting og krysskobling av celler
- Etter differensiering av mus ES-celler i postmitotiske nevroner, tilsett 11% formaldehyd til de høstede cellene til en endelig konsentrasjon på 1% (v / v). Steinceller på en gyngeplattform (en rocker, shaker eller rotator) i 15 min, ved romtemperatur (RT, 25 °C).
MERK: Avhengig av målproteinet som skal kryssbindes, mindre formaldehyd krysskobling (for eksempel en endelig konsentrasjon på 0,5 %) eller dobbel krysskobling med disuccinimidylglutarat (DSG) kan brukes. - Tilsett 2,5 M glysin til en endelig konsentrasjon på 150 mM for å stoppe krysskoblingsreaksjonen. Rockceller på en gyngeplattform ved RT, i 5 min.
- Sentrifuge de krysskoblede cellene i 15 ml koniske rør ved RT, i 6 min, ved 1350 x g. Aspirer oppløsningen, og resuspend celler i 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: De krysskoblede cellepellets kan oppbevares ved -80 °C etter frysing med flytende nitrogen.
2. Cellelys
MERK: Følgende trinn i denne protokollen er for ca 2 x 107 nevronale celler differensiert fra mus ES-celler. For å bryte åpne celler, vil lysisbuffere som inneholder ulike vaskemidler bli brukt. Tilsett 50 μL μL 1000x komplett proteasehemmer (KPI) lager til 50 ml buffer like før bruk.
- Klargjør lysisbuffere 1−3 som beskrevet i tabell 2.
- Tin krysskoblede cellepellets på is, deretter grundig resuspend celle pellets i 3 ml lysis buffer 1 i 15 ml koniske rør. Rock ved 4 °C i 15 min på en gyngeplattform. Sentrifuge ved 1350 x g i 5 min ved 4 °C og aspirer supernatant.
- Grundig resuspend pelleted celler i 3 ml lysis buffer 2. Rock ved 4 °C i 10 min på en gyngeplattform. Sentrifuge ved 1350 x g i 5 min ved 4 °C og aspirer supernatant.
- Tilsett 1 ml lysisbuffer 3 til hver pellet, og hold deretter på isen. Fortsett umiddelbart til sonikering.
3. Sonicating kromatin
MERK: Oppbevar prøvene på is eller ved 4 °C under denne sonikeringsprosedyren for å redusere reversering av krysskoblinger.
- Bruk en steril slikkepott til å legge til sonikeringsperler (Materialsekk) opp til 0,2 ml konfirmasjonsmerke på 15 ml polystyrenrør. Vask sonikeringsperler ved å virvle i 600 μL av 1x PBS til ingen tørre flekker er synlige. Sentrifuger rørene i 5 s ved 30 x g og aspirer 1x PBS.
MERK: Sonikering i polystyrenrør er mer effektiv enn sonikering i polypropylenrør. Hvis et mindre antall celler (for eksempel <106 celler) er sonikert, bruk 1,5 ml polystyrenrør uten å legge til sonikeringsperler. - Gjenoppus kjernefysiske lysater i 1 ml lysisbuffer 3 (fra trinn 2.4), og overfør deretter til de 15 ml polystyrenrørene som inneholder sonikeringsperler. Kort virvel polystyren rørene.
- For å fragmentere krysskoblet kromatin DNA, sonicate kjernefysiske lysates ved 4 ° C for et optimalisert antall sykluser, med kraft amplitude på 30 W, og sonikering sykluser satt til 30 s på / 30 s av.
MERK: Optimalisering av sonikering for hver celletype og batch vil resultere i det beste ChIP-exo-utbyttet. For 2 x 107 museneuronale celler vil 20-30 sonikeringssykluser ved de nevnte innstillingene fragmentere kromattinet i området 100-500 bp. - Etter sonikering er fullført, overføre alle de supernatant (sonicated lysates), fra hver prøve, til 1,5 ml rør. Tilsett 10 % 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)fenoksy]etanol) i hver prøve med en endelig konsentrasjon på 1 %. Bland ved pipettering.
- For pelletcelleavfall, sentrifugeprøver ved 13 500 x g i 10 min ved 4 °C. Overfør alle sonikerte lysater (supernatant) fra hver prøve til nye 1,5 ml rør.
- Ta 30 μL sonikert lysate fra hver prøve (~ 3% av sonicated lysate) og legg til nye 1,5 ml rør for å sjekke sonikering. Oppbevar gjenværende sonikerte lysater ved 4 °C til de er klare for inkubasjon med antistoffbelagte perler.
4. Kontrollere sonikering
- Lag 20 ml 2x proteinase K buffer ved å legge til 2 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml 0,5 M EDTA, 10 ml 10% natrium dodecylsulfat (SDS) og 6 ml autoklavet ddH2O. Ikke legg til KPI i denne bufferen. Oppbevares i 50 ml rør ved RT.
- For å reversere protein-DNA-krysskoblingen, ved å fjerne proteinene, ta 30 μL sonikert kromatin fra hver prøve (fra trinn 3.6), tilsett 166 μL autoklavet ddH2O, 200 μL 2x proteinase K buffer og 4 μL av 20 mg / ml proteinase K. Kort virvel prøvene, og deretter inkubere ved 65 °C i 1-3 timer ved 24 x g.
- MERK: De sonikerte lysates kan reverseres ved 65 °C over natten.
- Trekk ut DNA ved hjelp av PCIA (25:24:1) og etanolnedbørmetoden som følger.
FORSIKTIG: PCIA er giftig. Brukes under en røykhette med standard personlig verneutstyr (PPE).- Tilsett 400 μL PCIA i hver prøve i 1,5 ml rør, sett vortex til maksimal hastighet og virvelprøver for 20 s. Sentrifuge ved 18 400 x g i 6 min ved RT. To faser vil bli observert. Overfør forsiktig det øvre vandige laget (klar fase) av hver prøve til nye 1,5 ml rør.
- Tilsett 1 μL av 10 mg/ml RNase A. Inkuber prøver ved 37 °C i 30 min.
- Tilsett 1 μL 20 mg/ml glykogen i hver prøve, og utfell deretter med 1 ml iskaldt 100 % etanol (lagret i en -20 °C fryser). Bland kort, og inkuber deretter prøver i -80 °C fryser i 30 min til 1 time. Sentrifugeprøver ved 18 400 x g i 10 min ved 4 °C og hell forsiktig ut 100% etanol.
- Vask pellets med 500 μL iskald 70 % etanol (lagret i en -20 °C fryser). Sentrifuge ved 18 400 x g i 5 min ved 4 °C. Hell forsiktig ut 70% etanol.
- Inkuber prøver i 1,5 ml rør ved 50 °C til gjenværende etanol fordampes. Resuspend DNA pellets i 15 μL autoklavet ddH2O eller kjernefri ddH2O.
- Kjør de ekstraherte DNA-prøvene, sammen med en DNA-stige, i en 1,5% agarose gel ved 120-180 V og kontroller størrelsen på det sonikerte DNA-
5. Antistoffinkubasjon med perler
MERK: Følgende trinn i denne protokollen er for ca 2 x 107 nevronale celler differensiert fra mus ES-celler. Ikke frys og tin magnetiske perler på noe tidspunkt under ChIP-exo-protokollen, da perlene kan sprekke forårsaker forurensning av prøven eller antistoffets ytelse kan bli kompromittert.
- Etter cellelysis og sonikering, forberede Protein G magnetiske perler (Table of Materials) for ChIP, bland magnetiske perler til homogen, og deretter legge til 25 μL av magnetiske perler til 2 ml protein lav bind rør.
MERK: Typen magnetiske perler som brukes, vil avhenge av antistoffenes art. - Vask perler med 1 ml blokkeringsløsning (Tabell 2), bland godt, og plasser deretter på et magnetisk stativ i 1 min. Mens du fortsatt er på et magnetisk stativ, fjern supernatant når det er klart.
- Tilsett 1 ml blokkeringsløsning til de magnetiske perlene. Bunnrør i 10 min ved 4 °C på en gyngeplattform. Kort spinn, og plasser deretter rør på et magnetisk stativ og fjern supernatant.
- Gjenta trinn 5.3 to ganger til.
- Tilsett 500 μL blokkerende løsning til magnetiske perler. Spinn kort antistoffet mot Isl1 (0,04 μg/μL, Materialstabell), og tilsett deretter 4 μg antistoff til tilsvarende 2 ml protein lavt binderør som inneholder magnetiske perler i blokkeringsløsning.
- Gjenta trinn 5.5 uten antistoff (det vil vil at ingen antistoffkontroll for ChIP).
MERK: Mengden antistoff som skal legges til kan bestemmes empirisk ved å vurdere kvaliteten på antistoffet og antall celler som brukes til ChIP. - Steinprøver ved 4 °C i 6–24 timer på en gyngeplattform.
6. Chromatin immunforepning (ChIP)
- Vask antistoffbelagte perler fra trinn 5,8 med 1 ml blokkeringsløsning. Plasser prøver på en gyngeplattform ved 4 °C i 5 min. Fjern supernatant.
- Gjenta trinn 6.1 to ganger til.
- Resuspend antistoffbelagte perler i 50 μL blokkeringsløsning, og overfør deretter til nye 2 ml protein lavt bind rør. For hver ChIP-prøve, legg til sonikerte lysater (~ 1,0 ml fra trinn 3.6) til antistoffbelagte perler i 2 ml protein lavt bind rør.
- Inkuber hver prøve på en gyngeplattform over natten ved 4 °C.
7. ChIP vasker
MERK: Oppbevar prøvene på is eller ved 4 °C for å opprettholde protein-DNA-krysskobling under ChIP-vask.
- Lag høy saltvaskbuffer, LiCl vaskebuffer og 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) som beskrevet i tabell 3. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 °C. Tilsett 50 μL μL 1000x KPI-lager i alle buffere like før bruk.
- Kort spinn prøver i 2 ml protein lav bind rør for å samle væske fra caps, deretter plassere på et magnetisk stativ i 1 min og fjerne supernatant nøye med en pipette.
- For ChIP vasker, tilsett 1 ml lysisbuffer 3 (ved 4 °C) til hvert rør. Bland på en gyngeplattform ved 4 °C i 5 min. Kort spinnprøver, og legg deretter på et magnetisk stativ i 1 min og fjern supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml kald høy saltvaskbuffer til hvert rør. Bland på en gyngeplattform ved 4 °C i 5 min. Kort spinnprøver, og legg deretter på et magnetisk stativ i 1 min og fjern supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml kald LiCl vaskebuffer til hvert rør. Bland på en gyngeplattform ved 4 °C i 5 min. Kort spinnprøver, og legg deretter på et magnetisk stativ i 1 min og fjern supernatanten med en pipette.
- Tilsett 1 ml kald 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) til hvert rør. Bland på en gyngeplattform ved 4 °C i 5 min. Kort spinnprøver, og legg deretter på et magnetisk stativ i 1 min og fjern supernatanten med en pipette.
MERK: Tris-EDTA buffer (pH 8.0) kan brukes i stedet for Tris-HCl buffer (pH 7.4). - Gjenta trinn 7.4−7,6 tre ganger.
- Overfør prøveperlene med 500 μL Tris-HCl-buffer (pH 7,4) til friske 1,5 ml rør. Kort spinnprøver, og legg deretter på et magnetisk stativ i 1 min og fjern supernatanten med en pipette.
8. Avslutt reparasjon og dA-tailing reaksjon på perler
MERK: Sonikering genererer ofte ikke-stump avsluttet dsDNA. En sluttreparasjonsreaksjon er nødvendig for å lage sløvt DNA før dA-tailing-reaksjonen etterfulgt av indeksadapterens ligationtrinn. For klebrig end DNA ligation med indeks adapter DNA, dATP er lagt til 3 'slutten av en stump, dsDNA fragment av dA-tailing reaksjon. Reaksjonsblandingen for sluttprepping inneholder dATP.
- Etter chip vasker, tilsett 38 μL autoklavet ddH2O til prøveperlene i 1,5 ml rør for sluttreparasjon og dA-tailing reaksjon.
- Tilsett 5,6 μL med reaksjonsblanding for sluttprepp og 2,4 μL end prep enzymblanding (Materialtabell)i hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 46 μL). Inkuber prøver ved 20 °C i 30 min.
- Vask perler som beskrevet i tidligere ChIP vasketrinn 7.4-7.6.
9. Indeks adapter ligation på perler
MERK: Indekskortet har 6-10 baser av strekkodede indekssekvenser, som er spesifikke for et gitt utvalg som brukes til å multipleksere flere prøver i sekvensering med høy gjennomstrømming. Dna-sekvenser for indekskort er beskrevet i tabell 1.
- For indekskort ligation, legg til 27 μL kald 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) til prøveperlene. Tilsett 2 μL med 15 μM indeksadapter, 0,5 μL ligation enhancer og 15 μL ligase master mix (Table of Materials) til hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 44,5 μL).
- Inkuber prøver ved 20 °C i 15 min. Vask perler som beskrevet i trinn 7.4-7.6.
10. Innfyllingsreaksjon på perler
MERK: Etter adapterligation er det ingen fosfodesterbinding mellom 5's enden av adapteren og 3's enden av ChIP DNA. Nicket kan repareres av en innfyllingsreaksjon.
- Tilsett 47 μL kald 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) til prøveperlene.
- Lag den innfyllingsreaksjonsblandingen (tabell 4 og Materialbord) på is.
- Tilsett 11,1 μL påfyllingsblandingen i hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 58,1 μL). Inkuber prøver ved 30 °C i 20 min. Vask perler som beskrevet i trinn 7.4-7.6.
11. Lambda exonuclease fordøyelsen på perler
- Etter innfyllingsreaksjon på perler, tilsett 50 μL kald autoklavet ddH2O til prøveperlene.
- For å fordøye ChIP DNA i 5 ' til 3 ' retning, tilsett 6 μL av 10x lambda exonuclease buffer og 2 μL av 5 U / μL lambda exonuclease (Table of Materials, total reaksjonsvolum: 58 μL). Inkuber prøver ved 37 °C i 30 min. Vask perler som beskrevet i trinn 7.4-7.6.
12. Elution og omvendt krysskobling
- Gjør ChIP-elutionbuffer som beskrevet i tabell 5.
MERK: Ikke legg til KPI i ChIP elution buffer. - For å elute ChIP prøver fra perlene, resuspend prøver i 75 μL chip elution buffer og inkubere ved 65 ° C for 15 min ved 130 x g.
- Tilsett 2,5 μL med 20 mg/ml proteinase K (Materials table) i prøvene. Kort virvel, deretter inkuber prøvene over natten ved 65 °C.
13. DNA ekstraksjon
- Etter at prøvene har inkubert over natten ved 65 °C, snurrer du kort prøver, plasser på et magnetisk stativ i 1 min, og overfør deretter supernatanten fra hver prøve til nye 1,5 ml rør.
- Tilsett 1 μL 10 mg/ml RNase A i prøvene. Kort virvel, deretter inkubere prøvene ved 37 °C i 30 min. Tilsett ~ 25 μL autoklavet ddH2O for å volum opp til 100 μL.
- Rens DNA ved hjelp av magnetiske perler (Table of Materials). Elute DNA med 16 μL autoklavet ddH2O eller kjernefri ddH2O.
14. Denaturing, primer annealing og primer forlengelse
- Etter ChIP elution og omvendt krysskobling, overføre 16 μL av de ekstraherte DNA-prøvene fra trinn 13.3 til PCR-rør.
- Lag denaturing og primer annealing mix (Tabell 6 og Table of Materials) på is. Tilsett 1,2 μL denaturing og primer glødeblanding i hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 17,2 μL). Kjør prøver ved hjelp av programmet som er beskrevet i tabell 6 for å denatur og glødende primere til malen DNA.
- Lag primer forlengelsesblanding (tabell 7 og materialbord) på is.
- Når programmet til protese og glødende primere er fullført, tilsett 3 μL primer forlengelsesblanding til prøvene (totalt reaksjonsvolum: 20,2 μL). Kjør eksempler ved hjelp av programmet for primer forlengelse beskrevet i tabell 7.
- Fortsett umiddelbart til dA-tailing reaksjon.
15. dA-tailing reaksjon
MERK: For sticky end DNA ligation med universell adapter DNA, dATP legges til 3 'slutten av stump, dsDNA av dA-tailing reaksjon.
- Lag dA-tailing mix (Tabell 8 og Table of Materials) på is.
- Tilsett 4,1 μL dA-tailing mix til hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 24,3 μL). Kjør prøver ved hjelp av programmet for dA-tailing (Tabell 8).
- Fortsett umiddelbart til universell adapter ligation.
16. Universell adapter ligation
MERK: Den universelle adapteren inneholder sekvenseringsspesifikke sekvenser med høy gjennomstrømning for DNA-prøvegjenkjenning for sekvensering av kjemi. De universelle DNA-sekvensene for adapter er beskrevet i tabell 1.
- Etter dA-tailing reaksjon, lage universell adapter ligation mix(Tabell 9 og Table of Materials) for universell adapter ligation.
- Tilsett 21,5 μL i hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 45,8 μL) og inkuber prøver i 15 min ved 20 °C.
17. DNA opprydding
- Rens DNA ved hjelp av magnetiske perler (Table of Materials). Elute DNA med 21 μL autoklavet ddH2O eller kjernefri ddH2O.
- Oppbevar prøver ved -20 °C til de er klare til å utføre ligation-mediert PCR (LM-PCR) og PCR-rensing.
18. Ligation-mediert PCR
MERK: LM-PCR primersekvenser er beskrevet i tabell 1.
- Etter DNA-opprydding, lage LM-PCR mix(Tabell 10 og Table of Materials) på is.
- Tilsett 29 μL LM-PCR-blanding i hver prøve (totalt reaksjonsvolum: 50 μL) og kjør prøver ved hjelp av programmet for LM-PCR (tabell 10).
- Fortsett umiddelbart til gelrensing av PCR forsterket DNA, etterfulgt av DNA-rensing for sekvensering med høy gjennomstrømning.
19. DNA-klassifiseringav LM-PCR forsterket DNA
- Kjør LM-PCR forsterket DNA-prøver, sammen med en DNA stige, i en 1,5% agarose gel på 120-180 V og avgiftsdirektoratet 200-400 bp band.
- Rens DNA fra den utskåret gelen ved hjelp av et gelekstraksjonssett (Materialseksjonstabell).
- Etter DNA-rensing, sjekk konsentrasjonen (Materials tabell) for hver ChIP-exo bibliotekprøve. Send inn eksempler for sekvensering med høy gjennomstrømming for sekvensering med én lese.
MERK: Den foretrukne leselengden for enkeltlest sekvensering er minst 35 bp, noe som er tilstrekkelig til å justere sekvenseringen unikt til referansegenomet i mus eller menneskelige celler. For de fleste transkripsjonsfaktorer i mus- eller menneskeceller er 10–20 millioner lesing per ChIP-exo-prøve tilstrekkelig til å identifisere deres genomiske bindingssteder. Minst 30 millioner lesing per prøve er nødvendig for å kartlegge genomiske regioner beriket i histonemerker i pattedyrceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2A illustrerer sonikeringsresultater etter cellelysis og sonikering, med ulike sykluser, av motorneuronceller differensiert fra mus ES-celler. Det optimale antallet sonikeringssykluser (for eksempel 12 sykluser i figur 2A) genererte sterk DNA-intensitet i 100-400 bp DNA-fragmenter. Høykvalitets ChIP-exo biblioteker er basert på størrelsen og mengden av fragmentert kromatin DNA. Dermed anbefales optimalisering av sonikering for hver celletype og batch av celler før du starter ChIP-exo.
Figur 2B viser ligation-medierte PCR (LM-PCR) produkter av ChIP-exo DNA-prøver forsterket av 18-21 PCR sykluser. LM-PCR forsterker ChIP-exo DNA-fragmenter som er ligated med DNA-adaptere for neste generasjons sekvensering. PCR primer er en del av DNA-adaptersekvensene. Størrelsen på sonikerte DNA-fragmenter er rundt 100-400 bp (figur 2A). Etter lambda exonuclease fordøyelsen, størrelsen på DNA fragmenter ville bli halvparten av startmaterialet (50-200 bp). Omtrent 125 bp DNA-adaptere ble ligated til ChIP-exo DNA fragmenter dermed, den forventede størrelsen på LM-PCR produkter er 175-325 bp. Det minimale antallet PCR-sykluser samtidig som det er tilstrekkelig til å forsterke ChIP-exo-biblioteket, utføres for å unngå overforsterkning av ChIP-exo DNA.
Her ble ChIP-exo for Isl1 utført i mus ES celle-avledede motornevroner. Isl1 er en motor neuron programmering transkripsjon faktor, som er spesielt uttrykt i postmitotiske motornevroner. Resultatene for Isl1 ChIP-exo viser betydelige mengder 200-400 bp LM-PCR forsterket ChIP-exo DNA (figur 2B). Båndet rundt 100 bp indikerer PCR-artefakter fra adaptere og PCR-primere. Å kjøre en ingen antistoffkontroll sammen med en eksperimentell prøve er også viktig for å sikre at ikke-spesifikk, bakgrunns-DNA ble fordøyd av lambda exonuclease behandling. Som et eksempel identifiserte vi Isl1 bundet steder i mus ES celle-avledede motornevroner ved hjelp av ChIP-exo og ChIP-seq (Figur 3). ChIP-exo-signalet var svært fokusert på Isl1-bindende steder, og oppdaget flere grupperte Isl1 transkripsjonsfaktorbindingsmønstre. ChIP-seq-signalet viste bredere signaler, noe som indikerer at ChIP-exo av Isl1 har høyere kartløsning enn ChIP-seq av Isl1.
Figur 1: Skjematisk for ChIP-exo-protokollen. Etter ChIP (trinn 1−7) gjør sluttreparasjons- og dA-tailing-reaksjonene ChIP DNA-stumpe ved å legge til en fosfatgruppe til 5-enden av DNA og legge dATP til 3's slutten av DNA (trinn 8). Sonicated ender av ChIP DNA, på perlene er ligated med indeksadapteren (trinn 9). Etter innfyllingsreaksjonen blir adapter-DNA-et med 5' overheng sløvt (trinn 10). Lambda exonuclease fordøyer sonicated DNA 5 'til 3' opp til protein (TF)-DNA crosslinking poeng (trinn 11). Etter elution, omvendt kryssbinding og DNA-ekstraksjon (trinn 12 og 13), blir denaturert enkelttrådet DNA gjort dobbelttrådet av indeks PCR primer forlengelse (trinn 14), etterfulgt av dA-tailing (trinn 15). Den universelle adapteren blir deretter ligated til den utukle-behandlede enden (trinn 16). Det resulterende biblioteket ryddes opp, PCR-forsterkes og utsettes for neste generasjons sekvensering (trinn 17-19). Kartlegging av de 5' endene av de resulterende sekvenseringskodene til referansegenomet avgrenser den eksonukleære barrieren og dermed det nøyaktige stedet for protein-DNA-krysskobling.
Figur 2: Sonikering og LM-PCR-forsterkning av et ChIP-exo-bibliotek. (A) 1,5% agarose gel av elektroforede sonicated DNA. 12, 18 og 24 sonikeringssykluser ble utført for å finne optimale sonikeringssykluser for 2 x 107 celler med mus ES celleavledede motornevroner. Etter sonikering ble DNA-prøven omvendt krysskoblet, og ekstrahert ved hjelp av PCIA og etanolutfelling. Hver prøve inneholdt 4 x 105 celleekvivalenter, som er 2% av sonikerte celler. 12 sonikeringssykluser ga et større utbytte av sonikert DNA med ønsket størrelse (100–500 bp). (B) 1,5% agarose gel av elektroforede ChIP-exo biblioteker etter 18-21 sykluser av LM-PCR for ingen antistoffkontroll (No Ab) og Isl1 i mus ES celle-avledede motornevroner. Hver prøve inneholdt 10 x 106 celle ekvivalent av mus motor nevroner. No antistoff ChIP-exo resultatet (lane 2) viser at ikke-spesifikk, forurensende DNA elimineres av lambda exonuclease. ChIP-exo-bibliotekene for Isl1 (kjørefelt 3) viser forsterkede DNA-biblioteker rundt 200-400 bp, noe som indikerer at ChIP-exo-bibliotekene ble forsterket av adapter ligation-mediert PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av ChIP-exo til ChIP-seq for Isl1 på bestemt loci. De blå og røde fylte plottene viser fordelingen av sekvenseringskoder for ChIP-seq og ChIP-exo Isl1-bundne steder, henholdsvis proksimalt til Slit3 og Fgfr1 genet i gryende spinalmotornevroner differensiert fra mus ES-celler.
Tabell 1: Oligonucleotides brukes i denne protokollen.
| Oligo navn | Lengde (nt) | Sekvens | Merk | |||||
| Indekskort fremover* | 66 | 5'/Phos/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 3' | 5' fosfat, indeks (XXXXXXXX), 3' T-overheng | |||||
| Indekskort-revers* | 33 | 5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC 3' | ||||||
| Ligation adapter-forward* | 58 | 5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3' | ||||||
| Ligation adapter-revers* | 34 | 5'GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAG 3' | ||||||
| Indeks PCR primer* | 22 | 5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3' | ||||||
| Universell PCR-primer* | 19 | 5'AATGATACGGCGACCACCG 3' | ||||||
| *Sekvenseringsadapterne ovenfor og PCR-primere er konstruert for Illumina HiSeq- og NextSeq-sekvenseringsplattformer. | ||||||||
Tabell 2: Oppskrifter for lysisbuffere 1−3 og blokkeringsbuffer. Oppbevares i 50 ml rør ved 4 °C. Tilsett 50 μL μL 1000x KPI (komplett proteasehemmer) lager til alle buffere like før bruk.
| Lysis buffer 1 | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 1.4 | 140 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM (andre personer) |
| 50% Glyserol | 10 | 10% |
| 10% Oktylfenol ethoxylate | 2.5 | 0.50% |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoksy]etanol | 1.25 | 0.25% |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
| Lysis buffer 2 | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 2 | 200 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM (andre personer) |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
| Lysis buffer 3 | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 | 10 mM |
| 5 M NaCl | 1 | 100 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM (andre personer) |
| 10% Deoksykolsyre | 0.5 | 0.10% |
| 30% N-Lauroylsarcosine natriumsaltoppløsning | 0.83 | 0.50% |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
| Blokkeringsløsning | ||
| Reagent | Beløpet | [Endelig] |
| Storfe serumalbumin (BSA) | 250 mg | 0.50% |
| Komplett proteasehemmer (KPI, 1000x) | 50 μL | 1x (andre) |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) | Fyll til 50 ml | |
Tabell 3: Oppskrifter for ChIP vasker: Høy Salt Wash buffer, LiCl Wash buffer og 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). Oppbevares i 50 ml rør ved 4 °C. Tilsett 50 μL μL 1000x KPI-lager i alle buffere like før bruk.
| Høy saltvaskbuffer | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 1 M HEPES (pH 7.3) | 2.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 5 | 500 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM (andre personer) |
| 10% 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoksy]etanol | 5 | 1% |
| 5% Deoksykolsyre | 1 | 0.10% |
| 5 % SD-er | 1 | 0.10% |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
| LiCl vaskebuffer | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 2 | 20 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 0.1 | 1 mM (andre personer) |
| 1 M LiCl | 12.5 | 250 mM |
| 10% Oktylfenol ethoxylate | 2.5 | 0.50% |
| 5% Deoksykolsyre | 5 | 0.50% |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
| 10 mM Tris-HCl buffer | ||
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.4) | 0.5 | 10 mM |
| Autoklavet ddH2O | Fyll til 50 | |
Tabell 4: Innfyllingsreaksjonsmesterblanding.
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.6 | 0,2 mg/ml |
| 10x phi29 DNA polymerase buffer | 6 | 1x (andre) |
| 3 mM dNTPs | 2.5 | 150 μM |
| 10 U/μL phi29 DNA polymerase | 2 | 10 U |
| Volum for reaksjonsblanding | 11.1 |
Tabell 5: Oppskrift på ChIP Elution buffer. Oppbevares i 50 ml rør ved RT.
| Reagent | Volum (ml) | [Endelig] |
| 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) | 5 | 50 mM |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | 1 | 10 mM |
| 10% SDS | 5 | 1% |
| Autoklavet ddH2O | opptil 50 ml |
Tabell 6: Denaturing og Primer Annealing reaksjon master mix og program.
| Denaturing og primer annealing blanding | ||
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| 20 mg/ml BSA | 0.2 | 0,2 mg/ml |
| 3 mM dNTPs | 0.5 | 75 μM |
| 10 μM Indeks PCR primer | 0.5 | 0,25 μM |
| Volum for reaksjonsblanding | 1.2 | |
| Denaturing og primer annealing program | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 95 | 5 min. | |
| 65 | 3 min. | |
| 60 | 3 min. | |
| 57 | 3 min. | |
| 54 | 3 min. | |
| 51 | 3 min. | |
| 30 | Alltid | |
Tabell 7: Primer Extension reaksjon master mix og program.
| Primer forlengelse blanding | ||
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| 10x phi29 DNA polymerase buffer | 2 | 1x (andre) |
| 10 U/μL phi29 DNA polymerase | 1 | 75 μM |
| Volum for reaksjonsblanding | 3 | |
| Primer utvidelsesprogram | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 30 | 20 min. | |
| 65 | 10 min. | |
| 4 | Alltid | |
Tabell 8: dA-Tailing reaksjon master mix og program.
| dA-Tailing blanding | ||
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| 3 mM dATP | 0.7 | 120 μM |
| Klenow fragment buffer | 2.4 | 1x (andre) |
| 5 U/μL Klenow-fragment | 1 | 5 U |
| Volum for reaksjonsblanding | 4.1 | |
| dA-Tailing program | ||
| Temperatur (°C) | Tid | |
| 37 | 30 min. | |
| 75 | 20 min. | |
| 4 | Alltid | |
Tabell 9: Universal Adapter Ligation reaksjon master blanding.
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| Autoklavet vann | 5 | |
| 15 μM Universal adapter* | 1 | 320 000 000 000 000 |
| Ligation enhancer | 0.5 | 1x (andre) |
| Ligase mestermiks | 15 | 1x (andre) |
| Volum for reaksjonsblanding | 21.5 | |
| *Universal adapter DNA-sekvens er beskrevet i tabell 1. | ||
Tabell 10: Ligation-Mediert PCR master mix og program.
| LM-PCR-blanding | ||
| Reagent | 1x (μL) | [Endelig] |
| 10 μM Indeks PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 10 μM universell PCR primer* | 2 | 0,2 μM |
| 2x Taq DNA polymerase PCR master blanding | 25 | 1x (andre) |
| Volum for reaksjonsblanding | 29 | |
| *PCR-primersekvenser er beskrevet i tabell 1. | ||
| LM-PCR-programmet | ||
| Temperatur (°C) | Tid | Sykluser |
| 98 | 30 s | 1 |
| 98 | 10 s | 15–25.15.25.25.00 |
| 65 | 1000-000 000 | |
| 65 | 5 min. | 1 |
| 4 | Holde | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen brukes ChIP etterfulgt av exonuclease fordøyelse til å skaffe DNA-biblioteker for identifisering av protein-DNA-interaksjoner i pattedyrceller ved ultrahøy kartleggingsoppløsning. Mange variabler bidrar til kvaliteten på ChIP-exo-eksperimentet. Kritiske eksperimentelle parametere inkluderer kvaliteten på antistoffer, optimalisering av sonikering, og antall LM-PCR sykluser. Disse kritiske eksperimentelle parametrene er også det som kan begrense ChIP-exo eksperimenter og vil bli diskutert nedenfor.
I enhver ChIP-protokoll er antistoffkvalitet en av de viktigste hensynene. Bruk av ChIP-antistoffer anbefales for ChIP-exo. Antistoffkvaliteten kan kontrolleres før chip-exo-protokollen gjennomføres. ChIP-seq eller ChIP-qPCR kan brukes til å validere ChIP-klasse antistoffer ved å bekrefte spesifikke DNA bindende steder av protein av interesse. Deretter er optimalisering av konsentrasjonen av antistoffer lagt til perlene ideell for å sikre at protein-DNA-komplekser er immunforeskrevet22,23.
Sonikering av kromatin er et annet kritisk skritt i ChIP-exo-protokollen. Sonikering er avgjørende for ikke-spesifikk klipping av kromatin, nødvendig for optimal immunoprecipitation til protein av interesse24. Størrelsen og mengden sonikert DNA er avhengig av antall sonikeringssykluser. En høy konsentrasjon av fragmentert DNA er viktig for å sikre at nok DNA er immunprecipitated til protein av interesse for en ChIP-exo DNA bibliotek som skal opprettes. Å skaffe 100-500 bp fragmentert DNA er ideelt fordi oppløsningen av ChIP-exo er bedre hvis de sonikerte kromatinfragmentene har mindre startstørrelser. Derfor bør den optimale kromatin sonikeringen bestemmes for hver type og batch av celler ved å variere antall sonikeringssykluser og sonikeringsbuffere.
Den endelige kritiske parameteren er å skaffe forsterkningen av ChIP-exo bibliotek DNA med minimalt antall LM-PCR sykluser for å unngå overforsterkning av PCR artefakter. For å bestemme det minimale antallet PCR-sykluser for å forsterke ChIP-exo DNA, kan en liten del av ChIP-exo DNA brukes til å kjøre flere PCR-sykluser (for eksempel 10, 15 og 20 sykluser) og sammenligne PCR-produktene.
ChIP-exo har mange flere trinn enn en tradisjonell ChIP-seq, og som et resultat bør hvert trinn utføres nøye og presist for at ChIP-exo-protokollen skal fungere. Viktigere, riktig volum av hver reagens i enzymatiske reaksjoner må legges til hver reaksjon master blanding21. Dermed anbefales det å opprette et regneark for å beregne volumet på hver reagens som kreves for hver hovedblanding, og deretter skrive ut tabellene og kontrollere hver reagens etter tillegg til hovedblandingene anbefales. Forsiktig utskjæring av det forsterkede DNA er også viktig; fragmenter under 200 bp inneholder ofte adapterdydere, som må fjernes før neste generasjons sekvensering.
Spesielt er de fleste kritiske parametere og begrensninger av ChIP-exo identiske med chip-seq. Men i motsetning til ChIP-seq leverer ChIP-exo høyoppløselig genomkartlegging med lav bakgrunn. Dermed er ChIP-exo den ideelle metoden for å identifisere presise protein-DNA-interaksjoner i en rekke systemer og organismer, noe som bidrar til å avsløre de betydelige rollene til DNA-bindende proteiner i cellen. ChIP-exo-metoden beskrevet ovenfor kan brukes til å undersøke transkripsjonsfaktorer, histonmodifiseringsmerker og kromatin regulatoriske proteiner i levende celler ved høyere kartløsning enn ChIP-seq25,26,27. I tillegg kan ChIP-exo oppdage de individuelle bindingsstedene til DNA-bindende proteiner i en klynge, mens ChIP-seq ikke kan på grunn av kartløsningen. Viktigere, ChIP-exo viser et høyere signal-til-støy-forhold sammenlignet med ChIP-seq. Disse fordelene med ChIP-exo tillater oss å identifisere et omfattende sett med bundne steder over genomet. Denne protokollen vil gi et grunnlag for forskere som er interessert i å undersøke DNA-bindende steder av ulike proteiner over genomet ved nær base-pair oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmet av Rhee-laboratoriet for å dele upubliserte data og verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) stipend RGPIN-2018-06404 (H.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biology. 14 (12), 147 (2013).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).
- Starick, S. R., et al. ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors. Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).
- Han, G. C., et al. Genome-Wide Organization of GATA1 and TAL1 Determined at High Resolution. Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 157-172 (2016).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome. Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).
- Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri. Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).
- Kim, D., et al. Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).
- Niu, B., et al. In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets. Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).
- Uuskula-Reimand, L., et al. Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders. Genome Biology. 17, (2016).
- Rhee, H. S., et al. Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers. Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. Plos One. 11 (2), (2016).
- Wang, S., et al. ATF4 Gene Network Mediates Cellular Response to the Anticancer PAD Inhibitor YW3-56 in Triple-Negative Breast Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (4), 877-888 (2015).
- Barfeld, S. J., et al. c-Myc Antagonises the Transcriptional Activity of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Affecting Key Gene Networks. Ebiomedicine. 18, 83-93 (2017).
- McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells. Scientific Data. 5, 180030 (2018).
- Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer. Scientific Data. 6, 190033 (2019).
- Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F.
- Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Terranova, C., et al. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Pchelintsev, N. A., Adams, P. D., Nelson, D. M. Critical Parameters for Efficient Sonication and Improved Chromatin Immunoprecipitation of High Molecular Weight Proteins. PLos One. 11 (1), (2016).
- Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data. Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).
- Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes. Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).
- Vinayachandran, V., et al. Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock. Genome Research. , (2018).
