Primære cilier er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær cilia detektion ved immunfluorescerende farvning er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i ekstremt høj kvalitet billeder. I denne protokol, fibroblaster udtrykke primære cilier blev fastsat, immunstained, og afbildet i en fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne af cellecyklussen, og som resorberes før mitose. Primær cilier kan visualiseres med meget avancerede metoder, herunder transmission elektron mikroskopi, 3D-billeddannelse, eller ved hjælp af software til automatisk påvisning af primære cilier. Men, immunfluorescerende farvning af primære cilier er nødvendig for at udføre disse metoder. Denne publikation beskriver en protokol til nem påvisning af primær cilier in vitro ved farvning acetylerede alpha tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal krop). Denne immunfluorescerende farvning protokol er relativt enkel og resulterer i billeder i høj kvalitet. Denne protokol beskriver, hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster), der udtrykker primær cilier, blev fikseret, immunstained og afbildet med et fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Primære cilier er sensoriske, ensomme, membran-bundet, ikke-tåtil strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære cilier findes på de fleste hvirveldyr celler med undtagelse af røde blodlegemer, adipocytter1, og hepatocytes2. Primær cilier dannes som en aflang axonme sammensat af mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Axonemet vokser fra den basale krop, som er struktureret fra γ-tubulin. Længden af den primære cilier varierer mellem 2-10 μm; dimensionerne kan dog ændre sig under glycylation, sult, hypoxi, cytotoksisk stress eller efter udsættelse for iioniserendestråling 3,4,,5,6,7. Normalt har celler kun ét primært cilium, som er involveret i morfogenese og cellesignalveje, der er vigtige for celleproliferedning og differentiering8,9.
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne, og resorberes, før de indtastes i mitose i en proces forbundet med tubulindeacetylation medieret af HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøjagtige øjeblik for primær cilia resorption afhænger af celletype og udtryk for gener direkte involveret i denne proces, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Afhængigt af celletypen udtrykker den primære cilier forskellige typer receptorer, ionkanaler og aktive signalveje. Disse omfatter de vigtigste signalreceptorer, der påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkluderet er nogle af de signalveje, der kan påvirke funktionen af et eller flere organer, herunder pindsvin, Notch, og Wnt. Takket være disse receptorer og signalveje, den primære cilier også udføre en kemosensorisk funktion. Denne funktion gør det muligt for primære cilier at opdage specifikke ligander for Notch, hormoner, og biologisk aktive stoffer såsom serotonin eller somatostatin. Andre specifikke funktioner udstillet af primære cilier af forskellige længder omfatter reaktion på ændringer i temperatur, tyngdekraft, og osmolalitet14.
Primær cilier kan visualiseres ved hjælp af forskellige metoder, såsom levende visualisering, transmission elektron mikroskopi, 3D-billedbehandling, eller ved software til automatisk påvisning af primære cilier5,15,16,17. Men disse metoder er højt specialiserede og igangværende forskning behov grundlæggende, hurtig og nem metoder til farvning primære cilier i alle faser af forskningen. Beskrevet er en nem og nyttig metode til påvisning af primære cilier i dyrkede celler.
Flere forfattere har beskrevet forskellige metoder til påvisning af primære cilier, undertiden også beskriver forskellige fiksering metoder, der kan påvirke derespåvisning6,20,,21,22. Uanset hvad, er det svært at finde en komplet og ligetil protokol til registrering. Den disponibile metode vil uden tvivl være til stor hjælp for undersøgelsen af den primære cilierundersøgelse, især i…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet i Tjekkiet – Langsigtet organisation udviklingsplan Medicinske aspekter af masseødelæggelsesvåben af Fakultetet for MilitærSundhedsvidenskab, University of Defence; Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport, Tjekkiet (Specifikt forskningsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Også tak til Daniel Diaz for hans venlige hjælp i engelsk revision.
6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |