ゼブラフィッシュにおける機能化された蛍光シリカナノ粒子を用いた異種移植ヒト癌細胞のビボ標的化
Summary
ここで説明するゼブラフィッシュ胚を利用して、生体内のヒト癌細胞を標的とする機能化されたナノ粒子の能力を研究する方法について説明する。この方法は、大型動物および臨床試験における将来の試験に最適なナノ粒子の評価と選択を可能にする。
Abstract
がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、ナノメディシン分野において大きな関心を持っています。生体内の動物モデルは、ナノテクノロジーを生体医学の応用に橋渡しするために必要とされています。マウスは、前臨床試験のための伝統的な動物モデルを表します。しかし、マウスは比較的高価であり、各母親からの限られた子孫のために長い実験サイクルを有する。ゼブラフィッシュは、がん研究を含む発達および生物医学研究のための強力なモデルシステムとして登場しました。特に、その光学的透明性と急速な発達により、ゼブラフィッシュ胚は、がん細胞の挙動およびそれらの微小環境との相互作用をリアルタイムでインビボで監視するのに適しています。この方法は、透明キャ スパー ゼブラフィッシュ胚にヒトがん細胞と機能化ナノ粒子を順次導入し、ナノ粒子によるがん細胞の認識と標的化をリアルタイムで監視するために開発されました。この最適化されたプロトコルは、葉酸基で機能する蛍光標識ナノ粒子が、異なるフルオロクロムで標識されたヒト子宮頸部上皮癌細胞を特異的に認識し、標的化できることを示している。認識および標的化プロセスは、試験したナノ粒子の注入後30分で早くも起こり得る。全体の実験は、成魚のいくつかのペアの繁殖を必要とし、完了するまでに4日未満かかります。さらに、ゼブラフィッシュ胚は機能的な適応免疫系を欠き、幅広いヒト癌細胞の生着を可能にする。したがって、ここで説明するプロトコルの有用性により、さまざまなタイプのヒト癌細胞上でナノ粒子を試験することができ、哺乳類および診療所における将来の検査のために、各特定の癌コンテキストにおける最適なナノ粒子の選択を促進する。
Introduction
がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、物理学者と生物医学研究者の両方にとって大きな関心事です。ナノメディシンの出現は、リガンドおよび/または化学療法薬,1、2、32を標的としたものなど、いくつかのナノ粒子の開発につながった。13ナノ粒子の追加特性により、生物学的システムとの相互作用が可能となり、治療用途とともに高効率かつ正確な生体事象を検出および監視することができます。金と酸化鉄のナノ粒子は、主にコンピュータ断層撮影および磁気共鳴画像化アプリケーションで使用されます。金および酸化鉄ナノ粒子の酵素的活動は、着色アッセイを介して癌細胞の検出を可能にするが、蛍光性ナノ粒子はインビボイメージングアプリケーション4に適している。中でも、超明るい蛍光性ナノ粒子は、より少ない粒子と毒性の低減を伴う早期に癌を検出する能力のために、特に有益である。
これらの利点にもかかわらず、ナノ粒子は、適切なナノ材料の選択と合成プロセスの最適化のためにin vivo動物モデルを使用して実験を必要とする。さらに、薬物と同様に、ナノ粒子は、その有効性と毒性を決定するために前臨床試験のために動物モデルに依存しています。最も広く使用されている前臨床モデルは、その維持が比較的高いコストで来る哺乳類であるマウスです。癌研究のために、遺伝子操作されたマウスまたは異種移植マウスのいずれかが典型的には66,77を用いる。これらの実験の長さは、多くの場合、数週間から数ヶ月に及びます。特に、癌転移研究のために、癌細胞は、尾,静脈および脾臓88、9、10などの場所でマウスの循環系に直接注入される。,910これらのモデルは、腫瘍細胞が遠くの器官を精外に出して植民地化する場合の転移の終わりの段階を表すだけです。また、視認性の問題により、マウスにおける腫瘍細胞遊動やナノ粒子標的化を監視することは特に困難である。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その高い菌性、低コスト、急速な発達、光学的透明性、および遺伝的保存11、12,12のために癌研究のための強力な脊椎動物システムとなっています。マウスモデルに対するゼブラフィッシュのもう一つの利点は、発達を通じて胚を監視することを可能にする魚の卵元子宮の受精である。胚発生はゼブラフィッシュにおいて急速であり、そして24時間以内に受精後(hpf)、脊椎動物のボディプレーンはすでに13を形成している。72 hpfによって、卵は絨毛膜から孵化し、胚から稚魚の段階に移る。ゼブラフィッシュの透明性、特に14のキャスパー株は、生きている動物のナノ粒子による癌細胞の移動とその認識および標的化を視覚化するユニークな機会を提供する。最後に、ゼブラフィッシュは48hpfによって自然免疫系を発達させ、適応免疫系は遅れ、受精後28日で機能するだけである。このギャップは、免疫拒絶反応を経験することなく、ゼブラフィッシュ胚への様々なタイプのヒト癌細胞の移植に理想的である。
ここで説明するゼブラフィッシュの透明性と急速な発達を利用して、生体内の蛍光性ナノ粒子によるヒト癌細胞の認識および標的化を実証する方法を説明する。このアッセイでは、赤蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されたヒト子宮頸癌細胞(HeLa細胞)を、48hpf胚の膜腔内の血管化領域に注入した。20-24時間後、HeLa細胞はすでに魚の循環系を通じて胚全体に広がっていた。明らかな転移を有する胚は、高い毛細血管床がある眼の真後ろにナノ粒子溶液の〜0.5nLをマイクロインジェクションした。この技術を使用すると、超明るい蛍光シリカナノ粒子は、注射後20〜30分の速さでHeLa細胞を標的にすることができます。そのシンプルさと有効性のために、ゼブラフィッシュは、特定の癌細胞を標的とする能力について様々なナノ粒子をテストするための堅牢なin vivoモデルを表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、ナノ粒子が転移性ヒト癌細胞を認識し、標的とする能力をテストするin vivoシステムとしてゼブラフィッシュを利用する。実験の成功に影響を与える要因がいくつかあります。まず、胚は48 hpfで完全に発達する必要がある。胚の正しい発達段階は、ヒト癌細胞の移植に耐え、生き残ることを可能にする。48hpf未満の胚は、古くて発達した胚に比べて生存率が有意?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿を校正してくれたケイリー・スミス氏、ローレン・クウォック氏、アレクサンダー・フロル氏に感謝している。H.F.は、NIH(CA134743およびCA215059)、米国癌学会(RSG-17-204 01-TBG)、セントボールドリック財団からの助成金支援を認めています。F.J.F.L.は、ボストン大学イノベーションセンター-がんのためのナノテクノロジーの学際訓練(XTNC)からのフェローシップを認めています。I.S は、NSF サポート (CBET 1605405 を付与) および NIH R41AI142890 を承認します。
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
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