Summary
Décrit ici est une méthode pour utiliser des embryons de poisson zèbre pour étudier la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à cibler les cellules cancéreuses humaines in vivo. Cette méthode permet l’évaluation et la sélection de nanoparticules optimales pour les futurs essais chez les grands animaux et dans les essais cliniques.
Abstract
Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt dans le domaine de la nanomédecine. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour faire le pont entre la nanotechnologie et son application biomédicale. La souris représente le modèle animal traditionnel pour les essais précliniques; cependant, les souris sont relativement chères à garder et ont de longs cycles expérimentaux en raison de la descendance limitée de chaque mère. Le poisson zèbre est devenu un puissant système modèle de recherche développementale et biomédicale, y compris la recherche sur le cancer. En particulier, en raison de sa transparence optique et de son développement rapide, les embryons de poisson zèbre sont bien adaptés à la surveillance in vivo en temps réel du comportement des cellules cancéreuses et de leurs interactions avec leur microenvironnement. Cette méthode a été développée pour introduire séquentiellement les cellules cancéreuses humaines et les nanoparticules fonctionnalisées dans les embryons transparents de poisson zèbre Casper et surveiller la reconnaissance in vivo et le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules en temps réel. Ce protocole optimisé montre que les nanoparticules fluorescentes étiquetées, qui sont fonctionnalisées avec des groupes folates, peuvent reconnaître et cibler spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales humaines métastatiques étiquetées avec un fluorochrome différent. Le processus de reconnaissance et de ciblage peut se produire dès 30 min post-injection des nanoparticules testées. L’expérience ne nécessite que la reproduction de quelques couples de poissons adultes et prend moins de 4 jours pour terminer. En outre, les embryons de poisson zèbre n’ont pas un système immunitaire adaptatif fonctionnel, permettant l’engrafment d’un large éventail de cellules cancéreuses humaines. Par conséquent, l’utilité du protocole décrit ici permet de tester des nanoparticules sur différents types de cellules cancéreuses humaines, facilitant la sélection de nanoparticules optimales dans chaque contexte spécifique de cancer pour les tests futurs chez les mammifères et la clinique.
Introduction
Le développement de nanoparticules capables de détecter, de cibler et de détruire les cellules cancéreuses est d’un grand intérêt pour les physiciens et les chercheurs biomédicaux. L’émergence de la nanomédecine a conduit au développement de plusieurs nanoparticules, telles que celles conjuguées avec des ligands de ciblage et/ou des médicaments chimiothérapeutiques1,2,3. Les propriétés ajoutées des nanoparticules permettent leur interaction avec le système biologique, la détection et la surveillance des événements biologiques avec une grande efficacité et précision ainsi que des applications thérapeutiques. Les nanoparticules d’or et d’oxyde de fer sont principalement utilisées dans la tomographie calculée et les applications d’imagerie par résonance magnétique, respectivement. Alors que les activités enzymatiques des nanoparticules d’or et d’oxyde de fer permettent la détection des cellules cancéreuses par des tests colorimétriques, les nanoparticules fluorescentes sont bien adaptées aux applications d’imagerie in vivo4. Parmi eux, les nanoparticules fluorescentes ultrabright sont particulièrement bénéfiques, en raison de leur capacité à détecter les cancers tôt avec moins de particules et des toxicités réduites5.
Malgré ces avantages, les nanoparticules nécessitent des expérimentations à l’aide de modèles animaux in vivo pour la sélection de nanomatériaux appropriés et l’optimisation du processus de synthèse. En outre, tout comme les médicaments, les nanoparticules s’appuient sur des modèles animaux pour les tests précliniques afin de déterminer leur efficacité et leur toxicité. Le modèle préclinique le plus utilisé est la souris, qui est un mammifère dont l’entretien a un coût relativement élevé. Pour les études sur le cancer, les souris génétiquement modifiées ou les souris xénograftées sont généralement utilisées6,,7. La durée de ces expériences s’étend souvent de semaines à mois. En particulier, pour les études de métastases cancéreuses, les cellules cancéreuses sont directement injectées dans le système circulatoire des souris à des endroits tels que les veines de queue et les rates8,9,10. Ces modèles ne représentent les phases finales de la métastase que lorsque les cellules tumorales extravasent et colonisent des organes éloignés. En outre, en raison de problèmes de visibilité, il est particulièrement difficile de surveiller la migration des cellules tumorales et le ciblage des nanoparticules des cellules tumorales chez les souris.
Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un puissant système vertébré pour la recherche sur le cancer en raison de sa fécondité élevée, faible coût, développement rapide, transparence optique, et les conservations génétiques11,12. Un autre avantage du poisson zèbre sur le modèle de souris est la fertilisation des oeufs de poisson ex utero, qui permet aux embryons d’être surveillés tout au long de leur développement. Le développement embryonnaire est rapide chez le poisson zèbre, et dans les 24 heures postfertilisation (hpf), le plan du corps vertébré a déjà formé13. Par 72 hpf, les œufs sont éclos à partir du chorion, passant de l’embryon au stade des alevins. La transparence du poisson zèbre, la souche Casper en particulier14, offre une occasion unique de visualiser la migration des cellules cancéreuses et leur reconnaissance et leur ciblage par les nanoparticules chez un animal vivant. Enfin, le poisson zèbre développe son système immunitaire inné de 48 hpf, le système immunitaire adaptatif étant à la traîne et ne devenant fonctionnel qu’à 28 jours après la fertilisation15. Cet écart de temps est idéal pour la transplantation de divers types de cellules cancéreuses humaines dans des embryons de poisson zèbre sans éprouver de rejets immunitaires.
Décrit ici est une méthode qui tire parti de la transparence et le développement rapide du poisson zèbre pour démontrer la reconnaissance et le ciblage des cellules cancéreuses humaines par des nanoparticules fluorescentes in vivo. Dans ce test, les cellules cancéreuses du col de l’utérus humains (cellules HeLa) génétiquement modifiées pour exprimer une protéine fluorescente rouge ont été injectées dans la zone vascularisée dans la cavité périviseline de 48 embryons de hpf. Après 20-24 h, les cellules HeLa s’étaient déjà propagées à travers les embryons par le système circulatoire des poissons. Les embryons atteints de métastases apparentes ont été microinjectés avec ~0,5 nL d’une solution de nanoparticule directement derrière l’œil, où se trouve le riche lit capillaire. Grâce à cette technique, les nanoparticules fluorescentes ultrabright peuvent cibler les cellules HeLa aussi rapidement que 20-30 min post-injection. En raison de sa simplicité et de son efficacité, le poisson zèbre représente un modèle in vivo robuste pour tester une variété de nanoparticules pour leur capacité à cibler des cellules cancéreuses spécifiques.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Boston University School of Medicine en vertu du protocole #: PROTO201800543.
1. Génération d’embryons de poisson zèbre Casper
- Choisissez des poissons casper adultes âgés d’au moins 3 mois pour la reproduction naturelle afin de générer des embryons transparents de poisson zèbre Casper.
- Remplir les réservoirs d’accouplement à deux chambres d’eau de poisson le soir, séparer les réservoirs supérieurs à l’aide de séparateurs, placer un poisson mâle dans un côté de la chambre et un ou deux poissons femelles dans l’autre côté de la chambre, et laisser le poisson séparé pendant la nuit par des séparateurs.
- Retirez les séparateurs le lendemain matin à 8h00 lorsque les lumières sont allumées. Ajouter les plantes d’enrichissement artificiel et incliner légèrement la chambre supérieure pour créer une zone peu profonde de l’eau. Laisser les poissons se reproduire pendant 3-4 h.
- Soulevez les chambres supérieures des réservoirs d’accouplement qui contiennent les poissons et retournez-les dans leurs réservoirs d’origine.
- Recueillir les œufs situés dans les chambres inférieures en versant l’eau à travers un filet de maille. Transférer les œufs dans une boîte de Pétri stérile à une densité ne pas dépasser 200 œufs par plat. Retirer les œufs morts ou non fécondés et remplir le plat 2/3 d’eau fraîche.
REMARQUE : Les œufs fécondés et sains doivent être translucides et ronds. Tous les œufs nuageux, blancs ou défigurés doivent être enlevés. L’eau de poisson est obtenue à partir de réservoirs de poissons dans l’installation de poissons. - Incuber les embryons dans l’incubateur à 28,5 °C pendant la nuit.
- Blanchir les embryons le lendemain matin en utilisant le protocole standard tel que décrit dans le Livre de poissons zèbres16, et remettre les embryons à l’incubateur (étape facultative).
- Sortez les 24 embryons de hpf de l’incubateur dans l’après-midi et déchoirez les embryons à l’aide de pronase.
- Retirer autant d’eau de poisson que possible des embryons dans la boîte de Pétri et ajouter quelques gouttes de la solution pronase (1 mg/mL dans l’eau de poisson) au plat. Faire tourbillonner délicatement la boîte de Pétri. Une fois que les chorions montrent des signes de désintégration, pipette les embryons de haut en bas à quelques reprises pour décomposer les chorions pour libérer les embryons.
- Ajouter immédiatement de l’eau de poisson frais dans la boîte de Pétri pour mettre fin au processus une fois que la majorité des embryons sont hors des chorions. Rincer les embryons 3 fois plus à l’aide d’eau de poisson pour enlever les chorions flottants. Retournez les embryons à l’incubateur.
2. Préparation des cellules cancéreuses humaines pour la transplantation
- Réglez la température de l’incubateur à exactement 35.5 °C. Surveillez l’incubateur pour assurer une température constante et stable à l’aide d’un thermomètre à l’intérieur de l’incubateur.
- Autoclave 1 L d’eau de poisson dans une bouteille en verre. Faire une solution agarose de 3 % en ajoutant 3 g d’agarose de qualité électrophorèse à 100 mL d’eau de poisson autoclavée et de micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
- Verser la solution agarose chaude dans une boîte de Pétri jusqu’à ce qu’elle soit pleine de 3/4. Placez le moule de microinjection sur l’agarose. Assurez-vous que le moule n’est pas en contact avec le fond de la boîte de Pétri et qu’aucune bulle ne se forme en dessous.
- Laissez la solution solidifier et retirer soigneusement le moule de la plaque. Remplissez la plaque d’eau de poisson autoclavée et rangez la plaque à 4 °C. Préguerre la plaque d’agarose et l’eau de poisson dans l’incubateur de 35,5 °C avant de récolter les cellules HeLa.
- Tirez 1,0 mm O.D. x 0,78 mm de capillaires en verre borosilicate sur un puller de pipette en utilisant les réglages suivants : pression à 500, chaleur à 560, traction à 100, vitesse à 100 et temps/retard à 200. Conservez les aiguilles sur le mastic dans une grande boîte de Pétri qui a été essuyée avec une serviette à l’éthanol.
ATTENTION : Les aiguilles tirées sont très pointues et fragiles. Soyez prudent lors de la manipulation. - Préparer une solution de stockage de méthanesulfonate de tricaine (MS222, 4 mg/mL) en dissolvant le MS222 dans l’eau de poisson autoclavée. Vortex bien avant utilisation. Diluer la solution de stock MS222 1:100 dans l’eau de poisson (c.-à-d. ajouter 200 μL de solution de stock MS222 à 20 mL d’eau de poisson à une concentration finale de 40 μg/mL) pour anesthésier les embryons pour les procédures suivantes.
- Culture hLabel HeLa cellules en les transducant avec PLenti6.2_miRFP670 lentivirus en utilisant le protocole décrit17. Récoltez les cellules RFP+ HeLa 30 min-1 h avant la transplantation.
REMARQUE : Les cellules hela humaines ont été cultivées dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à 70% de confluence dans le milieu de croissance complet (milieu DMEM avec 10% FBS) à 37 °C complétés par 5% de CO2.- Retirez le milieu cellulaire HeLa par aspiration dans une hotte de culture tissulaire. Rincez brièvement la couche cellulaire à l’un de la pbs stérile pour enlever toutes les traces du sérum.
- Ajouter 3,0 ml de solution stérile Trypsine-EDTA à une fiole T-75 et remettre les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 3 à 5 min pour faciliter la digestion enzymatique. Observez la fiole au microscope jusqu’à ce que ~80% des cellules deviennent suspendues.
- Ajouter 6 à 8 ml de milieu de croissance complet dans la fiole. Recueillir les cellules dans un tube stérile de 15 mL en pipeting doucement. Centrifugeuse à 135 x g pendant 5 min.
- Remplacer les cellules HeLa supernatantes et resuspend dans 3 mL de milieu de croissance complet. Répétez l’étape de lavage 2x ci-dessus. Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu de croissance complet et comptez les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre.
- Faites tourner les cellules vers le bas à nouveau, retirez le supernatant, et resuspendent les cellules dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL à une concentration de 5 x 107 cellules/mL. Gardez les cellules au chaud en tenant le tube dans une main lors du transport à l’installation de poissons.
REMARQUE : Gardez toujours les cellules au chaud en stockant les cellules à l’intérieur de l’incubateur de 35,5 °C avant ou pendant l’injection des embryons.
3. Transplantation de cellules cancéreuses humaines
- Nettoyez la zone de travail à l’aide de serviettes à éthanol avant la transplantation (ciseaux, pinces à épiler, pipettes en plastique, lames de rasoir).
- Aligner les embryons dans les rainures de la plaque d’agarose à l’aide d’une pipette en plastique. Déposer les embryons sur le côté avec le face avant antérieur vers l’avant.
REMARQUE : Assurez-vous que l’eau de poisson recouvre les embryons. Mettre certains embryons de côté pour ne pas injecter de cellules cancéreuses et les utiliser comme témoins. - Allumez la source d’air et le microinjecteur. Retirez les cellules HeLa de l’incubateur et pipette les cellules de haut en bas 20-30x à l’aide d’une pointe P200. Charger 3 μL de mélange cellulaire immédiatement dans une aiguille à l’aide d’une pointe de chargement de gel avec une extrémité coupée. Insérez soigneusement la pointe vers l’extrémité inférieure pointue de l’aiguille. Si nécessaire, secouez l’aiguille pour s’assurer que le mélange cellulaire se déplace vers le bas de l’aiguille pour remplir l’extrémité pointue.
- Insérez l’aiguille dans le support de l’aiguille. Utilisez une pince à épiler pour ouvrir soigneusement le bout de l’aiguille. Ajuster la pression et la durée du temps sur le microinjecteur pour repousser toutes les bulles d’air à l’intérieur de la pointe de l’aiguille. Réduisez la durée de la pression et de la durée d’injection jusqu’à ce que la taille des gouttelettes d’injection soit de ~1 nL.
- Placez la plaque d’injection sous le microscope dans une position appropriée pour avoir le côté jaune des embryons face à l’aiguille. Anesthésier les embryons en ajoutant cinq gouttes de la solution diluée MS222 (40 μg/mL).
- Positionnez l’injecteur et laissez l’aiguille toucher la cavité périviseline de chaque embryon.
- Injecter le mélange cellulaire dans les embryons à la zone vascularisée sous la cavité périviseline en appuyant sur la pédale du pied.
- Utilisez la main non dominante pour déplacer la plaque d’injection vers l’embryon suivant. Utilisez la main dominante pour étendre et rétracter l’injecteur tout en appuyant simultanément sur la pédale de pied pour continuer l’injection. Pipette quelques gouttes d’eau de poisson stérile sur les embryons qui ont été injectés. Une fois l’injection de tous les embryons sur la plaque terminée, laver les embryons avec de l’eau de poisson stérile, les mettre sur une boîte de Pétri stérile et les déplacer immédiatement à l’incubateur de 35,5 °C.
- Après 3 h, examiner les embryons injectés et enlever les embryons morts.
- Remettre les embryons vivants à l’incubateur de 35,5 °C et les incuber pendant 20 à 24 h pour permettre aux cellules HeLa de se propager du site d’injection à d’autres parties du corps.
REMARQUE : Les embryons sont conservés dans un incubateur de 35,5 °C pour permettre la survie et la migration des cellules cancéreuses humaines parce que les cellules ne réussissent pas bien à 28,5 °C, la température des embryons de poissons sont normalement incubées.
4. Injection de nanoparticules ou de véhicules
- Anesthésiez les embryons transplantés le lendemain matin avec cinq gouttes de solution diluée MS222. Ne pas ajouter trop de MS222, car cela tuera les embryons. Sous un microscope fluorescent, ramasser soigneusement les embryons avec la métastase de la queue des cellules de RFP+ HeLa et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri avec de l’eau de poisson stérile.
- Faire les aiguilles d’injection comme décrit précédemment à la section 2 en utilisant les réglages suivants : pression à 500, chaleur à 645, traction à 60, vitesse à 50 et temps/retard à 100.
- Suivez les procédures à l’étape 3.1-3.3 pour aligner les embryons et le véhicule de chargement (p. ex., H2O) ou la solution de nanoparticule dans l’aiguille.
- Injecter 0,5 nL de solution nanoparticule de 1 mg/mL derrière l’œil et poursuivre l’injection telle que décrite aux étapes 3.5-3.6 (figure 1B). Cet emplacement derrière les yeux est enrichi de capillaires, permettant aux nanoparticules d’entrer en circulation.
- À la suite d’une procédure similaire, injectez le véhicule (p. ex., H2O) qui a été utilisé pour suspendre les nanoparticules dans les embryons dont les cellules HeLa sont transplantées et celles qui n’en ont pas (c.-à-d. les contrôles) (figure 1A, C).
- Incuber tous les embryons injectés à 35,5 °C.
5. Imagerie et suivi des nanoparticules et des cellules cancéreuses
- Examiner les embryons injectés au microscope fluorescent à 0, 30, 60, 90, 120, 180 et 210 min post-injection de nanoparticules pour surveiller leur distribution en circulation et le degré de ciblage des cellules cancéreuses. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules peut être observé dès 30 min postinjection selon le type de nanoparticule testé.
- Pipette 2-3 embryons dans une boîte de Pétri et les immobiliser en ajoutant cinq gouttes de solution diluée MS222 (40 μg/mL). Une fois que les embryons cessent de nager, retirez la majeure partie de l’eau pour permettre aux embryons de se coucher sur leurs côtés.
- Utilisez une pipette avec une brosse fine et douce attachée à son extrémité pour aligner les embryons de sorte qu’ils se trouvent sur leurs côtés avec le précédent face vers l’avant et un seul œil visible.
- Imagez les embryons en rouge, bleu et brillant canaux à faible grossissement (2x) pour capturer l’embryon entier et répéter à un grossissement plus élevé (6,4x) pour capturer la zone de la queue. Concentrez l’embryon sous le canal rouge pour éviter le saignement des nanoparticules.
REMARQUE : Les embryons ne doivent pas se déplacer pendant l’imagerie. Tout mouvement conduira à des images floues et l’incapacité de chevaucher des images de différents canaux. - Ajoutez de l’eau fraîche aux embryons immédiatement après l’imagerie et retournez-les à l’incubateur. Répétez les étapes 5.2-5.4 pour imager les embryons à différents points de temps.
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Representative Results
Le schéma du protocole de la figure 1 illustre les procédures globales de cette étude. Des poissons adultes mâles et femelles en casper transparent ont été élevés pour produire des embryons (section 1). Les cellules de RFP+ HeLa ont été injectées dans la zone vascularisée sous la cavité périviseline des embryons de poisson zèbre à 48 hpf, avec des embryons non injectés comme témoins (section 3). Pour les personnes expérimentées en microinjection, le taux de survie des embryons est souvent élevé, avec au moins 50% des embryons transplantés avec des cellules cancéreuses survivant dans l’incubateur de 35,5 °C, une température sous-optimale pour les embryons de poisson zèbre, mais nécessaire pour la survie et la migration des cellules cancéreuses humaines. Les cellules HeLa sont très invasives et peuvent s’intravaser et se propager à la région de la queue des embryons aussi rapidement que 8 h après l’injection. Par 20-24 h après la transplantation, ~50% des embryons transplantés ont montré des signes de propagation métastatique des cellules hela. Les embryons atteints de métastases de queue de cellules cancéreuses ont été sélectionnés pour des expériences en aval. À 72 hpf, ces embryons ont ensuite été injectés derrière les yeux soit avec des nanoparticules fluorescentes bleues (section 4 et figure 1B),soit uniquement avec le véhicule comme commandes (Figure 1A). Les embryons assortis à l’âge injectés avec des nanoparticules mais sans transplantation de cellules cancéreuses étaient le deuxième groupe de témoins (figure 1C). Pour obtenir des renseignements plus détaillés sur la synthèse, la préparation et la caractérisation des nanoparticules, voir Peerzade et al.18.
À 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min post-injection de nanoparticules, les embryons injectés ont été surveillés par imagerie pour déterminer l’interaction des nanoparticules avec les cellules RFP+ HeLa, en utilisant les embryons injectés par véhicule comme témoins. Plus précisément, les zones de queue de poisson zèbre où les cellules de RFP+ HeLa s’étaient propagées à étaient représentés à l’éclairage rouge, bleu et lumineux à l’aide d’un microscope fluorescent (section 5). La caractérisation détaillée de la capacité des nanoparticules ultrabright à cibler les cellules cancéreuses xénogreffes chez le poisson zèbre au fil du temps est indiquée à la figure 5 de Peerzade et al.18. Les points rouges observés dans la queue des embryons sont des cellules cancéreuses du col de l’utérus humaines métastatiques qui étaient visibles dans les embryons injectés de véhicules et de nanoparticules(figure 2A, D; Figure 3A, D). Comme prévu, aucun signal fluorescent bleu spécifique n’a été détecté chez les embryons avec l’injection réservée au véhicule (figure 2B, E). En outre, lorsque les images capturées dans les canaux rouge et bleu ont été fusionnées, seules les cellules cancéreuses rouges de la région de la queue sans signaux bleus ont été observées (Figure 2C, F). Cependant, dans les embryons qui ont été injectés avec des nanoparticules de silice fluorescente ultrabright, il y avait des points bleus dans les queues, concentrés près et autour des cellules cancéreuses à 3,5 h (figure 3B, E). Dans les images superposées capturées à partir des canaux rouges et bleus, les cellules hela rouges et les nanoparticules bleues colocalisées, considérées comme des points roses (Figure 3C, F). Dans les embryons qui ont été injectés uniquement avec des nanoparticules mais non transplantés avec des cellules HeLa, les particules fluorescentes bleues ne se sont pas concentrées dans des cellules ou des zones particulières, mais distribuées relativement uniformément dans le système circulatoire des embryons, mettant en évidence les vaisseaux sanguins (Figure 4B, E). Comme prévu, aucun signal fluorescent rouge spécifique n’a été détecté dans ces embryons malgré quelques signaux fluorescents de fond faibles (Figure 4A, C, D, F).
Ce protocole a ensuite été utilisé pour tester différents types de nanoparticules18,19,20. La colocalisation des cellules cancéreuses avec certains types de nanoparticules a été observée dès 30 min postinjection selon les propriétés de la nanoparticule testée. Par 120 min, il y avait >80% de ciblage des cellules cancéreuses par ces nanoparticules dans la région de la queue du poisson. Cependant, pour d’autres nanoparticules, le ciblage minimal des cellules cancéreuses a été observé, compatible avec leur manque de ligand cancer-spécifique. Les résultats et analyses détaillés sont inclus dans Peerzade et coll. (voir figure 3 et figure 4, chiffres supplémentaires S12-S16 et tableau supplémentaire S6)18. Ces résultats ont démontré le ciblage différentiel des nanoparticules aux cellules héla xénograftées dans le poisson zèbre. Ainsi, en utilisant ce protocole, on devrait être en mesure de sélectionner efficacement les nanoparticules en fonction de leur capacité à reconnaître et à cibler les cellules cancéreuses humaines métastatiques in vivo.
Figure 1 : Schéma de protocole pour étudier la capacité des nanoparticules à cibler les cellules cancéreuses humaines. Des embryons de casper transparents ont été générés par l’élevage de poissons adultes mâles et femelles. Des embryons fécondés ont été recueillis dans une boîte de Pétri. À 48 hpf, des cellules de RFP+ HeLa ont été injectées dans des embryons de poisson zèbre dans la cavité périviseline, laissant certains embryons correspondants à l’âge non injectés comme témoins. À 72 hpf, les embryons avec cellules métastatiques RFP+ HeLa ont été sélectionnés et divisés en deux groupes : (A) injectés avec le véhicule (H2O) comme contrôle et (B) injectés avec des nanoparticules suspendues en H2O. Le troisième groupe était celui des embryons assortis à l’âge qui ont été injectés avec des nanoparticules seulement (C). Les trois groupes ont été photographiés au microscope fluorescent. La zone en boîte indiquée est l’endroit où les images ont été capturées (voir figure 2-figure 4). Barres d’échelle pour poissons adultes = 1 mm et pour les embryons = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Poisson zèbre transplanté avec des cellules métastatiques d’HéLa sans nanoparticules. Seules les cellules héla fluorescentes rouges étaient visibles dans l’individu (A, D) ou superposées images du canal rouge et du canal bleu (C, F). Aucun signal fluorescent bleu spécifique n’a été détecté dans l’embryon avec le contrôle d’injection du véhicule (B, E). Les images de (A-C) montrent la région de queue de poisson en boîte comme à la figure 1A. Les images dans (D-F) sont des vues agrandies des zones en boîte dans (A-C). Barres d’échelle dans (A-C) = 200 μm et dans (D-F) = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Colocalisation des cellules héla fluorescentes rouges et des nanoparticules fluorescentes bleues chez le poisson zèbre. Les queues de poisson zèbre ont été photographiés à la fois à faible (A-C) et haut (D-F) grossissement dans le canal rouge et bleu. Les signaux fluorescents rouges ont révélé des cellules hela métastatiques (A, D), tandis que les signaux fluorescents bleus ont montré les nanoparticules (B, E). Les images superposées des canaux rouges et bleus (C, F) montrent la colocalisation des cellules HeLa et des nanoparticules. Les images ont été prises après 3,5 h d’injection avec des nanoparticules de silice ultrabright. Des images dans (A-C) montrent la région de queue de poisson telle qu’elle est en boîte à la figure 1B. Les images dans (D-F) sont des vues agrandies des zones en boîte dans (A-C). Barres d’échelle dans (A-C) = 100 μm et dans (D-F) = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Poisson zèbre injecté avec des nanoparticules sans cellules hela humaines. Des nanoparticules fluorescentes bleues ont été distribuées dans le système circulatoire des embryons de l’individu (B, E) et superposées des images du canal rouge et bleu (C, F). Aucune fluorescence rouge spécifique n’était visible à un grossissement faible ou élevé (A, D),à l’exception d’une fluorescence de fond commune aux embryons de poisson zèbre. Des images dans (A-C) montrent la région de queue de poisson comme en boîte dans la figure 1C. Les images dans (D-F) sont des vues agrandies des zones en boîte dans (A-C). Barres d’échelle dans (A-C) = 100 μm et dans (D-F) = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici utilise le poisson zèbre comme un système in vivo pour tester la capacité des nanoparticules à reconnaître et à cibler les cellules cancéreuses humaines métastatiques. Plusieurs facteurs peuvent avoir un impact sur l’exécution réussie des expériences. Tout d’abord, les embryons doivent être entièrement développés à 48 hpf. Le stade de développement correct des embryons leur permet de supporter et de survivre à la transplantation de cellules cancéreuses humaines. Les embryons de moins de 48 hpf ont un taux de survie significativement plus faible que les embryons plus âgés et plus développés. Deuxièmement, les cellules cancéreuses doivent être maintenues aussi saines que possible en s’assurant qu’elles sont : 1) dans la phase de croissance exponentielle21,2) fraîchement récoltées 30 min-1 h immédiatement avant la transplantation, et 3) gardées au chaud en tout temps. Troisièmement, l’aiguille ne doit pas être obstruée. Pipette les cellules HeLa de haut en bas au moins 20x avant de charger le mélange cellulaire dans l’aiguille. Quatrièmement, différents types d’aiguilles doivent être utilisés pour la transplantation de cellules cancéreuses humaines et l’injection de nanoparticules. L’aiguille pour la transplantation de cellules humaines est relativement large, avec un angle pour éviter le colmatage cellulaire, tandis que l’aiguille pour l’injection de nanoparticules est forte et mince. Cinquièmement, l’emplacement de l’injection diffère. L’emplacement pour la transplantation des cellules humaines est la cavité périviseline, mais pour l’injection de nanoparticules, l’aiguille doit être insérée derrière l’œil, où il ya des capillaires enrichis. Enfin, la compétence de la personne qui effectue la transplantation est importante. Un individu expérimenté peut injecter avec précision des cellules HeLa dans l’espace de cavité périvisitline, tandis qu’une personne inexpérimentée injecte souvent des cellules tumorales dans la zone jaune où les cellules tumorales se propagent à peine dans le corps du poisson. De même, le taux de survie des embryons est beaucoup plus élevé lorsqu’ils sont manipulés par une personne expérimentée, avec au moins 50% des embryons transplantés avec des cellules cancéreuses survivants.
Bien que les embryons de poisson zèbre soient généralement incubés à 28,5 °C, les cellules cancéreuses humaines nécessitent des températures plus élevées pour survivre et migrer22,23. Pour permettre la survie des embryons de poissons et des cellules cancéreuses humaines, les embryons transplantés avec des cellules cancéreuses humaines sont incubés à 35,5 °C à la place. Bien qu’il puisse être plus facile de livrer des cellules cancéreuses dans le sac jaune, ils se propagent à peine dans le système circulatoire. Par conséquent, il est essentiel d’injecter les cellules cancéreuses dans la zone vascularisée sous la cavité périviseline pour assurer l’intravasation et la propagation des cellules cancéreuses. En outre, il faut prendre soin de ne pas ajouter trop ou trop concentré MS222 lors de l’anesthésie des embryons pendant l’injection et l’imagerie. Pour faciliter l’imagerie et la visualisation des nanoparticules, le poisson zèbre Casper a été choisi au lieu de poissons AB. Le poisson Casper est un double mutant pour Nacre et Roy qui manque de mélanocytes et d’iridophores, ce qui entraîne une transparence accrue par rapport aux poissons AB14. La transparence du poisson zèbre Casper permet de surveiller la propagation des nanoparticules en circulation et le ciblage des nanoparticules vers les cellules cancéreuses. Le défi de ce protocole est le taux de mortalité relativement élevé des embryons si un individu non expérience effectue la transplantation de cellules cancéreuses humaines. Fait intéressant, l’injection de nanoparticules légèrement derrière les yeux est relativement bien tolérée. Ceci est probablement dû à l’utilisation d’aiguilles plus minces par rapport aux aiguilles utilisées pour la transplantation de cellules tumorales. Pour éviter d’endommager les cellules cancéreuses humaines, il faut utiliser des aiguilles avec de larges ouvertures, mais celles-ci peuvent entraîner des dommages des embryons si elles sont manipulées de manière inappropriée.
Ce protocole utilise le poisson zèbre Casper pour visualiser le ciblage des cellules cancéreuses métastatiques avec des nanoparticules fonctionnalisées in vivo. Un avantage majeur de ce test est qu’il permet aux chercheurs d’effectuer une imagerie en temps réel au cours du développement du poisson zèbre pour surveiller l’interaction des cellules cancéreuses avec des nanoparticules. En fait, en raison de sa fécondité élevée et son développement rapide, le poisson zèbre permet au chercheur d’obtenir des résultats en seulement jours afew18,19,20,24. En outre, cet essai permet également l’élimination des nanoparticules toxiques de la recherche plus poussée si la plupart des embryons meurent après injection d’un type particulier de nanoparticule. Bien que le poisson zèbre ne soit pas un mammifère, il facilite le choix d’un grand nombre de nanoparticules de manière rapide et économique, fournissant des informations utiles pour les études en aval chez les grands animaux et les essais cliniques. Pris ensemble, le poisson zèbre a un impact dans la nanomédecine et les nanotechnologies en aidant à sélectionner des nanoprobes appropriés pour la détection précoce et la destruction potentielle des cellules cancéreuses par le ciblage spécifique au cancer.
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Disclosures
I.S. déclare son intérêt dans NanoScience Solutions, LLC (bénéficiaire de la subvention STTR NIH R41AI142890). Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mme Kaylee Smith, Mme Lauren Kwok et M. Alexander Floru d’avoir relu le manuscrit. H.F. reconnaît le soutien des NIH (CA134743 et CA215059), de l’American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) et de la St. Baldrick’s Foundation. F.J.F.L. reconnaît une bourse du Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S reconnaît le soutien de la NSF (subvention CBET 1605405) et nih R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
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