Summary
وصف هنا هو وسيلة لاستخدام أجنة حمار وحشي لدراسة قدرة الجسيمات النانوية وظيفية لاستهداف الخلايا السرطانية البشرية في الجسم الحي. هذه الطريقة تسمح لتقييم واختيار الجسيمات النانوية المثلى للاختبار في المستقبل في الحيوانات الكبيرة وفي التجارب السريرية.
Abstract
إن تطوير جسيمات نانوية قادرة على اكتشاف الخلايا السرطانية واستهدافها وتدميرها أمر له أهمية كبيرة في مجال التطبيب النانوي. في نماذج الحيوانات الحية مطلوبة لسد تكنولوجيا النانو لتطبيقها الطب الحيوي. الماوس يمثل نموذج الحيوان التقليدي للاختبار قبل الفحص؛ ومع ذلك، الفئران مكلفة نسبيا للحفاظ على ولها دورات تجريبية طويلة بسبب ذرية محدودة من كل أم. وقد برز الحمار الوحشي كنظام نموذجي قوي للبحوث التنموية والطبية الحيوية، بما في ذلك أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، نظراً لشفافية بصرية وتطور سريع، أجنة حمار وحشي مناسبة تماما في الوقت الحقيقي في رصد الجسم الحي لسلوك الخلايا السرطانية وتفاعلاتها مع البيئة الدقيقة. وقد تم تطوير هذه الطريقة لإدخال الخلايا السرطانية البشرية والجسيمات النانوية الوظيفية بشكل تسلسلي في أجنة حمار وحشي شفافة من كاسبر ورصدها في التعرف على الخلايا السرطانية واستهدافها بواسطة الجسيمات النانوية في الوقت الحقيقي. ويبين هذا البروتوكول الأمثل أن الجسيمات النانوية المسماة بالفلورسنت، والتي يتم وظيفياً مع مجموعات الفولات، يمكنها أن تتعرف على وجه التحديد على الخلايا السرطانية الظهارية البشرية النقيلية البشرية المستهدفة بفلوروكروم مختلفة. يمكن أن تحدث عملية التعرف على المواد المستهدفة في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الحقن من الجسيمات النانوية التي تم اختبارها. التجربة كلها تتطلب فقط تربية بضعة أزواج من الأسماك الكبار ويستغرق أقل من 4 أيام لإكمال. وعلاوة على ذلك، تفتقر أجنة أسماك الحمار الوحشي إلى نظام مناعي متكيف وظيفي، مما يسمح بgraftmenting من مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية البشرية. ومن ثم، فإن فائدة البروتوكول الموصوف هنا تمكن من اختبار الجسيمات النانوية على أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية البشرية، مما يسهل اختيار الجسيمات النانوية المثلى في كل سياق سرطان محدد للاختبار في المستقبل في الثدييات والعيادة.
Introduction
إن تطوير الجسيمات النانوية القادرة على اكتشاف الخلايا السرطانية واستهدافها وتدميرها أمر له أهمية كبيرة لكل من علماء الفيزياء والباحثين في الطب الحيوي. أدى ظهور التطبيب النانوي إلى تطوير العديد من الجسيمات النانوية ، مثل تلك التي ترافقت مع يغاندس الاستهداف و / أو الأدوية العلاجية الكيميائية1،2،3. الخصائص المضافة للجسيمات النانوية تمكن من تفاعلها مع النظام البيولوجي، واستشعار ورصد الأحداث البيولوجية بكفاءة عالية ودقة جنبا إلى جنب مع التطبيقات العلاجية. وتستخدم الجسيمات النانوية أكسيد الذهب والحديد في المقام الأول في التصوير المقطعي المستخدم وتطبيقات التصوير بالرنين المغناطيسي، على التوالي. في حين أن الأنشطة الأنزيمية من الذهب والحديد جسيمات نانوية أكسيد يسمح الكشف عن الخلايا السرطانية من خلال المقايسات colorimetric، جسيمات نانوية الفلورسنت هي مناسبة تماما لفي تطبيقات التصوير vivo4. من بينها، الجسيمات النانوية الفلورية فائقة الوضوح مفيدة بشكل خاص، وذلك بسبب قدرتها على الكشف عن السرطانات في وقت مبكر مع جزيئات أقل والحد من السمية5.
على الرغم من هذه المزايا، تتطلب الجسيمات النانوية التجريب باستخدام نماذج الحيوانات الحية لاختيار المواد النانوية المناسبة والاستفادة المثلى من عملية التوليف. بالإضافة إلى ذلك، تماما مثل الأدوية، تعتمد الجسيمات النانوية على نماذج حيوانية للاختبار قبل الفحص لتحديد فعاليتها وسمياتها. النموذج الأكثر استخداما قبل الظهر هو الفأر، وهو الثدييات التي صيانة يأتي بتكلفة عالية نسبيا. لدراسات السرطان، أما الفئران المهندسة وراثيا أو الفئران xenografted تستخدم عادة6،7. وغالباً ما يمتد طول هذه التجارب من أسابيع إلى أشهر. على وجه الخصوص، لدراسات الانبثاث السرطانية، يتم حقن الخلايا السرطانية مباشرة في نظام الدورة الدموية للفئران في مواقع مثل الأوردة التيل والطحال8،9،10. هذه النماذج تمثل فقط المراحل النهائية من الانبثاث عندما الخلايا السرطانية البذخ واستعمار الأعضاء البعيدة. وعلاوة على ذلك، نظراً لقضايا الرؤية، فإنه من الصعب بشكل خاص رصد هجرة الخلايا السرطانية واستهداف الجسيمات النانوية للخلايا السرطانية في الفئران.
الحمار الوحشي (Danio rerio) أصبح نظام الفقاريات القوية لأبحاث السرطان بسبب برازها عالية ، منخفضة التكلفة ، التنمية السريعة ، والشفافية البصرية ، والحفاظ على الجينات11،12. ميزة أخرى للحمار الوحشي على نموذج الماوس هو تخصيب بيض السمك السابق الرحم ، والذي يسمح بمراقبة الأجنة طوال نموها. التطور الجنيني سريع في حمار وحشي، وخلال 24 ساعة postfertilization (hpf)، وقد شكلت بالفعل طائرة الجسم الفقاريات13. بواسطة 72 حصانا، يتم فقس البيض من الكورشي، والانتقال من مرحلة الجنين إلى مرحلة جمهورية يوغوسلافيا الاتحادية. الشفافية من الحمار الوحشي، وسلالة كاسبر في14على وجه الخصوص ، ويوفر فرصة فريدة لتصور هجرة الخلايا السرطانية والتعرف عليها واستهدافها من قبل الجسيمات النانوية في حي. وأخيرا، حمار وحشي تطوير جهاز المناعة الفطرية بنسبة 48 حصانا، مع نظام المناعة التكيفية متخلفة وتصبح وظيفية فقط في 28 يوما postfertilization15. هذه الفجوة الزمنية مثالية لزرع أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية البشرية في أجنة حمار وحشي دون أن تعاني من الرفض المناعي.
ويرد وصفها هنا هي الطريقة التي تستفيد من الشفافية والتطور السريع للحمار الوحشي لإثبات الاعتراف واستهداف الخلايا السرطانية البشرية من قبل الجسيمات النانوية الفلورية في الجسم الحي. في هذا الفحص، تم حقن خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (خلايا هيلا) المهندسة وراثيا للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر في منطقة الأوعية الدموية في تجويف ما حول حتمية من 48 جنينا حصانا. بعد 20-24 ساعة، خلايا هيلا قد انتشرت بالفعل في جميع أنحاء الأجنة من خلال نظام الدورة الدموية الأسماك. تم مضغ الأجنة ذات الانبثاث الظاهرة مع ~ 0.5 نانول من محلول الجسيمات النانوية خلف العين مباشرة ، حيث يقع السرير الشعري الغني. باستخدام هذه التقنية، يمكن للجسيمات النانوية السيليكا الفلورية فائقة الوضوح استهداف خلايا HeLa بسرعة 20-30 دقيقة بعد الحقن. نظرًا لبساطته وفعاليته، يمثل سمك الحمار الوحشي نموذجًا قويًا في الجسم الحي لاختبار مجموعة متنوعة من الجسيمات النانوية لقدرتها على استهداف خلايا سرطانية محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة العناية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في كلية الطب بجامعة بوسطن بموجب البروتوكول #: PROTO201800543.
1- توليد أجنة كاسبر للحمار الوحشي
- اختر أسماك كاسبر البالغة التي لا تقل عن 3 أشهر من العمر للتكاثر الطبيعي لتوليد أجنة حمار وحشي شفافة من كاسبر.
- ملء خزانات التزاوج من غرفتين مع مياه السمك في المساء، وفصل الخزانات العليا باستخدام فواصل، ووضع سمكة ذكر واحد في جانب واحد من الغرفة والأسماك الإناث واحد أو اثنين في الجانب الآخر من الغرفة، وترك الأسماك يفصل بين عشية وضحاها من قبل فواصل.
- سحب فواصل صباح اليوم التالي في الساعة 8:00 صباحا عندما تكون الأضواء على. إضافة محطات التخصيب الاصطناعي وإمالة الغرفة العليا قليلا لخلق منطقة ضحلة من المياه. السماح للأسماك لتربية لمدة 3-4 ح.
- رفع الغرف العليا من الدبابات التزاوج التي تحتوي على الأسماك وإعادتها إلى خزانات الأصلي.
- جمع البيض الموجود في القاعات السفلية عن طريق صب الماء من خلال شبكة شبكة. نقل البيض إلى طبق بيتري معقمة في كثافة لا تزيد عن 200 بيضة في الطبق الواحد. إزالة أي بيض الميت أو غير مخصّش وملء الطبق 2/3 كامل مع مياه السمك العذبة.
ملاحظة: يجب أن تكون البويضات المخصبة والصحية شفافة ومستديرة. يجب إزالة أي بيض غائم أو أبيض أو مشوه. يتم الحصول على مياه السمك من خزانات الأسماك في منشأة الأسماك. - احتضان الأجنة في الحاضنة في 28.5 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تبييض الأجنة في صباح اليوم التالي باستخدام البروتوكول القياسي كما هو موضح في كتاب حمار وحشي16، ووضع الأجنة مرة أخرى إلى الحاضنة (خطوة اختيارية).
- أخرج الأجنة 24 حصاناً من الحاضنة بعد الظهر وأبطل الأجنة باستخدام البروناس.
- إزالة أكبر قدر ممكن من ماء السمك من الأجنة في طبق بيتري وإضافة بضع قطرات من محلول البروناس (1 ملغ / مل في ماء السمك) إلى الطبق. دوامة بلطف طبق بيتري. مرة واحدة في chorions تظهر علامات التفكك، ماصة الأجنة صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر chorions لإطلاق سراح الأجنة.
- إضافة مياه السمك العذبة على الفور في طبق بيتري لإنهاء العملية مرة واحدة في غالبية الأجنة هي خارج chorions. شطف الأجنة 3x أكثر باستخدام مياه السمك لإزالة chorions العائمة. إعادة الأجنة إلى الحاضنة.
2. إعداد الخلايا السرطانية البشرية للزرع
- تعيين درجة حرارة الحاضنة إلى بالضبط 35.5 درجة مئوية. مراقبة الحاضنة لضمان ثبات وثبات الحرارة باستخدام ميزان الحرارة داخل الحاضنة.
- أوتوكلاف 1 لتر من ماء السمك في زجاجة. جعل حل agarose 3٪ عن طريق إضافة 3 غرام من الأذارو الكهربائية الصف agarose إلى 100 مل من ماء السمك وmicrowaving لصناعة السيارات حتى يتم حل agarose تماما.
- صب حل agarose الساخنة في طبق بيتري حتى يكون 3/4 كامل. ضع قالب الحقن المجهري على agarose. تأكد من أن القالب ليس على اتصال مع الجزء السفلي من طبق بيتري ولا تشكل فقاعات تحتها.
- السماح للحل لترسيخ وإزالة بعناية العفن من لوحة. املأ الطبق بماء السمك المُصفى ويخزن الطبق عند 4 درجات مئوية. قبل الدفء صفيحة agarose ومياه السمك في حاضنة 35.5 درجة مئوية قبل حصاد خلايا HeLa.
- سحب 1.0 مم O.D. x 0.78 ملم البورسليكات الزجاجي على سحب ماصة باستخدام الإعدادات التالية: الضغط في 500, الحرارة في 560, سحب في 100, سرعة في 100, والوقت / تأخير في 200. تخزين الإبر على المعجون في طبق بيتري كبيرة التي تم مسحها بمنشفة الإيثانول.
تنبيه: الإبر المسحوبة حادة جداً وهشة. توخي الحذر عند التعامل. - إعداد محلول مخزون من ثلاثي كاين ميثان سلفونات (MS222, 4 ملغ/مل) عن طريق حل MS222 في ماء السمك المذاب. دوامة جيدا قبل الاستخدام. تمييع MS222 الأسهم حل 1:100 في مياه السمك (أي، إضافة 200 ميكرولتر من MS222 حل الأسهم إلى 20 مل من مياه السمك إلى تركيز نهائي من 40 ميكروغرام / مل) ل التخدير الأجنة للإجراءات التالية.
- ثقافة hLabel خلايا HeLa عن طريق transducing لهم مع PLenti6.2_miRFP670 العدين باستخدام بروتوكولوصفها 17. حصاد RFP + خلايا HeLa 30 دقيقة 1 ساعة قبل زرع.
ملاحظة: تم استزراع خلايا HeLa البشرية في حاضنة لثقافة الأنسجة تصل إلى 70٪ التقاء في متوسط النمو الكامل (DMEM المتوسطة مع 10٪ FBS) في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.- إزالة خلية HeLa المتوسطة من قبل الطموح في غطاء لثقافة الأنسجة. شطف لفترة وجيزة طبقة الخلية مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة جميع آثار المصل.
- أضف 3.0 مل من محلول تريبسين-EDTA العقيم إلى قارورة T-75 ووضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق لتسهيل الهضم الأنزيمي. مراقبة القارورة تحت المجهر حتى ~ 80٪ من الخلايا تصبح معلقة.
- إضافة 6-8 مل من متوسطة النمو الكامل في القارورة. جمع الخلايا في أنبوب معقم 15 مل عن طريق الأنابيب بلطف. جهاز طرد مركزي عند 135 x ز لمدة 5 دقائق.
- التعرق الخلايا الهيلا عظمى و resuspend في 3 مل من متوسط النمو الكامل. كرر خطوة الغسيل أعلاه 2x. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من متوسط النمو الكامل وعد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس الهيموسيت.
- تدور الخلايا مرة أخرى، وإزالة عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في أنبوب microcentuge 1.5 مل في تركيز 5 × 107 خلايا / مل. الحفاظ على الخلايا الدافئة من خلال عقد الأنبوب في يد واحدة عند نقل إلى منشأة الأسماك.
ملاحظة: دائماً إبقاء الخلايا دافئة عن طريق تخزين الخلايا داخل حاضنة 35.5 درجة مئوية قبل أو أثناء حقن الأجنة.
3. زرع الخلايا السرطانية البشرية
- تنظيف منطقة العمل باستخدام مناشف الإيثانول قبل الزرع (على سبيل المثال، مقص، ملاقط، ماصات بلاستيكية، شفرات حلاقة).
- محاذاة الأجنة داخل الأخاغ من لوحة agarose باستخدام ماصة بلاستيكية. وضع الأجنة على الجانب مع الأمامي تواجه إلى الأمام.
ملاحظة: تأكد من أن مياه السمك تغطي الأجنة. وضع بعض الأجنة جانباً لعدم حقن الخلايا السرطانية واستخدامها كضوابط. - بدوره على مصدر الهواء وناخنة الصغرى. تأخذ خلايا HeLa من الحاضنة والماصات الخلايا صعودا وهبوطا 20-30x باستخدام تلميح P200. تحميل 3 ميكرولتر من خليط الخلايا على الفور في إبرة باستخدام هلام تحميل تلميح مع نهاية قطع. أدخل بعناية الطرف نحو نهاية أسفل حادة من الإبرة. إذا لزم الأمر، هز الإبرة لضمان تحرك خليط الخلية إلى أسفل الإبرة لملء نهاية حادة.
- أدخل الإبرة في حامل الإبرة. استخدمي ملاقط لتحطيم طرف الإبرة بعناية. ضبط الضغط ومدة الوقت على الحقن المجهري لدفع كل من فقاعات الهواء داخل طرف إبرة. تقليل الضغط ومدة الحقن حتى حجم قطرات الحقن هو ~ 1 نيولتر.
- ضع صفيحة الحقن تحت المجهر في وضع مناسب للحصول على جانب صفار الأجنة الذي يواجه الإبرة. تخدير الأجنة عن طريق إضافة خمس قطرات من محلول MS222 المخفف (40 ميكروغرام/مل).
- ضع المحاقن واسمح للإبرة بلمس تجويف ما بين الـ perivitelline لكل جنين.
- حقن خليط الخلية في الأجنة في منطقة الأوعية الدموية تحت تجويف ما بينيتيلين عن طريق الضغط على دواسة القدم.
- استخدم اليد غير الدومينية لنقل صفيحة الحقن إلى الجنين التالي. استخدام اليد المهيمنة لتمديد وتراجع عن حاقن أثناء الضغط على دواسة القدم في وقت واحد لمواصلة الحقن. مايليت بضع قطرات من مياه السمك العقيمة على الأجنة التي تم حقنها. بمجرد الانتهاء من حقن جميع الأجنة على اللوحة ، قم بغسل الأجنة بمياه السمك العقيمة ، ووضعها على طبق بيتري معقمة ونقلها على الفور إلى حاضنة 35.5 درجة مئوية.
- بعد 3 ساعات، فحص الأجنة المحقونة وإزالة تلك الميتة.
- إعادة الأجنة الحية إلى حاضنة 35.5 درجة مئوية واحتضانها لمدة 20-24 ساعة للسماح للخلايا HeLa للانتشار من موقع الحقن إلى أجزاء أخرى من الجسم.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالأجنة في حاضنة 35.5 درجة مئوية للسماح ببقاء وهجرة الخلايا السرطانية البشرية لأن الخلايا لا تُفعل بشكل جيد عند 28.5 درجة مئوية ، وعادة ما يتم احتضان أجنة الأسماك درجة الحرارة.
4. حقن الجسيمات النانوية أو السيارة
- تخدير الأجنة المزروعة في صباح اليوم التالي مع خمس قطرات من محلول MS222 المخفف. لا تضيف الكثير من MS222، لأن هذا سوف يقتل الأجنة. تحت مجهر الفلورسنت، التقط بعناية الأجنة مع الانبثاث الذيل من خلايا RFP + HeLa ووضعها في طبق بيتري جديد مع مياه السمك العقيمة.
- جعل حقن الإبر كما هو موضح سابقا في القسم 2 باستخدام الإعدادات التالية: الضغط في 500, الحرارة في 645, سحب في 60, السرعة في 50, والوقت / تأخير في 100.
- اتبع الإجراءات في الخطوات 3.1-3.3 لمحاذاة الأجنة ومركبة الحمل (على سبيل المثال H2O) أو محلول الجسيمات النانوية في الإبرة.
- حقن 0.5 نيلتر من 1 ملغ / مل حل الجسيمات النانوية وراء العين ومواصلة الحقن كما هو موضح في الخطوات 3.5-3.6(الشكل 1ب). يتم إثراء هذا الموقع وراء العينين مع الشعيرات الدموية، مما يسمح للجسيمات النانوية لدخول الدورة الدموية.
- بعد إجراء مماثل، حقن السيارة (على سبيل المثال، H2O) التي استخدمت لتعليق الجسيمات النانوية في الأجنة مع خلايا هيلا المزروعة وتلك التي لا (أي، ضوابط) (الشكل 1أ، C).
- احتضان جميع الأجنة المحقونة عند 35.5 درجة مئوية.
5. التصوير وتتبع الجسيمات النانوية والخلايا السرطانية
- فحص الأجنة المحقونة تحت مجهر الفلورسنت في 0 و30 و60 و90 و120 و180 و210 دقيقة بعد الحقن من الجسيمات النانوية لمراقبة توزيعها في الدورة الدموية ودرجة استهداف الخلايا السرطانية. يمكن ملاحظة استهداف الخلايا السرطانية بواسطة الجسيمات النانوية في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الحقن اعتمادًا على نوع الجسيمات النانوية التي تم اختبارها.
- الماصات 2-3 أجنة في طبق بيتري وشل حركتها عن طريق إضافة خمس قطرات من محلول MS222 المخفف (40 ميكروغرام/مل). بمجرد أن تتوقف الأجنة عن السباحة، قم بإزالة معظم الماء للسماح للأجنة بالاستلقاء على جوانبها.
- استخدام ماصة مع رقيقة، وفرشاة ناعمة تعلق على نهايتها لمحاذاة الأجنة بحيث أنها تقع على جوانبها مع الأمامي تواجه إلى الأمام وعين واحدة فقط مرئية.
- صور الأجنة في قنوات الأحمر والأزرق ومشرق في التكبير منخفضة (2x) لالتقاط الجنين كله وتكرار في التكبير أعلى (6.4x) لالتقاط منطقة الذيل. ركّز الجنين تحت القناة الحمراء لتجنب نزيف الجسيمات النانوية.
ملاحظة: يجب ألا تتحرك الأجنة أثناء التصوير. أي حركة سوف تؤدي إلى صور ضبابية وعدم القدرة على تداخل الصور من قنوات مختلفة. - أضف ماء السمك العذب إلى الأجنة مباشرة بعد التصوير واعيدها إلى الحاضنة. كرر الخطوات 5.2-5.4 لتصوير الأجنة في نقاط زمنية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح المخطط البروتوكولي في الشكل 1 الإجراءات الإجمالية لهذه الدراسة. وُلدت أسماك كاسبر الشفافة من الذكور والإناث لتوليد الأجنة (القسم 1). تم حقن خلايا RFP+ HeLa في المنطقة الوعائية تحت تجويف ما حولين أجنة سمك الحمار الوحشي عند 48 حصاناً، مع الأجنة غير المضمّنة كضوابط (القسم 3). بالنسبة للأفراد ذوي الخبرة في الحقن المجهري ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة في كثير من الأحيان عالية ، مع ما لا يقل عن 50 ٪ من الأجنة المزروعة مع الخلايا السرطانية على قيد الحياة في حاضنة 35.5 درجة مئوية ، ودرجة حرارة دون المستوى الأمثل لأجنة حمار وحشي ولكن المطلوبة لبقاء وهجرة الخلايا السرطانية البشرية. خلايا HeLa هي شديدة التوغل ويمكن أن تكون داخل vasate وتنتشر إلى منطقة الذيل من الأجنة بأسرع ما 8 ح بعد الحقن. من قبل 20-24 ح بعد زرع, ~ 50% من الأجنة المزروعة أظهرت علامات انتشار النقيلي من خلايا هيلا. تم اختيار تلك الأجنة التي تحتوي على أنبثاب ذيل الخلايا السرطانية لإجراء تجارب في المصب. في 72 حصانا، تم حقن هذه الأجنة في وقت لاحق وراء العينين إما مع جسيمات نانوية الفلورسنت الأزرق (القسم 4 والشكل 1B)أو فقط مع السيارة كضوابط (الشكل 1أ). وكانت الأجنة المطابقة للعمر التي تم حقنها بجسيمات نانوية ولكن دون زرع الخلايا السرطانية هي المجموعة الثانية من الضوابط (الشكل 1ج). للاطلاع على معلومات أكثر تفصيلاً عن تركيب الجسيمات النانوية وإعدادها وتوصيفاتها انظر Peerzade et al.18.
في 0، 30، 60، 90، 120، 180، 210 دقيقة بعد الحقن من الجسيمات النانوية، تم رصد الأجنة المحقونة عن طريق التصوير لتحديد تفاعل الجسيمات النانوية مع خلايا RFP + HeLa، وذلك باستخدام الأجنة التي حقنها السيارة كضوابط. على وجه التحديد، تم تصوير مناطق ذيل سمك الحمار الوحشي حيث كانت خلايا RFP+ HeLa قد انتشرت فيها باللون الأحمر والأزرق والإضاءة الزاهية باستخدام مجهر فلوري (القسم 5). ويرد في الشكل 5 من Peerzade وآخرون18توصيف مفصل لقدرة الجسيمات النانوية فائقة الوضوح على استهداف الخلايا السرطانية xenografted في حمار وحشي مع مرور الوقت. النقاط الحمراء التي شوهدت في ذيل الأجنة هي خلايا سرطان عنق الرحم البشرية النقيلي التي كانت مرئية في كل من الأجنة حقن المركبات والجسيمات النانوية(الشكل 2أ, D; الشكل 3ألف و (د) وكما هو متوقع، لم يتم الكشف عن أي إشارات فلورية زرقاء محددة في الأجنة مع الحقن في السيارة فقط(الشكل 2B, E). بالإضافة إلى ذلك، عندما تم دمج الصور التي تم التقاطها في القنوات الحمراء والزرقاء، لوحظ فقط الخلايا السرطانية الحمراء في منطقة الذيل دون أي إشارات زرقاء(الشكل 2C، F). ومع ذلك، في الأجنة التي تم حقنها مع الجسيمات النانوية السيليكا الفلورية فائقة الوضوح، كانت هناك نقاط زرقاء في ذيول، تتركز بالقرب وحول الخلايا السرطانية في 3.5 ساعة(الشكل 3B، E). في الصور المتراكبة التي تم التقاطها من كل من القنوات الحمراء والزرقاء ، خلايا HeLa الحمراء والجسيمات النانوية الزرقاء كولوككالي ، ينظر إليها على أنها نقاط وردية (الشكل 3C ، F). في تلك الأجنة التي تم حقنها فقط مع الجسيمات النانوية ولكن لم يتم زرعها مع خلايا HeLa ، لم تركز جزيئات الفلورسنت الزرقاء في أي خلايا أو مناطق معينة ، ولكنها وزعت بالتساوي نسبيًا في الدورة الدموية للأجنة ، مع تسليط الضوء على الأوعية الدموية(الشكل 4B ، E). وكما هو متوقع، لم يتم الكشف عن أي إشارات فلورية حمراء محددة في هذه الأجنة على الرغم من بعض الإشارات الفلورية الخلفية الضعيفة(الشكل 4A, C, D, F).
وقد استخدم هذا البروتوكول في وقت لاحق لاختبار أنواع مختلفة من الجسيمات النانوية18،19،20. وقد لوحظت التكلس من الخلايا السرطانية مع أنواع معينة من الجسيمات النانوية في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الحقن اعتمادا على خصائص الجسيمات النانوية اختبارها. من قبل 120 دقيقة، كان هناك > 80٪ استهداف الخلايا السرطانية من قبل هذه الجسيمات النانوية في المنطقة التيل من الأسماك. ومع ذلك ، بالنسبة للجسيمات النانوية الأخرى ، لوحظ الحد الأدنى من استهداف الخلايا السرطانية ، بما يتفق مع افتقارها إلى ليغاند خاص بالسرطان. وترد النتائج والتحليلات التفصيلية في Peerzade et al. (انظر الشكل 3 والشكل 4، الأرقام التكميلية S12-S16، والجدول التكميلي S6)18. وأظهرت هذه النتائج الاستهداف التفاضلي للجسيمات النانوية لخلايا HeLa xenografted في سمك الحمار الوحشي. وهكذا، باستخدام هذا البروتوكول، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على اختيار جسيمات نانوية بكفاءة على أساس قدرتها على التعرف على واستهداف الخلايا السرطانية البشرية النقيلي في الجسم الحي.
الشكل 1: بروتوكول التخطيطي لدراسة قدرة الجسيمات النانوية على استهداف الخلايا السرطانية البشرية. ولدت أجنة كاسبر الشفافة من خلال تربية الأسماك البالغة من الذكور والإناث. تم جمع الأجنة المخصبة في طبق بيتري. في 48 حصانا، تم حقن خلايا RFP + HeLa في أجنة سمك الحمار الوحشي في تجويف ما حول حتمية، وترك بعض الأجنة مطابقة العمر غير متطفل كضوابط. في 72 حصانا، تم اختيار الأجنة مع الخلايا RFP + هيلا النقيلي وتقسيمها إلى مجموعتين: (A) حقن مع السيارة (H2O) كتحكم و (B) حقن مع الجسيمات النانوية المعلقة في H2O. وكانت المجموعة الثالثة الأجنة المطابقة للعمر التي تم حقنها بجسيمات نانوية وحدها (C). تم تصوير المجموعات الثلاث تحت مجهر فلوري. المنطقة المُصنّعة المعروضة هي المكان الذي تم فيه التقاط الصور (انظر الشكل 2-الشكل 4). قضبان مقياس للأسماك البالغة = 1 مم والأجنة = Please click here to view a larger version of this figure. 500 ميكرومتر.
الشكل 2: حمار وحشي زرع مع خلايا هيلا النقيلي دون الجسيمات النانوية. فقط كانت خلايا HeLa الفلورية الحمراء مرئية في الفرد (A, D) أو صور متراكبة للقناة الحمراء و القناة الزرقاء (C, F). لم يتم الكشف عن إشارات الفلورسنت الزرقاء المحددة في الجنين مع التحكم في حقن السيارة (B , E). الصور في (A -C) تظهر منطقة ذيل السمكة محاصر كما هو الحال في الشكل 1A. الصور في (D-F) هي وجهات نظر موسعة من المناطق محاصر في (A-C). قضبان المقياس في (A-C) = 200 ميكرومتر وفي (D-F) = 100 ميكرومتر. Please click here to view a larger version of this figure.
الشكل 3: كولوكية خلايا HeLa الفلورية الحمراء والجسيمات النانوية الفلورية الزرقاء في سمك الحمار الوحشي. تم تصوير ذيول الحمار الوحشي في كل من منخفضة (A -C) وارتفاع (D-F) التكبير في القناة الحمراء والزرقاء. كشفت إشارات الفلورسنت الحمراء خلايا HeLa النقيلي (A, D), في حين أظهرت إشارات الفلورسنت الزرقاء الجسيمات النانوية (B, E). تظهر الصور المتراكبة من كل من القنوات الحمراء والزرقاء(C, F)حوسبة خلايا HeLa و الجسيمات النانوية. تم التقاط الصور بعد 3.5 ساعة من الحقن مع الجسيمات النانوية السيليكا فائقة الوضوح. الصور في (A-C) تظهر منطقة ذيل السمكة كما في الشكل 1B. الصور في (D-F) هي وجهات نظر موسعة من المناطق محاصر في (A-C). أشرطة مقياس في (A-C) = 100 ميكرومتر وفي (D-F) = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: حقن حمار وحشي بجسيمات نانوية بدون خلايا HeLa البشرية. تم توزيع جسيمات نانوية فلورية زرقاء في نظام الدورة الدموية للأجنة في الفرد (B , E) وصور متراكبة للقناة الحمراء والزرقاء (C, F). لم يكن هناك مضل أحمر محدد مرئي في التكبير المنخفض أو العالي(A, D)باستثناء بعض الفلورس الخلفية الشائعة في أجنة سمك الحمار الوحشي. الصور في (A -C) تظهر منطقة ذيل السمكة كما في الشكل 1C. الصور في (D-F) هي وجهات نظر موسعة من المناطق محاصر في (A-C). قضبان المقياس في (A-C) = 100 ميكرومتر وفي (D-F) = 50 ميكرومتر. Please click here to view a larger version of this figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم حمار وحشي كنظام في الجسم الحي لاختبار قدرة الجسيمات النانوية على التعرف على الخلايا السرطانية البشرية النقيلي واستهدافها. يمكن أن تؤثر عدة عوامل على التنفيذ الناجح للتجارب. أولاً، تحتاج الأجنة إلى أن تكون متطورة بالكامل عند 48 حصاناً. المرحلة التنموية الصحيحة للأجنة تمكنهم من تحمل والبقاء على قيد الحياة زرع الخلايا السرطانية البشرية. الأجنة التي تقل عن 48 حصانا ً لديها معدل نجاة أقل بكثير مقارنة بالأجنة الأكبر سناً والأكثر تطوراً. ثانياً، ينبغي الحفاظ على صحة الخلايا السرطانية قدر الإمكان من خلال ضمان أنها: 1) في مرحلة النمو الأسي21، 2) حصادها طازجًا 30 دقيقة-1 ح مباشرة قبل الزرع، و3) حافظ على الدفء في جميع الأوقات. ثالثاً، يجب ألا تسد الإبرة. الماصات خلايا HeLa صعودا وهبوطا على الأقل 20x قبل تحميل خليط الخلية في الإبرة. رابعاً، يجب استخدام أنواع مختلفة من الإبر في زراعة الخلايا السرطانية البشرية وحقن الجسيمات النانوية. إبرة لزرع الخلايا البشرية واسعة نسبيا، مع زاوية لتجنب انسداد الخلايا، في حين أن إبرة حقن الجسيمات النانوية حادة ورقيقة. خامساً، يختلف موقع الحقن. موقع زرع الخلايا البشرية هو تجويف مارفيتيلين ، ولكن بالنسبة لحقن الجسيمات النانوية ، يجب إدخال الإبرة خلف العين ، حيث توجد الشعيرات الدموية المخصبة. وأخيراً، فإن مهارة الفرد الذي يقوم بزراعة الأعضاء مهمة. يمكن للفرد من ذوي الخبرة حقن خلايا HeLa بدقة في مساحة تجويف ما بينيتين، في حين أن الشخص عديم الخبرة غالبا ما يحقن الخلايا السرطانية في منطقة الصفار حيث تنتشر الخلايا السرطانية بالكاد في جسم السمك. وبالمثل، فإن معدل بقاء الأجنة على قيد الحياة أعلى بكثير عندما يتعامل معه فرد من ذوي الخبرة، مع بقاء ما لا يقل عن 50% من الأجنة المزروعة بالخلايا السرطانية.
على الرغم من أن أجنة الحمار الوحشي عادة ما تحضن في 28.5 درجة مئوية، الخلايا السرطانية البشرية تتطلب درجات حرارة أعلى للبقاء على قيد الحياة والهجرة22،23. للسماح ببقاء كل من أجنة السمك والخلايا السرطانية البشرية، يتم احتضان الأجنة المزروعة بالخلايا السرطانية البشرية عند 35.5 درجة مئوية بدلاً من ذلك. على الرغم من أنه قد يكون من الأسهل لتسليم الخلايا السرطانية في كيس الصفار، إلا أنها بالكاد تنتشر في الدورة الدموية. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لحقن الخلايا السرطانية في منطقة الأوعية الدموية تحت تجويف ما بين الفينة لضمان الأوعية الدموية وانتشار الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، يجب على المرء أن لا تأخذ الرعاية لا لإضافة أكثر من اللازم أو أكثر تركيزا MS222 عند تخدير الأجنة أثناء الحقن والتصوير. للمساعدة في التصوير والتصور من الجسيمات النانوية، تم اختيار حمار وحشي كاسبر بدلا من الأسماك AB. الأسماك كاسبر هو متحولة مزدوجة لNacre وروي أن يفتقر الصباغيات وiridophores, مما أدى إلى زيادة الشفافية مقارنة مع الأسماك AB14. إن شفافية أسماك الحمار الوحشي في كاسبر تمكن من رصد انتشار الجسيمات النانوية في التداول واستهداف الجسيمات النانوية للخلايا السرطانية. والتحدي الذي ينطوي عليه هذا البروتوكول هو ارتفاع معدل الوفيات نسبياً في الأجنة إذا كان الفرد غير المُمَرَّب يقوم بزرع الخلايا السرطانية البشرية. ومن المثير للاهتمام، حقن الجسيمات النانوية قليلا وراء العينين نسبيا جيد التحمل. هذا هو المرجح بسبب استخدام الإبر أرق بالمقارنة مع الإبر المستخدمة في زرع الخلايا السرطانية. لتجنب تلف الخلايا السرطانية البشرية، يجب على المرء استخدام الإبر ذات الفتحات الواسعة، ولكن هذه يمكن أن تؤدي إلى تلف الأجنة إذا تم التعامل معها بشكل غير لائق.
يستخدم هذا البروتوكول حمار وحشي كاسبر لتصور استهداف الخلايا السرطانية النقيلي مع الجسيمات النانوية الوظيفية في الجسم الحي. ومن المزايا الرئيسية لهذه الأقوال أنها تسمح للباحثين بإجراء تصوير في الوقت الحقيقي على مدى تطور أسماك الحمار الوحشي لرصد تفاعل الخلايا السرطانية مع الجسيمات النانوية. في الواقع، نظرا لبرازها عالية وتطور سريع، والحمار الوحشي يسمح للباحث للحصول على النتائج في أيام فقط18،19،20،24. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الفحص أيضاً بالقضاء على الجسيمات النانوية السامة من إجراء المزيد من الأبحاث إذا كانت معظم الأجنة تموت بعد حقن نوع معين من الجسيمات النانوية. على الرغم من أن الحمار الوحشي ليس ثديي، فإنه يسهل اختيار عدد كبير من الجسيمات النانوية بطريقة سريعة واقتصادية، وتوفير معلومات مفيدة لدراسات المصب في الحيوانات الكبيرة والاختبارات السريرية. وفيما يتعلق بالحمار الوحشي معا، فإن هذا التأثير يؤثر على التطبيب النانوي وتكنولوجيا النانو من خلال المساعدة في اختيار البروتروب النانوية المناسبة للكشف المبكر والتدمير المحتمل للخلايا السرطانية من خلال الاستهداف الخاص بالسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. تعلن عن اهتمامها ب حلول NanoScience، LLC (متلقي المنحة من STTR NIH R41AI142890). ويعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون السيدة كيلي سميث، والسيدة لورين كوك، والسيد ألكسندر فلو على تدقيقها في قراءة المخطوطة. H.F. يعترف بدعم منحة من المعاهد القومية للصحة (CA134743 وCA215059)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-17-204 01-TBG)، ومؤسسة سانت بالدريك. F.J.F.L. يعترف زمالة من جامعة بوسطن مركز الابتكار BUnano التدريب عبر التخصصات في تكنولوجيا النانو للسرطان (XTNC). I.S يعترف بدعم NSF (منحة CBET 1605405) وNIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
