Summary
מתואר כאן היא שיטה לניצול עוברי דגי זברה כדי ללמוד את היכולת של חלקיקים פונקציונליים למקד תאים סרטניים אנושיים vivo. שיטה זו מאפשרת הערכה ובחירה של חלקיקים אופטימליים לניסויים עתידיים בבעלי חיים גדולים ובניסויים קליניים.
Abstract
פיתוח חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, ולהרוס תאים סרטניים הוא עניין רב בתחום של ננו-תרופות. במודלים של בעלי חיים vivo נדרשים לגישור הננוטכנולוגיה ליישום הביו-רפואי שלה. העכבר מייצג את המודל החיי המסורתי לניסויים פרה-לקלינליים; עם זאת, עכברים יקרים יחסית לשמור ויש להם מחזורים ניסיוניים ארוכים בשל צרגיות מוגבלות מכל אמא. דגי הזברה התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקר התפתחותי וביו-רפואי, כולל חקר הסרטן. בפרט, בשל השקיפות האופטית שלה והתפתחות מהירה, עוברי דגי זברה מתאימים היטב בזמן אמת בניטור vivo של ההתנהגות של תאים סרטניים והאינטראקציות שלהם עם המיקרו-סביבה שלהם. שיטה זו פותחה כדי להציג באופן רציף תאים סרטניים אנושיים וחלקיקים פונקציונליים בעוברי דגי זברה קספר שקופים ולפקח על זיהוי vivo ומיקוד של התאים הסרטניים על ידי חלקיקים בזמן אמת. פרוטוקול ממוטב זה מראה כי חלקיקים פלואורסצנטים מתויגים, אשר פונקציונליים עם קבוצות חומצה פולית, יכול במיוחד לזהות ולמכון גרורתי תאים סרטניים אפיתל צוואר הרחם מתויג עם פלואורוכרום שונה. תהליך הזיהוי והאיקוד יכול להתרחש כבר ב-30 דקות לאחר הבדיקה של החלקיקים שנבדקו. כל הניסוי דורש רק רבייה של כמה זוגות של דגים בוגרים ולוקח פחות מ-4 ימים להשלים. יתר על כן, עוברי דגי זברה חסרים מערכת חיסונית אדפטיבית פונקציונלית, המאפשרת את ההתעמלות של מגוון רחב של תאים סרטניים אנושיים. לפיכך, השירות של הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בדיקה של חלקיקים על סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים, הקלה על הבחירה של חלקיקים אופטימליים בכל הקשר סרטן ספציפי לבדיקות עתידיות ביונקים והמרפאה.
Introduction
התפתחות חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, והשמדת תאים סרטניים הוא עניין רב הן פיזיקאים וחוקרים ביו-רפואיים. הופעתו של ננו-תרופות הובילה להתפתחות של מספר חלקיקים, כגון אלה התווססו עם ליגנדים מיקוד ו / אותרופות כימותרפיות 1,,2,,3. המאפיינים הנוספים של חלקיקים מאפשרים את האינטראקציה שלהם עם המערכת הביולוגית, חישה וניטור אירועים ביולוגיים ביעילות גבוהה ודיוק יחד עם יישומים טיפוליים. חלקיקי תחמוצת זהב וברזל משמשים בעיקר בטומוגרפיה ממוחשבת ויישומי הדמיית תהודה מגנטית, בהתאמה. בעוד הפעילויות אנזימטיות של זהב וחלקיקים תחמוצת ברזל לאפשר זיהוי של תאים סרטניים באמצעות אסיאים צבע, חלקיקי פלורסנט מתאימים היטב ביישומים הדמיה vivo4. ביניהם, חלקיקי פלורסנט ultrabright מועילים במיוחד, בשל יכולתם לזהות סוגי סרטן מוקדם עם פחות חלקיקים ורעילות מופחתת5.
למרות יתרונות אלה, חלקיקים דורשים ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים vivo לבחירה של ננו חומרים מתאימים אופטימיזציה של תהליך הסינתזה. בנוסף, בדיוק כמו סמים, חלקיקים מסתמכים על מודלים של בעלי חיים לבדיקות פרה-קרטיות כדי לקבוע את היעילות שלהם ואת הרעלים. המודל הקדם-לקליני הנפוץ ביותר הוא העכבר, שהוא יונק שתחזוקה שלו מגיעה בעלות גבוהה יחסית. עבור מחקרי סרטן, או עכברים מהונדסים גנטית או עכברים xenografted משמשים בדרךכלל 6,7. אורך הניסויים הללו משתרע לעתים קרובות בין שבועות לחודשיים. בפרט, עבור מחקרי גרורות סרטן, תאים סרטניים מוזרקים ישירות לתוך מערכת הדם של העכברים במקומות כגון ורידים זנבטחול 8,9,10. מודלים אלה מייצגים רק את השלבים הסופיים של גרורות כאשר תאים סרטניים מתפשטים ליישב איברים רחוקים. יתר על כן, בשל בעיות ניראות, זה מאתגר במיוחד כדי לפקח על נדידת תאים סרטניים, פילוח nanoparticle של תאים סרטניים בעכברים.
דגי הזברה (Danio rerio) הפכו למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה לחקר הסרטן בשל הפוריות הגבוהה שלה, עלות נמוכה, התפתחות מהירה, שקיפות אופטית ושימורגנטי 11,12. יתרון נוסף של דגי הזברה על פני מודל העכבר הוא הפריה של ביצי הדגים אקס רחם, המאפשר לעוברים להיות במעקב לאורך כל התפתחותם. ההתפתחות העוברית מהירה בדגי זברה, ובתוך 24 שעות לאחר הפוריות (HPF), מטוס הגוף החוליות כבר יצר13. ב-72 כ"ס, הביצים בקעות מהצ'וריון, ועוברות מהעובר לשלב הטיגון. השקיפות של דגי הזברה, זן קספר בפרט 14, מספקת הזדמנות ייחודית לדמיין את הנדידה של תאים סרטניים ואת ההכרה שלהם ומיקוד על ידי חלקיקים בחיה חיה. לבסוף, דגי זברה לפתח את המערכת החיסונית המולדת שלהם על ידי 48 hpf, עם המערכת החיסונית אדפטיבית מפגר מאחור ורק הופך פונקציונלי ב 28 ימים לאחרפוריות 15. פער זמן זה הוא אידיאלי עבור השתלה של סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים לתוך עוברי דגי זברה מבלי לחוות דחיות חיסוניות.
מתואר כאן היא שיטה המנצלת את השקיפות וההתפתחות המהירה של דגי זברה כדי להדגים את ההכרה ואת מיקוד של תאים סרטניים אנושיים על ידי חלקיקים פלורסנט ב vivo. באסיי זה, תאים סרטניים צוואר הרחם האנושי (תאי HeLa) מהונדסים גנטית לבטא חלבון פלורסנט אדום הוזרקו לאזור כלי הדם בחלל perivitelline של 48 עוברי HPF. לאחר 20-24 שעות, תאי HeLa כבר התפשטו ברחבי העוברים דרך מערכת הדם של הדגים. עוברים עם גרורות לכאורה היו microinjected עם ~ 0.5 nL של תמיסת ננו-חלקיקים ממש מאחורי העין, שם ממוקם מיטת הנכים העשירה. באמצעות טכניקה זו, חלקיקי סיליקה פלורסנט אולטרה-ברייט יכולים למקד תאי HeLa במהירות של 20-30 דקות לאחר ההתזמה. בשל הפשטות והיעילות שלה, דגי הזברה מייצגים מודל vivo חזק כדי לבדוק מגוון רחב של חלקיקים ליכולתם למקד תאים סרטניים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון תחת הפרוטוקול #: PROTO201800543.
1. דור עוברי דגי הזברה של קספר
- בחר דג קספר בוגר כי הם לפחות 3 חודשים של גיל לרבייה טבעית כדי ליצור עוברי דגי זברה קספר שקופים.
- מלאו מיכלי הזדווגות דו-קאמריים במי דגים בערב, הפרידו את המיכלים העליונים באמצעות חוצצים, הניחתו דג זכר אחד בצד אחד של התא ודג נקבה אחד או שניים בצד השני של התא, והעזבו את הדגים מופרדים למשך הלילה על ידי חוצצים.
- תוציא את המחיצות למחרת בבוקר ב-8: 00 בבוקר כשהאורות דולקים. מוסיפים צמחי העשרה מלאכותיים ומטה מעט את התא העליון כדי ליצור אזור רדוד של מים. לאפשר לדגים להתרבות במשך 3-4 שעות.
- הרם את התאים העליונים של מיכלי ההזדווגות המכילים את הדגים והחזיר אותם לטנקים המקוריים שלהם.
- לאסוף ביצים הממוקמות בחדרים התחתון על ידי שפיכת המים דרך רשת רשת. מעבירים ביצים לצלחת פטרי סטרילית בצפיפות של לא יותר מ-200 ביצים למנה. מוציאים ביצים מתות או לא מופרות ומלאים את המנה 2/3 מלאה במים מתוקים של דגים.
הערה: ביצים מופרות ובריאות צריכות להיות שקופות ועגולות. יש להסיר את כל הביצים המעורפלות, הלבנות או מעוותות. מי דגים מתקבלים ממכלי דגים במתקן הדגים. - מדגם עוברים באינקובטור ב 28.5 מעלות צלזיוס בין לילה.
- להלבין את העוברים למחרת בבוקר באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי כמתואר בספר זברה16, ולשים את העוברים בחזרה לאקובטור (צעד אופציונלי).
- להוציא את 24 העוברים HPF מהאינקובטור אחר הצהריים ולתתיר את העוברים באמצעות פרונאז.
- מסירים כמה שיותר מי דגים מהעוברים בצלחת פטרי ומוסיפים כמה טיפות של תמיסת הפרונאז (1 מ"ג/מ"ל במים דגים) למנה. מערבבים בעדינות את צלחת הפטרי. ברגע שהכוריונים מראים סימנים של התפוררות, פיפט העוברים למעלה ו למטה כמה פעמים כדי לשבור את chorions כדי לשחרר את העוברים.
- מוסיפים מיד מי דגים טריים לצלחת פטרי כדי לסיים את התהליך ברגע שרוב העוברים יוצאים מהצ'ויריונים. לשטוף את העוברים פי 3 יותר באמצעות מי דגים כדי להסיר את chorions צף. החזר את העוברים לאקובטור.
2. הכנת תאים סרטניים אנושיים להשתלה
- הגדר את טמפרטורת האינקובטור בדיוק 35.5 °C. נטרו את האינקובטור כדי להבטיח טמפרטורה עקבית ויציבה באמצעות מדחום בתוך האינקובטור.
- Autoclave 1 L של מי דגים בבקבוק זכוכית. לעשות פתרון 3% agarose על ידי הוספת 3 גרם של agarose כיתה אלקטרופורזה כדי 100 מ"ל של מי דגים autoclaved ו microwaving עד agarose מומס לחלוטין.
- יוצקים תמיסת אגרוז חמה לצלחת פטרי עד שהיא מלאה ב-3/4. מניחים את תבנית המיקרו-ציה על ה"אגרוז". ודא כי התבנית אינה במגע עם החלק התחתון של צלחת פטרי ולא בועות טופס מתחת.
- אפשר לפתרון להתגבש ולהסיר בזהירות את התבנית מהצלחת. ממלאים את הצלחת במים משועבדים לאוטו-עבד ולאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס. לפני המלחמה צלחת agarose ומי דגים בחממה 35.5 מעלות C לפני קצירת תאי HeLa.
- משוך 1.0 מ"מ O.D. x 0.78 מ"מ borosilicate זכוכית נימים על מושך פיפטה באמצעות ההגדרות הבאות: לחץ על 500, חום ב 560, למשוך ב 100, מהירות ב 100, וזמן / עיכוב ב 200. לאחסן מחטים על דיש בצלחת פטרי גדולה כי כבר נגב עם מגבת אתנול.
התראה: מחטים משותך הן חדות מאוד ושבריריות. נקוט זהירות בעת הטיפול. - הכן פתרון מניות של tricaine methanesulfonate (MS222, 4 מ"ג/מ"ל) על-ידי המסת MS222 לתוך מי דגים autoclaved. מערבולת הרבה לפני השימוש. דילול MS222 פתרון מניות 1:100 במים דגים (כלומר, להוסיף 200 μL של פתרון מניות MS222 20 מ"ל של מי דגים לריכוז סופי של 40 μg / מ"ל) כדי להנות עוברים עבור ההליכים הבאים.
- תרבות hLabel HeLa תאים על ידי PLenti6.2_miRFP670 לנטיוירוס באמצעות הפרוטוקול המתואר17. קציר RFP + HeLa תאים 30 דקות-1 שעה לפני ההשתלה.
הערה: תאי HeLa אנושיים כבר תרבות בחממה תרבות רקמות עד 70% confluency במדיום צמיחה מלאה (DMEM בינוני עם 10% FBS) ב 37 ° C בתוספת 5% CO2.- הסר את תא HeLa בינוני על ידי שאיפה בשכונה תרבות רקמות. לשטוף בקצרה את שכבת התא עם PBS סטרילי כדי להסיר את כל העקבות של הנסיוב.
- הוסף 3.0 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA סטרילי לבקבוקון T-75 והחזר את התאים לתוך אינקובטור תרבות רקמות 37 °C במשך 3-5 דקות כדי להקל על עיכול אנזימטי. שים לב בקבוקון מתחת למיקרוסקופ עד ~ 80% של התאים להיות מושעים.
- להוסיף 6-8 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה לתוך הבקבוקון. לאסוף את התאים לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל על ידי pipetting בעדינות. צנטריפוגה ב-135 x גרם ל-5 דקות.
- לשאוף את supernatant ולתו מחדש תאי HeLa ב 3 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה. חזור על שלב הכביסה לעיל 2x. להשתמש מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה ולספור את התאים תחת המיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
- סובב את התאים שוב, הסר את supernatant, ולתחות מחדש את התאים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל בריכוז של 5 x 107 תאים / מ"ל. לשמור על התאים חמים על ידי החזקת הצינור ביד אחת בעת הובלה למתקן הדגים.
הערה: תמיד לשמור על התאים חמים על ידי אחסון התאים בתוך אינקובטור 35.5 °C לפני או במהלך הזרקת העוברים.
3. השתלת תאים סרטניים אנושיים
- נקה את אזור העבודה באמצעות מגבות אתנול לפני ההשתלה (למשל, מספריים, פינצטה, פיפטות פלסטיק, סכיני גילוח).
- ליישר עוברים בתוך החריצים של צלחת agarose באמצעות פיפטה פלסטיק. מניחים עוברים בצד עם הקדמי פונה קדימה.
הערה: ודא כי מי הדגים מכסה את העוברים. לשים כמה עוברים בצד לא להזריק תאים סרטניים ולהשתמש כפקדים. - הפעל את מקור האוויר ואת המיקרוב הזעיר. להוציא תאי HeLa מתוך האינקובטור ופיפט התאים למעלה ולרדת 20-30x באמצעות קצה P200. טען 3 μL של תערובת תא מיד לתוך מחט באמצעות קצה טעינת ג'ל עם קצה לחתוך. בזהירות הכנס את הקצה לכיוון הקצה התחתון החד של המחט. במידת הצורך, לנער את המחט כדי להבטיח את תערובת התא נע במורד המחט כדי למלא את הקצה החד.
- הכנס את המחט לתוך מחזיק המחט. השתמש בזוג פינצטה כדי לשבור בזהירות את קצה המחט. להתאים את הלחץ ואת משך הזמן על microinjector לדחוף את כל בועות האוויר בתוך קצה המחט. להפחית את הלחץ ואת זמן ההזרקה עד הגודל של טיפות הזרקה הוא ~ 1 nL.
- מניחים את צלחת ההזרקה מתחת למיקרוסקופ בתנוחה מתאימה כדי לקבל את הצד החלמון של עוברים מול המחט. להניח את העוברים על ידי הוספת חמש טיפות של פתרון MS222 מדולל (40 μg / מ"ל).
- מקם את המזרק ולאפשר למחט לגעת בחלל פריביטלין של כל עובר.
- להזריק את תערובת התא לתוך העוברים באזור כלי הדם מתחת לחלל perivitelline על ידי לחיצה על דוושת הרגל.
- השתמש ביד הלא שתלטנית כדי להעביר את צלחת ההזרקה לעובר הבא. השתמש ביד הדומיננטית כדי להרחיב ולמשוך את המזרק תוך לחיצה על דוושת כף הרגל בו זמנית כדי להמשיך את ההזרקה. פיפטה כמה טיפות של מי דגים סטריליים על עוברים שהוזרקו. לאחר השלמת הזרקת כל העוברים על הצלחת, שוטפים את העוברים עם מי דגים סטריליים, מניחים אותם על צלחת פטרי סטרילית ומעבירים אותם מיד לאקובטור של 35.5 מעלות צלזיוס.
- לאחר 3 שעות, לבדוק את העוברים המוזרקים ולהסיר את המתים.
- להחזיר את העוברים החיים 35.5 ° C אינקובטור דגירה אותם במשך 20-24 שעות כדי לאפשר לתאי HeLa להתפשט מאתר ההזרקה לחלקים אחרים של הגוף.
הערה: העוברים נשמרים ב אינקובטור 35.5 °C כדי לאפשר את ההישרדות והנדידה של תאים סרטניים אנושיים כי התאים לא עושים טוב ב 28.5 ° C, עוברי דגים טמפרטורה הם בדרך כלל דגדג.
4. הזרקת חלקיקים או רכב
- להניחות את העוברים המושתלים למחרת בבוקר עם חמש טיפות של תמיסת MS222 מדוללת. אל תוסיף יותר מדי MS222, כי זה יהרוג את העוברים. תחת מיקרוסקופ פלורסנט, בזהירות להרים עוברים עם גרורות זנב של RFP + HeLa תאים ולמקם אותם לתוך צלחת פטרי חדש עם מי דגים סטריליים.
- הפוך את מחטי ההזרקה כפי שתואר קודם לכן בסעיף 2 באמצעות ההגדרות הבאות: לחץ ב 500, חום ב 645, למשוך ב 60, מהירות ב 50, וזמן / עיכוב ב 100.
- בצע את ההליכים בשלבים 3.1-3.3 כדי ליישר עוברים ולהעמיס רכב (למשל, H 2 O) או פתרון nanoparticleלתוךהמחט.
- להזריק 0.5 nL של 1 תמיסת ננו-חלקיקים מ"ג/מ"ל מאחורי העין ולהמשיך את ההזרקה כמתואר בשלבים 3.5-3.6(איור 1B). מיקום זה מאחורי העיניים מועשר בנימים, המאפשר לחלקיקים להיכנס למחזור הדם.
- לאחר הליך דומה, להזריק את הרכב (למשל, H2O) ששימש להשעיית החלקיקים לתוך עוברים עם תאי HeLa מושתלים ואלה ללא (כלומר, פקדים)(איור 1א, ג).
- דגירה כל העוברים מוזרקים ב 35.5 ° C.
5. הדמיה ומעקב אחר חלקיקים ותאים סרטניים
- לבחון עוברים מוזרקים תחת מיקרוסקופ פלורסנט ב 0, 30, 60, 90, 120, 180, ו 210 דקות postinjection של חלקיקים כדי לפקח על התפלגותם במחזור ואת מידת פילוח תאים סרטניים. מיקוד של תאים סרטניים על ידי חלקיקים ניתן לצפות כבר 30 דקות postinjection בהתאם לסוג של ננו חלקיקים נבדק.
- פיפט 2-3 עוברים לתוך צלחת פטרי ולשתק אותם על ידי הוספת חמש טיפות של פתרון MS222 מדולל (40 μg / מ"ל). ברגע שהעוברים מפסיקים לשחות, הסירו את רוב המים כדי לאפשר לעוברים לשכב על צדיהם.
- השתמשו בפיפטה עם מברשת דקה ורכה המחוברת לקצה כדי ליישר את העוברים כך שהם שוכבים על צדיהם עם הפנים הקדמיות קדימה ורק עין אחת נראית לעין.
- תדמינו את העוברים בערוצי אדום, כחול ובהירפילד בהגדלה נמוכה (2x) כדי ללכוד את העובר כולו ולחזור על ההגדלה הגבוהה יותר (6.4x) כדי ללכוד את אזור הזנב. למקד את העובר מתחת לערוץ האדום כדי למנוע דימום של חלקיקים.
הערה: העוברים אינם יכולים לזוז במהלך ההדמיה. כל תנועה תוביל לתמונות מטושטשות ול חוסר היכולת לחפוף תמונות מערוצים שונים. - מוסיפים מי דגים טריים לעוברים מיד לאחר ההדמיה ומחזירים אותם לאקובטור. חזור על שלבים 5.2-5.4 כדי למצוא את העוברים בנקודות זמן שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשימים של הפרוטוקול באות 1 ממחישים את הנהלים הכוללים של מחקר זה. דגים בוגרים זכרים ונקביים שקופים גודלו כדי ליצור עוברים (סעיף 1). תאי RFP+ HeLa הוזרקו לאזור כלי הדם תחת חלל פריביטלין של עוברי דגי הזברה ב 48 hpf, עם עוברים לא מקוצרים כפקדים (סעיף 3). עבור אנשים מנוסים microinjection, שיעור ההישרדות של עוברים הוא לעתים קרובות גבוה, עם לפחות 50% של עוברים מושתלים עם תאים סרטניים ששרדו 35.5 ° C אינקובטור, טמפרטורה תת אופטימלית עבור עוברי דגי זברה אבל נדרש להישרדות והגירה של תאים סרטניים אנושיים. תאי HeLa הם פולשניים מאוד יכולים לעבור להתפשט להתפשט לאזור הזנב של העוברים במהירות של 8 שעות לאחר ההתחזות. על ידי 20-24 שעות לאחר ההשתלה, ~ 50% של העוברים מושתלים הראו סימנים של התפשטות גרורתית של תאי HeLa. העוברים האלה עם גרורות זנב תא סרטניים נבחרו לניסויים במורד הזרם. ב 72 hpf, עוברים אלה הוזרקו לאחר מכן מאחורי העיניים או עם חלקיקי פלורסנט כחול (סעיף 4 ואיור 1ב') או אך ורק עם הרכב כפקדים(איור 1א'). עוברים תואמי גיל מוזרקים עם חלקיקים אבל ללא השתלת תאים סרטניים היו הקבוצה השנייה של פקדים (איור 1C). לקבלת מידע מפורט יותר על סינתזה ננו-חלקיקים, הכנה, ואפיון ראה Peerzade ואח'18.
ב 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 דקות postinjection של חלקיקים, העוברים המוזרקים היו במעקב על ידי הדמיה כדי לקבוע את האינטראקציה של חלקיקים עם RFP + HeLa תאים, באמצעות העוברים מוזרק הרכב כפקדים. באופן ספציפי, אזורי זנב דגי הזברה שבהם התפשטו תאי RFP+ HeLa תמונה באדום, כחול, ותאורת brightfield באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (סעיף 5). האפיון המפורט של היכולת של חלקיקים אולטרה-ברייטיים למקד תאים סרטניים xenografted בדגי זברה לאורך זמן מוצג איור 5 של Peerzade ואח'. הנקודות האדומות הנראות בזנב העוברים הן תאים סרטניים גרורתיים של סרטן צוואר הרחם, שנראו הן בעוברים שהזריקו כלי רכב והן בעוברים המוזרקים על ידיננו-חלקיקים( איור 2א', ד'; איור 3א', ד). כצפוי, לא זוהו אותות פלורסנט כחולים ספציפיים בעוברים עם הזרקת רכב בלבד(איור 2ב', ה). בנוסף, כאשר התמונות שצולמו בערוצים האדומים והכחולים מוזגו, רק תאים סרטניים אדומים באזור הזנב ללא אותות כחולים נצפו(איור 2C, F). עם זאת, בעוברים שהוזרקו עם חלקיקי סיליקה פלורסנט אולטרה-ברייט, היו נקודות כחולות בזנבות, מרוכזות ליד וסביב התאים הסרטניים ב-3.5 שעות(איור 3ב', ה). בתמונות המקופלות שצולמו הן בערוצים אדומים והן בכחולים, תאי HeLa אדומים וחלקיקים כחולים מקוטעים, הנתפסים כנקודות ורודות(איור 3ג', F). בעוברים שהוזרקו אך ורק עם חלקיקים אך לא הושתלו בתאי HeLa, חלקיקי הפלואורסצנט הכחולים לא התרכזו בתאים או אזורים מסוימים, אלא הופצו באופן שווה יחסית למערכת הדם של העוברים,תוך הדגשת כלי דם (איור 4ב', ה). כצפוי, לא זוהו אותות פלורסנט אדומים ספציפיים בעוברים אלה למרות כמה אותות פלואורסצנט רקע חלשים(איור 4A, C, D, F).
פרוטוקול זה שימש לאחר מכן כדי לבדוק סוגים שונים שלחלקיקים 18,19,20. Colocalization של תאים סרטניים עם סוגים מסוימים של חלקיקים נצפו כבר 30 דקות postinjection בהתאם המאפיינים של הננו-חלקיקים נבדק. על ידי 120 דקות, היה >80% מיקוד של תאים סרטניים על ידי חלקיקים אלה באזור הזנב של הדג. עם זאת, עבור חלקיקים אחרים, פילוח מינימלי של תאים סרטניים נצפתה, עולה בקנה אחד עם חוסר שלהם ליגנד ספציפי לסרטן. התוצאות המפורטות והניתוח נכללים ב- Peerzade ואח ' (ראה איור 3 ואיור 4, נתונים משלימים S12-S16 וטבלה משלימה S6)18. תוצאות אלה הדגימו פילוח דיפרנציאלי של חלקיקים לתאי HeLa xenografted בדגי זברה. לכן, באמצעות פרוטוקול זה, אחד צריך להיות מסוגל לבחור ביעילות חלקיקים בהתבסס על יכולתם לזהות ולכוון תאים סרטניים אנושיים גרורתיים ב vivo.
איור 1: סכמטי פרוטוקול לחקר היכולת של חלקיקים למקד תאים סרטניים אנושיים. עוברי קספר שקופים נוצרו באמצעות גידול דגים בוגרים זכרים ונקביים. עוברים מופרות נאספו בצלחת פטרי. ב 48 hpf, RFP + HeLa תאים הוזרקו לתוך עוברי דגי זברה בחלל perivitelline, עוזב כמה עוברים תואמי גיל לא מקוצרים כמו פקדים. ב 72 hpf, עוברים עם גרורות RFP + HeLa תאים נבחרו ופוצלו לשתי קבוצות: (א) מוזרק עם רכב (H2O) כשליטה ו -(ב)מוזרק עם חלקיקים תלויים H2O. הקבוצה השלישית הייתה עוברים תואמי גיל שהוזרקו עם חלקיקים בלבד (C). כל שלוש הקבוצות תדמיינו תחת מיקרוסקופ פלורסנט. האזור התיבה המוצג הוא המקום שבו צולמו תמונות (ראה איור 2 איור 4). קנה מידה ברים עבור דגים בוגרים = 1 מ"מ עבור עוברים = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דגי זברה מושתלים בתאי HeLa גרורתיים ללא חלקיקים. רק תאי HeLa פלואורסצנטיים אדומים נראו באדם (A, D) או תמונות מכוסות של הערוץ האדום והערוץ הכחול(C, F). בעובר לא זוהו אותות פלואורסצנט כחולים ספציפיים עם בקרת הזרקת רכב (B, E). תמונות ב (A-C) מציגות את אזור זנב הדגים בקופסה כמו איור 1A. תמונות ב (D-F) הן תצוגות מוגדלות של האזורים בקופסה ב (A-C). קנה מידה ברים ב (A-C) = 200 μm ו - (D-F) = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: קולוקליזציה של תאי HeLa פלורסנט אדום וחלקיקים פלואורסצנט כחולים בדגי זברה. זנבות זברה היו בתמונה הן נמוך (A-C) ו גבוה(D-F)הגדלה בערוץ אדום וכחול. אותות פלורסנט אדומים חשפו תאי HeLa גרורתיים (A, D), בעוד אותות פלורסנט כחולים הראו את החלקיקים (B, E). התמונות הציפוי הן מערוצים אדומים וכחולים(C, F)להראות colocalization של תאי HeLa וחלקיקים. התמונות צולמו לאחר 3.5 שעות מהזרקה עם חלקיקי סיליקה אולטרה-ברייטיים. תמונות ב (A-C) מציגות את אזור זנב הדגים כפי שנבעק באות 1B. תמונות ב (D-F) הן תצוגות מוגדלות של האזורים בקופסה ב (A-C). קנה מידה של פסים ב (A-C) = 100 μm ו - (D-F) = 50 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דגי זברה מוזרקים עם חלקיקים ללא תאי HeLa אנושיים. חלקיקי פלואורסצנט כחולים הופצו למערכת הדם של העוברים באדם (B, E) ותמונות מכוסות של הערוץ האדום והכחול(C, F). לא היה פלואורסצנציה אדומה ספציפית בהגדלה נמוכה או גבוהה (A, D) למעט פלואורסצסצנציה ברקע המשותפת לעוברי דגי זברה. תמונות ב (A-C) מציגות את אזור זנב הדגים כפי שנבדק באות 1C. תמונות ב (D-F) הן תצוגות מוגדלות של האזורים בקופסה ב (A-C). קנה מידה ברים ב (A-C) = 100 μm ו - (D-F) = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את דגי הזברה כמערכת vivo כדי לבדוק את היכולת של חלקיקים לזהות ולכוון תאים סרטניים אנושיים גרורתיים. מספר גורמים יכולים להשפיע על ביצוע מוצלח של הניסויים. ראשית, עוברים צריכים להיות מפותחים במלואם ב 48 hpf. השלב ההתפתחותי הנכון של העוברים מאפשר להם לסבול ולשרוד את ההשתלה של תאים סרטניים אנושיים. לעוברים מתחת לגיל 48 כ"ס יש שיעור הישרדות נמוך משמעותית בהשוואה לעוברים ישנים ומפותחים יותר. שנית, תאים סרטניים צריכים להישמר בריאים ככל האפשר על ידי הבטחת שהם: 1) בשלב הצמיחה אקספוננציאלי21, 2) שנקטפו טרי 30 דקות-1 שעות מיד לפני ההשתלה, ו 3) שמר חם בכל עת. שלישית, אסור לסתום את המחט. פיפטה תאי HeLa למעלה ומטה לפחות 20x לפני טעינת תערובת התא לתוך המחט. רביעית, סוגים שונים של מחטים חייב לשמש להשתלה של תאים סרטניים אנושיים והזרקת חלקיקים. המחט להשתלת תאים אנושיים היא רחבה יחסית, עם זווית כדי למנוע סתימה תא, ואילו המחט להזרקת ננו-חלקיקים היא חדה ורזה. חמישית, מיקום הזריקה שונה. המיקום להשתלה של תאים אנושיים הוא חלל perivitelline, אבל עבור הזרקת ננוחלקיקים, המחט צריכה להיות מוכנסת מאחורי העין, שם יש נימים מועשרים. לבסוף, המיומנות של האדם שמבצע השתלות חשובה. אדם מנוסה יכול להזריק במדויק תאי HeLa לחלל חלל perivitelline, בעוד אדם חסר ניסיון לעתים קרובות מזריק תאים סרטניים לאזור חלמון שבו תאים סרטניים בקושי להתפשט לתוך גוף הדג. באופן דומה, שיעור ההישרדות של העוברים הוא הרבה יותר גבוה כאשר מטופלים על ידי אדם מנוסה, עם לפחות 50% של עוברים מושתלים עם תאים סרטניים ששרדו.
למרות עוברי דגי זברה הם בדרך כלל דגירה ב 28.5 ° C, תאים סרטניים אנושיים דורשים טמפרטורות גבוהות יותר כדילשרוד ולנודד 22,23. כדי לאפשר את ההישרדות של שני עוברי דגים ותאים סרטניים אנושיים, העוברים המושתלים עם תאים סרטניים אנושיים מדגירה ב 35.5 ° C במקום. למרות שזה יכול להיות קל יותר לספק תאים סרטניים לתוך שאק החלמון, הם בקושי התפשטו לתוך מערכת הדם. לכן, זה קריטי להזריק את התאים הסרטניים לאזור כלי הדם תחת חלל perivitelline כדי להבטיח התפשטות והתפשטות של תאים סרטניים. בנוסף, יש לדאוג לא להוסיף יותר מדי או מרוכז מדי MS222 בעת ההרמה העוברים במהלך הזרקה והדמיה. כדי לסייע בהדמיה והדמיה של חלקיקים, דגי הזברה של קספר נבחרו במקום דגי AB. דג קספר הוא מוטנט כפול עבור נאקרה ורוי, שחסרים לו מלנוציטים ואירידופורים, וכתוצאה מכך שקיפות מוגברת בהשוואה לדג AB14. השקיפות של דגי הזברה קספר מאפשרת ניטור התפשטות חלקיקים במחזור ומיקוד של החלקיקים לתאים סרטניים. האתגר של פרוטוקול זה הוא שיעור התמותה הגבוה יחסית של העוברים אם אדם חסר ניסיון מבצע את ההשתלה של תאים סרטניים אנושיים. מעניין, הזרקת חלקיקים מעט מאחורי העיניים הוא נסבל היטב יחסית. זה כנראה בשל השימוש במחטים דק יותר בהשוואה למחטים המשמשים להשתלת תאים סרטניים. כדי למנוע פגיעה בתאים סרטניים אנושיים, יש להשתמש במחטים עם פתחים רחבים, אבל אלה יכולים להוביל לנזק של העוברים אם מטופלים בצורה בלתי הולמת.
פרוטוקול זה מנצל את דגי הזברה קספר כדי לדמיין מיקוד של תאים סרטניים גרורתיים עם חלקיקים פונקציונליים ב vivo. היתרון העיקרי של תסיסה זו היא כי היא מאפשרת לחוקרים לבצע הדמיה בזמן אמת במהלך פיתוח דגי זברה כדי לפקח על האינטראקציה של תאים סרטניים עם חלקיקים. למעשה, בשל הפוריות הגבוהה וההתפתחות המהירה שלה, דגי הזברה מאפשרים לחוקר להשיג תוצאות רק כמה ימים18,19,20,24. יתר על כן, הודעה זו גם מאפשרת חיסול של חלקיקים רעילים ממחקר נוסף אם רוב העוברים למות לאחר הזרקה של סוג מסוים של ננו. למרות דגי הזברה אינו יונק, זה מקל על הבחירה של מספר גדול של חלקיקים באופן מהיר וחסכוני, מתן מידע שימושי למחקרים במורד הזרם בבעלי חיים גדולים ובדיקות קליניות. יחד, דגי הזברה עושה השפעה ננו-תרופות וננוטכנולוגיה על ידי סיוע בבחירת גשושי ננו מתאימים לגילוי מוקדם והרס פוטנציאלי של תאים סרטניים באמצעות פילוח ספציפי לסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. מכריזה על עניין בפתרונות NanoScience, LLC (מקבל STTR NIH R41AI142890 מענק). כל שאר המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים לגב' קיילי סמית' לורן קווק ולמר אלכסנדר פלורו על הגהת כתב היד. H.F. מכירה בתמיכת מענקים של ה-NIH (CA134743 ו-CA215059), האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-17-204 01-TBG) וקרן סנט בולדריק. F.J.F.L. מכיר במחווה ממרכז החדשנות של אוניברסיטת בוסטון-BUnano הכשרה חוצת משמעת בננוטכנולוגיה לסרטן (XTNC). I.S מאשרת תמיכה ב-NSF (מענק CBET 1605405) ו-NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
