Summary
Hier wird eine Methode beschrieben, mit der Zebrafischembryonen verwendet werden können, um die Fähigkeit funktionalisierter Nanopartikel zu untersuchen, menschliche Krebszellen in vivo anzugreifen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung und Auswahl optimaler Nanopartikel für zukünftige Tests bei Großen Tieren und in klinischen Studien.
Abstract
Die Entwicklung von Nanopartikeln, die Krebszellen erkennen, gezielt angreifen und zerstören können, ist auf dem Gebiet der Nanomedizin von großem Interesse. In vivo Tiermodelle sind erforderlich, um die Nanotechnologie mit ihrer biomedizinischen Anwendung zu überbrücken. Die Maus stellt das traditionelle Tiermodell für präklinische Tests dar; Mäuse sind jedoch relativ teuer zu halten und haben lange experimentelle Zyklen aufgrund der begrenzten Nachkommenschaft von jeder Mutter. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Entwicklungs- und Biomedizinische Forschung, einschließlich der Krebsforschung, entwickelt. Insbesondere aufgrund seiner optischen Transparenz und schnellen Entwicklung eignen sich Zebrafischembryonen gut für die Echtzeit-In-vivo-Überwachung des Verhaltens von Krebszellen und ihrer Wechselwirkungen mit ihrer Mikroumgebung. Diese Methode wurde entwickelt, um menschliche Krebszellen und funktionalisierte Nanopartikel sequenziell in transparente Casper-Zebrafisch-Embryonen einzuführen und die In-vivo-Erkennung und -Targeting der Krebszellen durch Nanopartikel in Echtzeit zu überwachen. Dieses optimierte Protokoll zeigt, dass fluoreszierend markierte Nanopartikel, die mit Folatgruppen funktionalisiert sind, metastasierende menschliche Gebärmutterhalsepithelkrebszellen, die mit einem anderen Fluorchrom gekennzeichnet sind, gezielt erkennen und zielen können. Der Erkennungs- und Targeting-Prozess kann bereits nach 30 min Nachinjektion der getesteten Nanopartikel erfolgen. Das ganze Experiment erfordert nur die Zucht von ein paar Paar enerwachsener Fische und dauert weniger als 4 Tage. Darüber hinaus fehlt Zebrafischembryonen ein funktionelles adaptives Immunsystem, das die Transplantation einer Vielzahl menschlicher Krebszellen ermöglicht. Daher ermöglicht der Nutzen des hier beschriebenen Protokolls die Erprobung von Nanopartikeln an verschiedenen Arten menschlicher Krebszellen, was die Auswahl optimaler Nanopartikel in jedem spezifischen Krebskontext für zukünftige Tests an Säugetieren und der Klinik erleichtert.
Introduction
Die Entwicklung von Nanopartikeln, die in der Lage sind, Krebszellen zu erkennen, gezielt zu zielen und zu zerstören, ist sowohl für Physiker als auch für biomedizinische Forscher von großem Interesse. Die Entstehung der Nanomedizin führte zur Entwicklung mehrerer Nanopartikel, z. B. solcher, die mit Zielliganden und/oder Chemotherapeutika1,2,3konjugiert wurden. Die zusätzlichen Eigenschaften von Nanopartikeln ermöglichen ihre Interaktion mit dem biologischen System, die Erfassung und Überwachung biologischer Ereignisse mit hoher Effizienz und Genauigkeit zusammen mit therapeutischen Anwendungen. Gold- und Eisenoxid-Nanopartikel werden hauptsächlich in DerComputertomographie bzw. Magnetresonanztomographie eingesetzt. Während die enzymatischen Aktivitäten von Gold- und Eisenoxid-Nanopartikeln den Nachweis von Krebszellen durch farbmetrische Assays ermöglichen, eignen sich fluoreszierende Nanopartikel gut für in vivo-Bildgebungsanwendungen4. Unter ihnen sind ultrahelle fluoreszierende Nanopartikel besonders vorteilhaft, da sie Krebs früh mit weniger Partikeln und reduzierter Toxizität erkennen können5.
Trotz dieser Vorteile müssen Nanopartikel mit in vivo Tiermodellen zur Auswahl geeigneter Nanomaterialien und zur Optimierung des Syntheseprozesses experimentiert werden. Darüber hinaus verlassen sich Nanopartikel, genau wie Medikamente, auf Tiermodelle für präklinische Tests, um ihre Wirksamkeit und Toxizität zu bestimmen. Das am weitesten verbreitete präklinische Modell ist die Maus, ein Säugetier, dessen Unterhalt relativ teuer ist. Für Krebsstudien werden in der Regel gentechnisch veränderte Mäuse oder xenografierte Mäuse in der Regel6,7verwendet. Die Dauer dieser Experimente erstreckt sich oft von Wochen bis Monaten. Insbesondere für Krebsmetastasenstudien werden Krebszellen direkt in das Kreislaufsystem der Mäuse an Orten wie Schwanzvenen und Milz8,,9,10injiziert. Diese Modelle stellen nur die Endstadien der Metastasierung dar, wenn Tumorzellen entfernte Organe extravasieren und besiedeln. Darüber hinaus ist es aufgrund von Sichtbarkeitsproblemen besonders schwierig, die Tumorzellmigration und das Nanopartikel-Targeting von Tumorzellen bei Mäusen zu überwachen.
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem leistungsfähigen Wirbeltiersystem für die Krebsforschung aufgrund seiner hohen Fruchtbarkeit, niedrigen Kosten, schnelle Entwicklung, optische Transparenz und genetische Konservierung11,12. Ein weiterer Vorteil des Zebrafisches gegenüber dem Mausmodell ist die Befruchtung der Fischeier ex utero, wodurch die Embryonen während ihrer entwicklung überwacht werden können. Die embryonale Entwicklung ist bei Zebrafischen schnell, und innerhalb von 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) hat sich die Wirbeltierkörperebene bereits13gebildet. Bei 72 hpf werden die Eier aus dem Chorgezelt geschlüpft und gehen vom embryonalen zum Bratenstadium über. Die Transparenz des Zebrafisches, insbesondere des Casper-Stamms 14, bietet eine einzigartige Gelegenheit, die Migration von Krebszellen und deren Erkennung und Ausrichtung durch Nanopartikel bei einem lebenden Tier zu visualisieren. Schließlich entwickeln Zebrafische ihr angeborenes Immunsystem um 48 hpf, wobei das adaptive Immunsystem hinterherhinkt und erst nach 28 Tagen nach der Befruchtung15funktionsfähig wird. Diese Zeitlücke ist ideal für die Transplantation verschiedener Arten menschlicher Krebszellen in Zebrafischembryonen ohne Immunabstoßung.
Hier wird eine Methode beschrieben, die die Transparenz und schnelle Entwicklung von Zebrafischen nutzt, um die Erkennung und Ausrichtung menschlicher Krebszellen durch fluoreszierende Nanopartikel in vivo zu demonstrieren. In diesem Test wurden menschliche Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen), die gentechnisch verändert wurden, um ein rotes fluoreszierendes Protein auszudrücken, in den vaskularisierten Bereich in der Perivitellinehöhle von 48-hpf-Embryonen injiziert. Nach 20-24 h hatten sich die HeLa-Zellen bereits über das Fischkreislaufsystem in den Embryonen ausgebreitet. Embryonen mit scheinbarer Metastasierung wurden mit 0,5 nL einer Nanopartikellösung direkt hinter dem Auge mikroinjiziert, wo sich das reichhaltige Kapillarbett befindet. Mit dieser Technik können die ultrahellen fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikel bis nach der Injektion von 20-30 min auf HeLa-Zellen abzielen. Aufgrund seiner Einfachheit und Wirksamkeit stellt der Zebrafisch ein robustes In-vivo-Modell dar, um eine Vielzahl von Nanopartikeln auf ihre Fähigkeit zu testen, bestimmte Krebszellen anzusprechen.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Boston University School of Medicine gemäß dem Protokoll PROTO201800543 genehmigt.
1. Erzeugung von Casper Zebrafisch-Embryonen
- Wählen Sie erwachsene Casper-Fische, die mindestens 3 Monate alt sind, um eine natürliche Zucht zu erzeugen, um transparente Casper-Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen. Casper
- Füllen Sie am Abend zweikammerige Paarungsbecken mit Fischwasser, trennen Sie die oberen Becken mit Trennwänden, legen Sie einen männlichen Fisch in eine Seite der Kammer und ein oder zwei weibliche Fische in die andere Seite der Kammer und lassen Sie die Fische über Nacht durch Trennwände getrennt.
- Ziehen Sie die Trennwände am nächsten Morgen um 8:00 Uhr heraus, wenn die Lichter an sind. Fügen Sie künstliche Anreicherungsanlagen hinzu und neigen Sie die obere Kammer leicht, um eine flache Wasserfläche zu schaffen. Lassen Sie den Fisch für 3-4 h züchten.
- Heben Sie die oberen Kammern der Paarungstanks an, in denen sich die Fische befinden, und bringen Sie sie in ihre ursprünglichen Tanks zurück.
- Sammeln Sie Eier in den unteren Kammern, indem Sie das Wasser durch ein Netz gießen. Eier in eine sterile Petrischale mit einer Dichte von nicht mehr als 200 Eiern pro Schale übertragen. Entfernen Sie alle toten oder unbefruchteten Eier und füllen Sie die Schale 2/3 voll mit frischem Fischwasser.
HINWEIS: Befruchtete und gesunde Eier sollten durchscheinend und rund sein. Alle Eier, die trüb, weiß oder entstellt sind, sollten entfernt werden. Fischwasser wird aus Fischtanks in der Fischanlage gewonnen. - Inkubieren Sie Embryonen im Inkubator bei 28,5 °C über Nacht.
- Bleichen Sie die Embryonen am nächsten Morgen mit dem Standardprotokoll, wie in The Zebrafish Book16beschrieben, und legen Sie die Embryonen zurück in den Brutkasten (optionaler Schritt).
- Nehmen Sie die 24 hpf Embryonen am Nachmittag aus dem Brutkasten und dechorionate die Embryonen mit Pronase.
- Entfernen Sie so viel Fischwasser wie möglich aus den Embryonen in der Petrischale und fügen Sie ein paar Tropfen der Pronaselösung (1 mg/ml in Fischwasser) in die Schale. Die Petrischale sanft wirbeln. Sobald die Krähen Anzeichen von Zerfall zeigen, pipette die Embryonen ein paar Mal auf und ab, um die Krähen zu brechen, um die Embryonen freizusetzen.
- Fügen Sie frisches Fischwasser sofort in die Petrischale, um den Prozess zu beenden, sobald ein Großteil der Embryonen aus den Kränzen sind. Spülen Sie die Embryonen 3x mehr mit Fischwasser, um die schwimmenden Krähen zu entfernen. Bringen Sie die Embryonen in den Inkubator zurück.
2. Vorbereitung menschlicher Krebszellen zur Transplantation
- Stellen Sie die Inkubatortemperatur auf genau 35,5 °C ein. Überwachen Sie den Inkubator, um eine konsistente und stabile Temperatur mit einem Thermometer im Inneren des Inkubators zu gewährleisten.
- Autoklav 1 L Fischwasser in einer Glasflasche. Machen Sie eine 3% Agarose-Lösung, indem Sie 3 g Elektrophorese-Grade-Agarose zu 100 ml autoklaviertem Fischwasser und Mikrowaving hinzufügen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
- Gießen Sie heiße Agarose-Lösung in eine Petrischale, bis sie 3/4 voll ist. Legen Sie die Mikrospritzform auf die Agarose. Stellen Sie sicher, dass die Form nicht in Kontakt mit dem Boden der Petrischale ist und sich keine Blasen darunter bilden.
- Lassen Sie die Lösung erstarren und entfernen Sie vorsichtig die Form von der Platte. Füllen Sie die Platte mit autoklaviertem Fischwasser und lagern Sie die Platte bei 4 °C. Die Agaroseplatte und das Fischwasser im 35,5 °C-Inkubator vorderwärmen, bevor heLa-Zellen geerntet werden.
- Ziehen Sie 1,0 mm O.D. x 0,78 mm Borosilikatglaskapillaren auf einen Pipettenzieher mit den folgenden Einstellungen: Druck bei 500, Hitze bei 560, Zug bei 100, Geschwindigkeit bei 100 und Zeit/Verzögerung bei 200. Bewahren Sie Nadeln auf dem Putte in einer großen Petrischale auf, die mit einem Ethanoltuch abgewischt wurde.
VORSICHT: Gezogene Nadeln sind sehr scharf und zerbrechlich. Seien Sie vorsichtig bei der Handhabung. - Bereiten Sie eine Stammlösung aus Tricainmetsulfonat (MS222, 4 mg/ml) vor, indem Sie MS222 in autoklaviertes Fischwasser auflösen. Wirbel lange vor Gebrauch. Ms222-Stammlösung 1:100 in Fischwasser verdünnen (d. h. 200 l MS222-Stammlösung zu 20 ml Fischwasser zu einer Endkonzentration von 40 g/ml hinzufügen) um Embryonen für die folgenden Verfahren zu anästhesieren.
- Culture hLabel HeLa Zellen durch die Transducing sie mit PLenti6.2_miRFP670 Lentivirus mit dem Protokoll beschrieben17. Ernte RFP+ HeLa Zellen 30 min-1 h vor der Transplantation.
HINWEIS: Menschliche HeLa-Zellen wurden in einem Gewebekultur-Inkubator bis zu 70% Konfluenz in vollständigem Wachstumsmedium (DMEM-Medium mit 10% FBS) bei 37 °C kultiviert, ergänzt mit 5%CO2.- Entfernen Sie das HeLa-Zellmedium durch Aspiration in einer Gewebekulturhaube. Spülen Sie die Zellschicht kurz mit sterilem PBS ab, um alle Spuren des Serums zu entfernen.
- Fügen Sie 3,0 ml sterile Trypsin-EDTA-Lösung in einen T-75-Kolben und legen Sie die Zellen wieder in den 37 °C Gewebekultur-Inkubator für 3-5 min, um die enzymatische Verdauung zu erleichtern. Beobachten Sie den Kolben unter dem Mikroskop, bis 80 % der Zellen suspendiert werden.
- Fügen Sie 6-8 ml komplettes Wachstumsmedium in den Kolben. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml sterilen Rohr durch sanfte Pipettierung. Zentrifuge bei 135 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie HeLa-Zellen in 3 ml vollständigem Wachstumsmedium wieder aus. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt 2x. Setzen Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium aus und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer.
- Drehen Sie die Zellen wieder nach unten, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml wieder aus. Halten Sie die Zellen warm, indem Sie die Röhre in einer Hand halten, wenn Sie zur Fischanlage transportieren.
HINWEIS: Halten Sie die Zellen immer warm, indem Sie die Zellen vor oder während der Injektion der Embryonen im 35,5 °C-Inkubator lagern.
3. Transplantation menschlicher Krebszellen
- Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Ethanolhandtüchern vor der Transplantation (z.B. Schere, Pinzette, Kunststoffpipetten, Rasierklingen).
- Richten Sie Embryonen innerhalb der Rillen der Agaroseplatte mit einer Kunststoffpipette aus. Legen Sie Embryonen auf der Seite mit dem vorderen nach vorne gerichteten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Fischwasser die Embryonen bedeckt. Legen Sie einige Embryonen beiseite, um Krebszellen nicht zu injizieren und als Kontrolle zu verwenden. - Schalten Sie die Luftquelle und den Mikroinjektor ein. Nehmen Sie HeLa-Zellen aus dem Inkubator und pipette die Zellen 20-30x mit einer P200-Spitze nach oben und unten. Mit einer Gel-Ladespitze mit Schnittende 3 l Zellgemisch sofort in eine Nadel geben. Setzen Sie die Spitze vorsichtig in Richtung des scharfen unteren Endes der Nadel ein. Bei Bedarf schütteln Sie die Nadel, um sicherzustellen, dass die Zellmischung die Nadel nach unten bewegt, um das scharfe Ende zu füllen.
- Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Nadel vorsichtig aufzubrechen. Stellen Sie den Druck und die Dauer des Mikroinjektors ein, um alle Luftblasen innerhalb der Nadelspitze herauszuschieben. Reduzieren Sie die Druck- und Injektionsdauer, bis die Größe der Injektionströpfchen 1 nL beträgt.
- Legen Sie die Injektionsplatte unter das Mikroskop in eine geeignete Position, um die Dotterseite von Embryonen zur Nadel zu haben. Anästhesisieren Sie die Embryonen durch Zugabe von fünf Tropfen der verdünnten MS222-Lösung (40 g/ml).
- Positionieren Sie den Injektor und lassen Sie die Nadel die Perivitelinhöhle jedes Embryos berühren.
- Injizieren Sie die Zellmischung in die Embryonen im vaskularisierten Bereich unter der Perivitellinehöhle, indem Sie das Fußpedal drücken.
- Verwenden Sie die nicht dominante Hand, um die Injektionsplatte zum nächsten Embryo zu bewegen. Verwenden Sie die dominante Hand, um den Injektor zu verlängern und zurückzuziehen, während Sie gleichzeitig das Fußpedal drücken, um die Injektion fortzusetzen. Pipette ein paar Tropfen steriles Fischwasser auf Embryonen, die injiziert wurden. Sobald die Injektion aller Embryonen auf dem Teller abgeschlossen ist, waschen Sie die Embryonen mit sterilem Fischwasser ab, legen Sie sie auf eine sterile Petrischale und bewegen Sie sie sofort in den 35,5 °C-Inkubator.
- Nach 3 h die injizierten Embryonen untersuchen und die Toten entfernen.
- Bringen Sie die lebenden Embryonen in den 35,5 °C-Inkubator zurück und inkubieren Sie sie für 20-24 h, damit sich die HeLa-Zellen von der Injektionsstelle auf andere Teile des Körpers ausbreiten können.
HINWEIS: Embryonen werden in 35,5 °C Inkubator gehalten, um das Überleben und die Migration menschlicher Krebszellen zu ermöglichen, da die Zellen bei 28,5 °C nicht gut funktionieren, die Temperatur Fischembryonen werden normalerweise inkubiert.
4. Injektion von Nanopartikeln oder Fahrzeug
- Anästhetisieren Sie die transplantierten Embryonen am nächsten Morgen mit fünf Tropfen verdünnter MS222-Lösung. Nicht zu viel MS222 hinzufügen, weil dies die Embryonen töten wird. Unter einem fluoreszierenden Mikroskop nehmen Sie sorgfältig Embryonen mit Schwanzmetastasen von RFP+ HeLa-Zellen auf und legen sie in eine neue Petrischale mit sterilem Fischwasser.
- Stellen Sie die Injektionsnadeln wie zuvor in Abschnitt 2 beschrieben unter Verwendung der folgenden Einstellungen vor: Druck bei 500, Hitze bei 645, Ziehen bei 60, Geschwindigkeit bei 50 und Zeit/Verzögerung bei 100.
- Befolgen Sie die Verfahren in den Schritten 3.1-3.3, um Embryonen und Lastfahrzeuge (z. B. H2O) oder die Nanopartikellösung in die Nadel auszurichten.
- Injizieren Sie 0,5 nL von 1 mg/ml Nanopartikellösung hinter dem Auge und setzen Sie die Injektion wie in den Schritten 3.5-3.6 beschrieben fort (Abbildung 1B). Dieser Ort hinter den Augen ist mit Kapillaren angereichert, so dass die Nanopartikel in den Kreislauf gelangen können.
- Nach einem ähnlichen Verfahren injizieren Sie das Fahrzeug (z. B. H2O), mit dem die Nanopartikel in Embryonen mit transplantierten HeLa-Zellen und solchen ohne (d. h. Kontrollen) suspendiert wurden (Abbildung 1A, C).
- Inkubieren Sie alle injizierten Embryonen bei 35,5 °C.
5. Bildgebung und Verfolgung von Nanopartikeln und Krebszellen
- Untersuchen Sie injizierte Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 0, 30, 60, 90, 120, 180 und 210 min Nachinjektion von Nanopartikeln, um deren Verteilung im Kreislauf und den Grad der Krebszellung zu überwachen. Die Ausrichtung von Krebszellen durch Nanopartikel kann bereits nach 30 min nach der Injektion beobachtet werden, abhängig von der Art des getesteten Nanopartikels.
- Pipette 2-3 Embryonen in eine Petrischale und immobilisieren sie durch Zugabe von fünf Tropfen verdünnte MS222-Lösung (40 g/ml). Sobald die Embryonen aufhören zu schwimmen, entfernen Sie den größten Teil des Wassers, damit die Embryonen auf ihren Seiten liegen.
- Verwenden Sie eine Pipette mit einer dünnen, weichen Bürste, die an ihrem Ende befestigt ist, um die Embryonen so auszurichten, dass sie auf ihren Seiten liegen, wobei das Vorderrohr nach vorne gerichtet ist und nur ein Auge sichtbar ist.
- Stellen Sie die Embryonen in roten, blauen und hellen Feldkanälen mit geringer Vergrößerung (2x) vor, um den gesamten Embryo zu erfassen und bei höherer Vergrößerung (6,4x) zu wiederholen, um den Schwanzbereich zu erfassen. Fokussieren Sie den Embryo unter dem roten Kanal, um das Bluten von Nanopartikeln zu vermeiden.
HINWEIS: Die Embryonen dürfen sich während der Bildgebung nicht bewegen. Jede Bewegung führt zu verschwommenen Bildern und der Unfähigkeit, Bilder von verschiedenen Kanälen zu überlappen. - Fügen Sie den Embryonen unmittelbar nach der Bildgebung frisches Fischwasser hinzu und geben Sie es in den Brutkasten zurück. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4, um die Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten abzubilden.
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Representative Results
Der Protokollschema in Abbildung 1 veranschaulicht die allgemeinen Verfahren für diese Studie. Transparente Casper männliche und weibliche erwachsene Fische wurden gezüchtet, um Embryonen zu erzeugen (Abschnitt 1). RFP+ HeLa-Zellen wurden in den vaskularisierten Bereich unter der Perivitelinhöhle der Zebrafisch-Embryonen bei 48 hpf injiziert, wobei nicht injizierte Embryonen als Kontrollen durchgeführt wurden (Abschnitt 3). Bei Personen, die in der Mikroinjektion erfahren haben, ist die Überlebensrate von Embryonen oft hoch: Mindestens 50 % der Embryonen wurden mit Krebszellen transplantiert, die im 35,5 °C-Inkubator überlebten, einer für Zebrafischembryonen suboptimalen Temperatur, die jedoch für das Überleben und die Migration menschlicher Krebszellen erforderlich ist. HeLa-Zellen sind hochinvasiv und können intravasieren und sich bis zu 8 h nach der Injektion in den Schwanzbereich der Embryonen ausbreiten. Bis 20-24 h nach der Transplantation zeigten 50 % der transplantierten Embryonen Anzeichen einer metastasierenden Ausbreitung von HeLa-Zellen. Diese Embryonen mit Krebszellschwanzmetastasen wurden für nachgelagerte Experimente ausgewählt. Bei 72 hpf wurden diese Embryonen anschließend hinter den Augen entweder mit blauen fluoreszierenden Nanopartikeln (Abschnitt 4 und Abbildung 1B)oder ausschließlich mit dem Fahrzeug als Steuerung injiziert (Abbildung 1A). Altersgerechte Embryonen, die mit Nanopartikeln injiziert wurden, aber ohne Krebszelltransplantation waren die zweite Kontrollgruppe (Abbildung 1C). Ausführlichere Informationen zur Nanopartikelsynthese, -zubereitung und -charakterisierung finden Sie unter Peerzade et al.18.
Bei 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min Nachinjektion von Nanopartikeln wurden die injizierten Embryonen durch Bildgebung überwacht, um die Wechselwirkung von Nanopartikeln mit RFP+ HeLa-Zellen zu bestimmen, wobei die fahrzeuginjizierten Embryonen als Steuerungen verwendet wurden. Insbesondere wurden die Zebrafischschwanzbereiche, in denen sich RFP+ HeLa-Zellen ausgebreitet hatten, mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abschnitt 5) bei roter, blauer und heller Feldbeleuchtung dargestellt. Die detaillierte Charakterisierung der Fähigkeit der ultrahellen Nanopartikel, im Laufe der Zeit xenografierte Krebszellen in Zebrafischen zu zielen, ist in Abbildung 5 von Peerzade et al.18dargestellt. Die roten Punkte, die im Schwanz der Embryonen zu sehen sind, sind metastasierende menschliche Gebärmutterhalskrebszellen, die sowohl in fahrzeug- als auch nanopartikelinjizierten Embryonen sichtbar waren(Abbildung 2A, D; Abbildung 3A, D). Wie erwartet wurden bei Embryonen mit der reinen Fahrzeuginjektion keine spezifischen blauen Fluoreszenzsignale nachgewiesen (Abbildung 2B, E). Außerdem wurden beim Zusammenführen der in den roten und blauen Kanälen aufgenommenen Bilder nur rote Krebszellen im Schwanzbereich ohne blaue Signale beobachtet (Abbildung 2C, F). Bei Embryonen, die mit ultrahellen fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln injiziert wurden, gab es jedoch blaue Punkte in den Schwänzen, die sich bei 3,5 h in der Nähe und um die Krebszellen konzentrierten(Abbildung 3B, E). In den überlagerten Bildern, die sowohl von roten als auch von blauen Kanälen aufgenommen wurden, wurden rote HeLa-Zellen und blaue Nanopartikel kolokalisiert, die als rosa Punkte gesehen werden (Abbildung 3C, F). Bei embryonen, die ausschließlich mit Nanopartikeln injiziert, aber nicht mit HeLa-Zellen transplantiert wurden, konzentrierten sich die blauen Fluoreszenzpartikel nicht in bestimmte Zellen oder Bereiche, sondern verteilten sich relativ gleichmäßig in das Kreislaufsystem der Embryonen, wobei die Blutgefäße hervorgehoben wurden (Abbildung 4B, E). Wie erwartet wurden in diesen Embryonen trotz schwacher Fluoreszenzsignale im Hintergrund keine spezifischen roten Fluoreszenzsignale nachgewiesen (Abbildung 4A, C, D, F).
Dieses Protokoll wurde anschließend verwendet, um verschiedene Arten von Nanopartikeln18,19,20zu testen. Die Kolokalisierung von Krebszellen mit bestimmten Arten von Nanopartikeln wurde bereits nach 30 min nach der Injektion beobachtet, abhängig von den Eigenschaften des getesteten Nanopartikels. Bis 120 min wurden krebszellen von diesen Nanopartikeln im Schwanzbereich der Fische gezielt. Bei anderen Nanopartikeln wurde jedoch eine minimale Ausrichtung auf Krebszellen beobachtet, die mit ihrem Mangel an krebsspezifischem Liganden übereinstimmte. Die detaillierten Ergebnisse und Analysen sind in Peerzade et al. enthalten (siehe Abbildung 3 und Abbildung 4, Ergänzende Abbildungen S12-S16 und Ergänzende Tabelle S6)18. Diese Ergebnisse zeigten eine differenzielle Ausrichtung von Nanopartikeln auf xenografierte HeLa-Zellen in Zebrafischen. Mit diesem Protokoll sollte man daher in der Lage sein, Nanopartikel effizient auszuwählen, basierend auf ihrer Fähigkeit, metastasierende menschliche Krebszellen in vivo zu erkennen und zu zielen.
Abbildung 1: Protokollschema zur Untersuchung der Fähigkeit von Nanopartikeln, menschliche Krebszellen anzusprechen. Transparente Casper-Embryonen wurden durch die Zucht von männlichen und weiblichen erwachsenen Fischen erzeugt. Befruchtete Embryonen wurden in einer Petrischale gesammelt. Bei 48 hpf wurden RFP+ HeLa-Zellen in Zebrafisch-Embryonen an der Perivitelline-Höhle injiziert, so dass einige altersgerechte Embryonen als Kontrollen nicht injiziert wurden. Bei 72 hpf wurden Embryonen mit metastasierenden RFP+ HeLa-Zellen ausgewählt und in zwei Gruppen aufgeteilt: (A) mit Fahrzeug (H2O) als Kontrolle injiziert und (B) mit Nanopartikeln injiziert, die in H2O suspendiert sind. Die dritte Gruppe waren altersgerechte Embryonen, die allein mit Nanopartikeln injiziert wurden (C). Alle drei Gruppen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. In dem angezeigten Boxbereich wurden Bilder aufgenommen (siehe Abbildung 2-Abbildung 4). Skalenstäbe für erwachsene Fische = 1 mm und für Embryonen = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zebrafische, die mit metastasierenden HeLa-Zellen ohne Nanopartikel transplantiert wurden. Nur rote fluoreszierende HeLa-Zellen waren im Individuum (A, D) oder überlagerten Bildern des roten Kanals und des blauen Kanals (C, F) sichtbar. Im Embryo wurden keine spezifischen blauen Fluoreszenzsignale mit Fahrzeuginjektionskontrolle (B, E )nachgewiesen. Bilder in (A-C) zeigen die Fischschwanzregion, die wie in Abbildung 1Ageboxt ist. Bilder in (D-F) sind vergrößerte Ansichten der geschachtelten Bereiche in (A-C). Skalenbalken in (A-C) = 200 'm und in (D-F) = 100 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kolokalisierung roter fluoreszierender HeLa-Zellen und blaufluoreszierender Nanopartikel in Zebrafischen. Die Zebrafischschwänze wurden sowohl bei niedriger (A-C) als auch bei hoher (D-F) Vergrößerung im roten und blauen Kanal abgebildet. Rote Fluoreszenzsignale zeigten metastasierende HeLa-Zellen (A, D), während blaue Fluoreszenzsignale die Nanopartikel zeigten (B, E). Die überlagerten Bilder von roten und blauen Kanälen (C, F) zeigen die Kolokalisierung von HeLa-Zellen und Nanopartikeln. Die Bilder wurden nach 3,5 h aus der Injektion mit ultrahellen Kieselsäure-Nanopartikeln aufgenommen. Bilder in (A-C) zeigen die Fischschwanzregion in Abbildung 1B. Bilder in (D-F) sind vergrößerte Ansichten der geschachtelten Bereiche in (A-C). Skalenstäbe in (A-C) = 100 m und in (D-F) = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zebrafische, die mit Nanopartikeln ohne menschliche HeLa-Zellen injiziert werden. Blaue fluoreszierende Nanopartikel wurden im Individuum (B, E) in das Kreislaufsystem der Embryonen verteilt und die Bilder des roten und blauen Kanals (C, F) überlagert. Eine spezifische rote Fluoreszenz war weder bei niedriger noch bei hoher Vergrößerung (A, D) sichtbar, mit Ausnahme einiger Hintergrundfluoreszenz, die Zebrafischembryonen gemeinsam sind. Bilder in (A-C) zeigen die Fischschwanzregion in Abbildung 1C. Bilder in (D-F) sind vergrößerte Ansichten der geschachtelten Bereiche in (A-C). Skalenbalken in (A-C) = 100 'm und in (D-F) = 50 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll nutzt den Zebrafisch als In-vivo-System, um die Fähigkeit von Nanopartikeln zu testen, metastasierende menschliche Krebszellen zu erkennen und zu zielen. Mehrere Faktoren können die erfolgreiche Durchführung der Experimente beeinflussen. Zunächst müssen Embryonen mit 48 hpf vollständig entwickelt werden. Das richtige Entwicklungsstadium der Embryonen ermöglicht es ihnen, die Transplantation menschlicher Krebszellen zu überstehen und zu überleben. Embryonen unter 48 hpf haben eine deutlich niedrigere Überlebensrate als ältere und stärker entwickelte Embryonen. Zweitens sollten Krebszellen so gesund wie möglich gehalten werden, indem sichergestellt wird, dass sie: 1) in der exponentiellen Wachstumsphase21, 2) frisch geerntet 30 min-1 h unmittelbar vor der Transplantation, und 3) halten warm zu jeder Zeit. Drittens darf die Nadel nicht verstopft werden. Pipette die HeLa-Zellen mindestens 20x nach oben und unten, bevor sie die Zellmischung in die Nadel laden. Viertens müssen verschiedene Arten von Nadeln für die Transplantation menschlicher Krebszellen und die Injektion von Nanopartikeln verwendet werden. Die Nadel für die Transplantation menschlicher Zellen ist relativ breit, mit einem Winkel, um Zellverstopfung zu vermeiden, während die Nadel für die Nanopartikelinjektion scharf und dünn ist. Fünftens unterscheidet sich die Lage der Injektion. Der Ort für die Transplantation menschlicher Zellen ist die Perivitelinhöhle, aber für die Nanopartikelinjektion sollte die Nadel hinter dem Auge eingesetzt werden, wo es angereicherte Kapillaren gibt. Schließlich spielt die Fähigkeit des Individuums, das die Transplantation durchführt, eine Rolle. Ein erfahrener Mensch kann HeLa-Zellen genau in den Perivitelline-Hohlraum injizieren, während eine unerfahrene Person oft Tumorzellen in den Eigelbbereich injiziert, wo sich Tumorzellen kaum in den Fischkörper ausbreiten. In ähnlicher Weise ist die Überlebensrate der Embryonen viel höher, wenn sie von einer erfahrenen Person behandelt wird, wobei mindestens 50 % der Embryonen mit Krebszellen transplantiert werden.
Obwohl Zebrafisch-Embryonen in der Regel bei 28,5 °C inkubiert werden, benötigen menschliche Krebszellen höhere Temperaturen, um zu überleben und zu wandern22,23. Um das Überleben sowohl von Fischembryonen als auch von menschlichen Krebszellen zu ermöglichen, werden die mit menschlichen Krebszellen transplantierten Embryonen stattdessen bei 35,5 °C inkubiert. Obwohl es einfacher sein kann, Krebszellen in den Dottersack zu liefern, verbreiten sie sich kaum in das Kreislaufsystem. Daher ist es wichtig, die Krebszellen in den vaskularisierten Bereich unter der Perivitelinhöhle zu injizieren, um die Intravasation und Ausbreitung von Krebszellen zu gewährleisten. Darüber hinaus muss man aufpassen, dass bei der Anästhesisierung der Embryonen während der Injektion und Bildgebung nicht zu viel oder zu konzentriert MS222 hinzugefügt wird. Zur Abbildung und Visualisierung von Nanopartikeln wurde anstelle von AB-Fischen der Casper-Zebrafisch ausgewählt. Der Casper-Fisch ist ein doppelter Mutant für Nacre und Roy, dem Melanozyten und Iridophore fehlen, was zu einer erhöhten Transparenz im Vergleich zu AB-Fisch14führt. Die Transparenz des Casper Zebrafisches ermöglicht die Überwachung der Ausbreitung von Nanopartikeln im Umlauf und die Ausrichtung der Nanopartikel auf Krebszellen. Die Herausforderung dieses Protokolls ist die relativ hohe Sterblichkeitsrate der Embryonen, wenn ein unerfahrener Mensch die Transplantation menschlicher Krebszellen durchführt. Interessanterweise ist die Injektion von Nanopartikeln leicht hinter den Augen relativ gut verträglich. Dies ist wahrscheinlich auf die Verwendung von dünneren Nadeln im Vergleich zu den Nadeln für Tumorzellentransplantation verwendet. Um eine Schädigung menschlicher Krebszellen zu vermeiden, muss man Nadeln mit breiten Öffnungen verwenden, aber diese können zu Schäden an den Embryonen führen, wenn sie unsachgemäß behandelt werden.
Dieses Protokoll nutzt den Casper Zebrafisch, um das Targeting von metastasierenden Krebszellen mit funktionalisierten Nanopartikeln in vivo zu visualisieren. Ein großer Vorteil dieses Assays ist, dass er es den Forschern ermöglicht, im Laufe der Zebrafischentwicklung eine Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um die Wechselwirkung von Krebszellen mit Nanopartikeln zu überwachen. In der Tat, aufgrund seiner hohen Fruchtbarkeit und schnelle Entwicklung, der Zebrafisch ermöglicht es dem Forscher, Ergebnisse in nur wenigen Tagen zu erhalten18,19,20,24. Darüber hinaus ermöglicht dieser Test auch die Eliminierung toxischer Nanopartikel aus der weiteren Forschung, wenn die meisten Embryonen nach der Injektion eines bestimmten Nanopartikeltyps sterben. Obwohl der Zebrafisch kein Säugetier ist, erleichtert er die schnelle und wirtschaftliche Auswahl einer großen Anzahl von Nanopartikeln und liefert nützliche Informationen für nachgelagerte Studien an großen Tieren und klinische Tests. Zusammengenommen wirkt sich der Zebrafisch in der Nanomedizin und Nanotechnologie aus, indem er bei der Auswahl geeigneter Nanosonden zur Früherkennung und möglichen Zerstörung von Krebszellen durch krebsspezifisches Targeting hilft.
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Disclosures
I.S. bekundet Interesse an NanoScience Solutions, LLC (Empfänger des STTR NIH R41AI142890 Stipendiums). Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Frau Kaylee Smith, Frau Lauren Kwok und Herrn Alexander Floru für das Korrekturlesen des Manuskripts. H.F. unterstützt die NIH (CA134743 und CA215059), die American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) und die St. Baldrick es Foundation. F.J.F.L. bestätigt ein Stipendium des Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkennt NSF-Unterstützung (Grant CBET 1605405) und NIH R41AI142890 an.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
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