Summary
Burada açıklanan vivo insan kanser hücrelerini hedef işlevsel nano tanecikleri yeteneğini incelemek için zebra balığı embriyoları kullanmak için bir yöntemdir. Bu yöntem, büyük hayvanlarda ve klinik çalışmalarda gelecekteki testler için optimal nano partiküllerin değerlendirilmesi ve seçilmesi için izin verir.
Abstract
Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi nanotıp alanında büyük ilgi görüyor. In vivo hayvan modelleri biyomedikal uygulama için nanoteknoloji köprü için gereklidir. Fare preklinik test için geleneksel hayvan modeli temsil eder; ancak, fareler tutmak için nispeten pahalı ve her anneden sınırlı döl nedeniyle uzun deneysel döngüleri var. Zebra balığı kanser araştırmaları da dahil olmak üzere gelişimsel ve biyomedikal araştırmalar için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, optik şeffaflık ve hızlı gelişimi nedeniyle, zebra balığı embriyoları iyi kanser hücrelerinin davranışı ve mikro çevre ile etkileşimleri gerçek zamanlı in vivo izleme için uygundur. Bu yöntem, şeffaf Casper zebra balığı embriyolarında insan kanser hücrelerini ve fonksiyonel nano partiküllerini sırayla tanıtmak ve kanser hücrelerinin gerçek zamanlı olarak nano partiküller tarafından in vivo tanıma ve hedeflemesini izlemek için geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş protokol, folat grupları ile işlevsel hale getirilmiş floresan etiketli nano taneciklerin, farklı bir florokrom ile etiketlenmiş metastatik insan servikal epitel kanseri hücrelerini özellikle tanıyıp hedefleyebildiğini göstermektedir. Tanıma ve hedefleme işlemi test edilen nano partiküllerin 30 dk sonrası enjeksiyonu kadar erken bir sürede gerçekleşebilir. Tüm deney sadece yetişkin balık birkaç çift üreme gerektirir ve tamamlamak için 4 günden az sürer. Ayrıca, zebra balığı embriyoları fonksiyonel bir adaptif bağışıklık sistemi eksikliği, insan kanser hücrelerinin geniş bir yelpazede engraftment izin. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün yararı insan kanser hücrelerinin çeşitli nano tanecikleri test sağlar, memeliler ve klinikte gelecekteki test için her özel kanser bağlamında optimal nano tanecikleri seçimi kolaylaştıran.
Introduction
Kanser hücrelerini tespit etme, hedefleme ve yok etme yeteneğine sahip nano partiküllerin geliştirilmesi hem fizikçiler hem de biyomedikal araştırmacılar için büyük ilgi çekicidir. Nanotıp ortaya çıkması çeşitli nano tanecikleri gelişmesine yol açtı, bu ligands ve / veya kemoterapötikilaçlar1 hedefleme ile konjuge gibi1 ,2,3. Nano partiküllerin eklenen özellikleri, biyolojik sistemle etkileşimlerini, biyolojik olayları yüksek verimlilik ve doğrulukla algılamalarını ve izlemelerini ve terapötik uygulamaları sağlarlar. Altın ve demir oksit nano partikülleri öncelikle bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme uygulamalarında sırasıyla kullanılır. Altın ve demir oksit nano tanecikleri enzimatik faaliyetleri kolorimetrik tahliller yoluyla kanser hücrelerinin tespiti ne izin, floresan nano tanecikleri de in vivo görüntüleme uygulamaları için uygundur4. Bunlar arasında, ultraparlak floresan nano tanecikleri özellikle yararlıdır, daha az parçacıklar ve azaltılmış toksisite ile erken kanserleri tespit etme yetenekleri nedeniyle5.
Bu avantajlara rağmen nano partiküller uygun nanomalzemelerin seçimi ve sentez sürecinin optimizasyonu için in vivo hayvan modellerini kullanarak deney gerektirir. Ayrıca, tıpkı ilaçlar gibi, nano tanecikleri etkinliğini ve toksisite belirlemek için preklinik test için hayvan modelleri güveniyor. En yaygın olarak kullanılan preklinik model fare, olan bakım nispeten yüksek bir maliyetle gelen bir memeli. Kanser çalışmaları için, ya genetiği değiştirilmiş fareler veya ksenogreftli fareler genelliklekullanılır 6,7. Bu deneylerin uzunluğu genellikle haftalar cakadar uzanır. Özellikle, kanser metastazı çalışmaları için, kanser hücreleri doğrudan kuyruk damarları ve dalak 8 gibi yerlerde farelerin dolaşım sistemine enjekte edilir8,9,10. Bu modeller sadece tümör hücreleri ekstravaze ve uzak organları kolonize metastaz son aşamalarını temsil eder. Ayrıca, görünürlük sorunları nedeniyle, özellikle farelerde tümör hücrelerinin tümör hücre göçü ve nanopartikül hedefleme izlemek zordur.
Zebra balığı(Danio rerio)yüksek fecundity nedeniyle kanser araştırmaları için güçlü bir omurgalı sistemi haline gelmiştir, düşük maliyetli, hızlı gelişme, optik şeffaflık, ve genetik korumaları11,12. Fare modeli üzerinde zebra balığı bir diğer avantajı balık yumurtaları ex utero döllenme, hangi embriyoların gelişimi boyunca izlenmesini sağlar. Embriyonik gelişim zebra balığında hızlıdır ve 24 saat sonrası döllenme (hpf) içinde omurgalı vücut düzlemi zaten13. 72 hpf ile, yumurta koro yumurtadan, kızartma aşamasına embriyonik geçiş. Zebra balığının şeffaflığı, özellikle Casper suşu14,kanser hücrelerinin göç ve tanıma ve canlı bir hayvan nano tanecikleri tarafından hedefleme görselleştirmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Son olarak, zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık sistemini geliştirmek 48 hpf, adaptif bağışıklık sistemi geride kalan ve sadece fonksiyonel hale ile 28 gün postfertilizasyon15. Bu zaman farkı, bağışıklık reddi yaşamadan zebra balığı embriyolarına insan kanser hücrelerinin çeşitli nakli için idealdir.
Burada açıklanan şeffaflık ve canlı floresan nano tanecikleri tarafından insan kanser hücrelerinin tanınması ve hedefolduğunu göstermek için zebra balığı hızlı gelişimi yararlanan bir yöntemdir. Bu araştırmada, kırmızı floresan proteini ifade etmek için genetik olarak tasarlanmış insan servikal kanser hücreleri (HeLa hücreleri) 48 hpf embriyonun perivitellin boşluğundaki vaskülar bölgeye enjekte edildi. 20-24 saat sonra, HeLa hücreleri zaten balık dolaşım sistemi yoluyla embriyolar boyunca yayılmıştı. Belirgin metastazı olan embriyolara, zengin kılcal yatağın bulunduğu gözün hemen arkasında ~0.5 nL'lik bir nanopartikül çözeltisi enjekte edildi. Bu tekniği kullanarak, ultraparlak floresan silika nano tanecikleri 20-30 dk enjeksiyon sonrası hızlı bir şekilde HeLa hücrelerini hedefleyebilir. Sadeliği ve etkinliği nedeniyle, zebra balığı belirli kanser hücrelerini hedef yetenekleri için nano tanecikleri çeşitli test etmek için sağlam bir in vivo modeli temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Boston Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından #PROTO201800543 protokolü altında onaylanmıştır.
1. Casper zebra balığı embriyolarının nesli
- Şeffaf Casper zebra balığı embriyoları oluşturmak için doğal üreme için yaş en az 3 ay yetişkin Casper balık seçin.
- Akşam iki odalı çiftleştirici tankları balık suyuyla doldurun, üst tankları bölücüler kullanarak ayırın, bir erkek balığı odanın bir tarafına, bir veya iki dişi balığı da odanın diğer tarafına yerleştirin ve balığı bir gecede bölücüler tarafından ayırın.
- Ertesi sabah 8:00'de ışıklar açıkken bölücüleri dışarı çekin. Yapay zenginleştirme tesisleri ekleyin ve su sığ bir alan oluşturmak için biraz üst oda eğim. 3-4 saat için balık doğurmak için izin verin.
- Balıkiçeren miyon tanklarının üst odalarını kaldırın ve orijinal tanklarına geri döndürün.
- Bir örgü ağ üzerinden su dökerek alt odalarında bulunan yumurta toplamak. Yumurtaları steril petri kabına, her çan başına 200 yumurtadan fazla olmayan bir yoğunlukta aktarın. Herhangi bir ölü veya döllenmemiş yumurta çıkarın ve tatlı balık suyu ile çanak 2/ 3 dolu doldurun.
NOT: Döllenmiş ve sağlıklı yumurtalar yarı saydam ve yuvarlak olmalıdır. Bulutlu, beyaz veya sakat olan tüm yumurtalar çıkarılmalıdır. Balık suyu, balık tesisindeki balık tanklarında elde edilir. - Bir gecede 28.5 °C'de kuvözdeki embriyoları kuluçkaya yatırın.
- Bleach embriyolar ertesi sabah standart protokolü kullanarak Zebrafish Book16açıklandığı gibi , ve geri kuvöz (isteğe bağlı adım) embriyolar koymak.
- Öğleden sonra 24 hpf embriyoyu kuvözden alın ve pronase kullanarak embriyoları dekoron.
- Petri kabındaki embriyolardan mümkün olduğunca çok balık suyu çıkarın ve kabına pronase çözeltisinden (balık suyunda 1 mg/mL) birkaç damla ekleyin. Petri kabını yavaşça döndürün. Bir kez korolar parçalanma belirtileri göstermek, pipet yukarı ve aşağı embriyolar embriyoları serbest bırakmak için koroları yıkmak için birkaç kez.
- Embriyoların çoğunluğu korolar dışında bir kez süreci sona erdirmek için Petri kabına hemen taze balık suyu ekleyin. Yüzen koroları kaldırmak için balık suyu kullanarak embriyoları 3 kat daha fazla durulayın. Embriyoları kuvöze geri ver.
2. Transplantasyon için insan kanser hücrelerinin hazırlanması
- Kuluçka sıcaklığını tam olarak 35,5 °C'ye ayarlayın. Kuvöz içinde bir termometre kullanarak tutarlı ve istikrarlı bir sıcaklık sağlamak için kuvöz izleyin.
- Otoklav 1 L balık suyu cam şişede. Agarose tamamen eriyene kadar 100 mL otoklav balık suyuna 3 g elektroforez dereceli agarose ekleyerek %3 agarose çözeltisi yapın.
- 3 / 4 dolu olana kadar bir Petri kabına sıcak agarose çözeltisi dökün. Mikroenjeksiyon kalıbını agarose'un üzerine yerleştirin. Kalıbın Petri kabının alt kısmıyla temas halinde olmadığından ve altında kabarcıklar oluşmadığından emin olun.
- Çözeltinin katılamasını bekleyin ve kalıbı plakadan dikkatlice çıkarın. Plakayı otoklavlı balık suyuyla doldurun ve plakayı 4 °C'de saklayın. HeLa hücrelerini hasat etmeden önce 35,5 °C'lik kuluçka makinesinde agarose plakasını ve balık suyunu önceden ısıtın.
- Aşağıdaki ayarları kullanarak bir pipet çekmecesi üzerinde 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borosilikat cam kılcal damarları çekin: 500 basınç, 560'ta ısı, 100'de çekme, 100'de hız ve 200'de zaman/gecikme. Bir etanol havlu ile silinmiş olan büyük bir Petri çanak macun üzerinde saklayın iğneler.
DİkKAT: Çekilen iğneler çok keskin ve kırılgandır. İşlem yaparken dikkatli olun. - MS222'yi otoklavlı balık suyuna eriterek triain metansülfonat (MS222, 4 mg/mL) stok çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce girdap. Sulandırın MS222 stok çözeltisi 1:100 balık suyunda (yani, 200 μL MS222 stok çözeltisi ekleyin 20 mL balık suyuna 40 μg/mL nihai konsantrasyona) aşağıdaki işlemler için embriyoları anestezik edin.
- Kültür hLabel HeLa hücreleri PLenti6.2_miRFP670 lentivirus ile transducing protokol kullanılarakaçıklanan 17. Transplantasyondan önce RFP+ HeLa hücreleri 30 dk-1 saat.
NOT: İnsan HeLa hücreleri 37 °C'de %5 CO2ile desteklenerek tam büyüme ortamında %70'e kadar biraraya gelirken (%10 FBS ile DMEM orta) doku kültürü kuvözde kültürlenmiştir.- Bir doku kültürü başlık aspirasyon tarafından HeLa hücre ortamı çıkarın. Kısaca serum tüm izlerini kaldırmak için steril PBS ile hücre tabakası durulayın.
- T-75 şişesine 3,0 mL steril Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için hücreleri 37 °C doku kültürü kuluçka makinesine 3-5 dakika süreyle geri yerleştirin. Hücrelerin ~% 80 askıya alana kadar mikroskop altında şişe gözlemleyin.
- Şişeye 6-8 mL tam büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri hafifçe boruhaline getirerek 15 mL steril bir tüpe toplayın. Santrifüj 135 x g 5 dk.
- Süpernatant aspire ve tam büyüme ortamı3 mL HeLa hücreleri resuspend. Yukarıdaki yıkama adım 2x tekrarlayın. Hücreleri tam büyüme ortamının 1 mL'sinde yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri sayın.
- Hücreleri tekrar aşağı döndürün, süpernatantı çıkarın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpteki hücreleri 5 x 107 hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Balık tesisine taşırken tüpü bir elinde tutarak hücreleri sıcak tutun.
NOT: Embriyolara enjekte edilmeden önce veya sırasında hücreleri 35,5 °C'lik kuvözde saklayarak hücreleri her zaman sıcak tutun.
3. İnsan kanser hücrelerinin nakli
- Transplantasyon dan önce etanol havlu (örneğin, makas, cımbız, plastik pipetler, jiletler) kullanarak çalışma alanını temizleyin.
- Embriyoları agarose plakasının olukları içinde plastik bir pipet kullanarak hizalayın. Ön öne bakacak şekilde embriyoları yan tarafa yatırın.
NOT: Balık suyunun embriyoları kapsadığından emin olun. Kanser hücrelerini enjekte etmemek ve kontrol olarak kullanmak için bazı embriyoları bir kenara koyun. - Hava kaynağını ve mikroenjektörü açın. Bir P200 ucu kullanarak hela hücrelerini kuvözden ve pipetten çıkarTın. 3 μL'lik hücre karışımını bir jel yükleme ucunu kesme ucu yla hemen bir iğneye yükleyin. Ucu dikkatlice iğnenin keskin alt ucuna doğru takın. Gerekirse, hücre karışımı keskin ucunu doldurmak için iğne aşağı hareket sağlamak için iğne sallayın.
- İğneyi iğne tutucuya takın. Dikkatle iğne ucu açık kırmak için cımbız bir çift kullanın. İğne ucunun içindeki tüm hava kabarcıklarını dışarı itmek için mikroenjektörün basıncını ve süresini ayarlayın. Enjeksiyon damlacıklarının boyutu ~1 nL olana kadar basıncı ve enjeksiyon süresini azaltın.
- Enjeksiyon plakasını mikroskop altında, embriyoların sarısı tarafının iğneye bakacak şekilde uygun bir konuma yerleştirin. Seyreltilmiş MS222 çözeltisinin beş damlasını (40 μg/mL) ekleyerek embriyoları uyuşdurun.
- Enjektörü yerleştirin ve iğnenin her embriyonun perivitellin boşluğuna dokunmasına izin verin.
- Ayak pedalına basarak perivitelline boşluğunun altındaki vaskülarize bölgede embriyolara hücre karışımı enjekte edin.
- Enjeksiyon plakasını bir sonraki embriyoya taşımak için baskın olmayan eli kullanın. Enjeksiyona devam etmek için ayak pedalına aynı anda basarken enjektörü uzatmak ve geri çekmek için baskın eli kullanın. Pipet enjekte edilmiş embriyolar üzerine steril balık suyu birkaç damla. Plakaüzerindeki tüm embriyoların enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, embriyoları steril balık suyuyla yıkayın, steril bir Petri kabına koyun ve hemen 35,5 °C kuvöze taşıyın.
- 3 saat sonra, enjekte edilen embriyoları inceleyin ve ölü olanları çıkarın.
- Canlı embriyoları 35,5 °C'lik kuvöze geri verin ve HeLa hücrelerinin enjeksiyon bölgesinden vücudun diğer bölgelerine yayılmasını sağlamak için 20-24 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücreler 28.5 °C'de iyi olmadığı için embriyolar 35.5 °C'de tutulur ve insan kanser hücrelerinin hayatta kalmasına ve göç etmesine izin verilir, balık embriyoları normalde kuluçkaya yatırılır.
4. Nano partiküllerin veya aracın enjeksiyonu
- Ertesi sabah nakledilen embriyoları beş damla seyreltilmiş MS222 çözeltisi ile anestezi edin. Bu embriyolar öldürecek, çünkü çok fazla MS222 eklemeyin. Floresan mikroskop altında, rfp+ HeLa hücrelerinin kuyruk metastazı olan embriyoları dikkatlice toplayın ve steril balık suyu içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.
- Aşağıdaki ayarları kullanarak bölüm 2'de açıklandığı gibi enjeksiyon iğneleri yapın: 500'de basınç, 645'te ısı, 60'ta çekme, 50'de hız ve 100'de zaman/gecikme.
- Embriyoları hizalamak ve aracı (örn. H2O) veya nanopartikül çözeltisini iğneye hizalamak için 3.1-3.3 adımlarında prosedürleri uygulayın.
- Gözün arkasına 0.5 nL 1 mgL nanopartikül çözeltisi enjekte edin ve 3.5-3.6 adımlarında açıklandığı gibi enjeksiyona devam edin(Şekil 1B). Gözlerin arkasındaki bu konum kılcal damarlarla zenginleştirilmiştir, nano partiküllerin dolaşıma girmesini sağlar.
- Benzer bir prosedürü takiben, nano partikülleri embriyolara uzaklaştırmak için kullanılan araca (örneğin, H2O) HeLa hücreleri nakledilen ve (yani kontroller) olmayanlara enjekte edin (Şekil 1A, C).
- Enjekte edilen tüm embriyoları 35.5 °C'de kuluçkaya yatırın.
5. Nano partiküllerin ve kanser hücrelerinin görüntülenmesi ve izlenmesi
- 0, 30, 60, 90, 120, 180 ve 210 dk nano taneciklerin postenjeksiyon sonrası bir floresan mikroskop altında enjekte embriyolar inceleyin dolaşımda dağılımlarını ve kanser hücresi hedefleme derecesini izlemek için. Test edilen nanopartikül türüne bağlı olarak kanser hücrelerinin nano partiküller tarafından hedef alınması 30 dk enjeksiyon sonrası olarak görülebilir.
- Pipet 2-3 embriyobir Petri kabına ve seyreltilmiş MS222 çözeltisi (40 μg/mL) beş damla ekleyerek onları hareketsiz hale getirin. Embriyolar yüzmeyi bıraktıktan sonra, embriyoların yanlarında yatmasını sağlamak için suyun çoğunu çıkarın.
- Embriyoları hizalamak için ucuna bağlı ince, yumuşak bir fırça içeren bir pipet kullanın, böylece ön tarafları öne bakacak şekilde yanlarında uzanın ve sadece bir gözü görünür.
- Tüm embriyoyu yakalamak ve kuyruk alanını yakalamak için daha yüksek büyütmede (6,4x) tekrarlamak için embriyoları düşük büyütmede (2 x) kırmızı, mavi ve parlak alan kanallarıyla görüntüleyin. Nano partiküllerin kanamasını önlemek için kırmızı kanalın altındaki embriyoya odaklanın.
NOT: Embriyolar görüntüleme sırasında hareket etmemelidir. Herhangi bir hareket bulanık görüntülere ve farklı kanallardan gelen görüntülerin çakışamama larına yol açacaktır. - Görüntülemeden hemen sonra embriyolara taze balık suyu ekleyin ve kuvöze geri verin. Embriyoları farklı zaman noktalarında görmek için 5.2-5.4 adımlarını tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'deki protokol şeması bu çalışmanın genel prosedürlerini göstermektedir. Şeffaf Casper erkek ve dişi yetişkin balıkembriyooluşturmak için yetiştirildi (bölüm 1). RFP+ HeLa hücreleri zebra balığı embriyolarının perivitellin boşluğu altında vaskülarize bölgeye 48 hpf'de enjekte edilmemiş embriyolar ile kontrol edildi (bölüm 3). Mikroenjeksiyon deneyimli bireyler için, embriyoların sağkalım oranı genellikle yüksektir, embriyoların en az% 50 kanser hücreleri ile nakledilen 35.5 ° C incubator, zebra balığı embriyoları için bir sıcaklık suboptimal ama insan kanser hücrelerinin hayatta kalma ve göç için gerekli. HeLa hücreleri son derece invaziv ve intravasate ve 8 saat postenjeksiyon gibi hızlı bir şekilde embriyoların kuyruk bölgesine yayılabilir. Transplantasyon sonrası 20-24 saat, nakledilen embriyoların ~%50'si HeLa hücrelerinin metastatik yayılım belirtileri gösterdi. Kanser hücresi kuyruk metastazlı embriyolar downstream deneyleri için seçildi. 72 hpf'de bu embriyolar daha sonra göz arkasına mavi floresan nano partiküller (bölüm 4 ve Şekil 1B)ile ya da sadece araçla kontrol olarak enjekte edildi (Şekil 1A). Nano partiküller enjekte edilen ancak kanser hücresi nakli olmayan yaşuyumlu embriyolar ikinci kontrol grubudur(Şekil 1C). Nanopartikül sentezi, hazırlık ve karakterizasyon hakkında daha ayrıntılı bilgi içinbkz.
0, 30, 60, 90, 120, 180, nano taneciklerin 210 dk postenjeksiyon, enjekte embriyolar kontrol olarak araç enjekte embriyolar kullanılarak, RFP + HeLa hücreleri ile nano taneciklerin etkileşimini belirlemek için görüntüleme tarafından izlendi. Özellikle, RFP + HeLa hücrelerinin yayıldığı zebra balığı kuyruk alanları floresan mikroskop kullanılarak kırmızı, mavi ve parlak alan aydınlatmasında görüntülenmiştir (bölüm 5). Ultraparlak nano partiküllerin zaman içinde zebra balığındaki ksenogreftli kanser hücrelerini hedefleme yeteneğinin ayrıntılı karakterizasyonu Peerzade ve ark.18'inŞekil 5'inde gösterilmiştir. Embriyoların kuyruğunda görülen kırmızı nokta, hem araç hem de nanopartikül enjekte edilen embriyolarda görülen metastatik insan servikal kanser hücreleridir(Şekil 2A, D; Şekil 3A, D). Beklendiği gibi, embriyolarda sadece araç enjeksiyonu ile belirli bir mavi floresan sinyali saptanmadı(Şekil 2B, E). Ayrıca, kırmızı ve mavi kanallarda çekilen görüntüler birleştirildiğinde, kuyruk bölgesinde mavi sinyal içermeyen sadece kırmızı kanser hücreleri gözlenmiştir(Şekil 2C, F). Ancak, ultra parlak floresan silika nano tanecikleri enjekte edildi embriyolarda, kuyrukları mavi nokta vardı, yakın ve kanser hücrelerinin etrafında konsantre 3.5 h(Şekil 3B, E). Hem kırmızı hem de mavi kanallardan çekilen üst üste binmiş görüntülerde, kırmızı HeLa hücreleri ve mavi nano tanecikleri pembe nokta olarak görülen kolokalize edilmiştir(Şekil 3C, F). Sadece nano partiküller ile enjekte edilen ancak HeLa hücreleri ile nakledilemeyen bu embriyolarda, mavi floresan parçacıklar belirli bir hücre veya alanlara yoğunlaşmadı, ancak kan damarlarını vurgulayarak embriyoların dolaşım sistemine nispeten eşit olarak dağıldılar(Şekil 4B, E). Beklendiği gibi, bazı zayıf arka plan floresan sinyallerine rağmen bu embriyolarda belirli bir kırmızı floresan sinyali saptamadı(Şekil 4A, C, D, F).
Bu protokol daha sonra nano tanecikleri18,,19,,20farklı türleri test etmek için kullanılmıştır. Test edilen nanopartikülün özelliklerine bağlı olarak kanser hücrelerinin belirli nano partikül türleri ile kolokalizasyonu 30 dk enjeksiyon sonrası olarak gözlenmiştir. 120 dk ile, balık kuyruk bölgesinde bu nano tanecikleri tarafından kanser hücrelerinin hedefleme >% 80 vardı. Ancak, diğer nano tanecikleri için, kanser hücrelerinin minimal hedefleme gözlendi, kansere özgü ligand onların eksikliği ile tutarlı. Ayrıntılı sonuçlar ve analizler Peerzade ve ark.'da yer almaktadır (Bkz. Şekil 3 ve Şekil 4, Ek Şekil S12-S16 ve Ek Tablo S6)18. Bu sonuçlar, zebra balıklarında nano partiküllerin ksenogreftli HeLa hücrelerine diferansiyel hedeflemesini göstermiştir. Böylece, bu protokolü kullanarak, bir verimli tanıyarak ve vivo metastatik insan kanser hücrelerini hedef yeteneğine dayalı nano tanecikleri seçmek gerekir.
Şekil 1: Nano partiküllerin insan kanser hücrelerini hedef alma yeteneğini incelemek için protokol şeması. Şeffaf Casper embriyoları erkek ve dişi yetişkin balıkların üremesi yoluyla üretildi. Döllenmiş embriyolar petri kabında toplandı. 48 hpf'de RFP+ HeLa hücreleri perivitellin boşluğundaki zebra balığı embriyolarına enjekte edildi ve bazı yaşuyumlu embriyolar kontrol olarak enjekte edilmeden bırakıldı. 72 hpf'de metastatik RFP+ HeLa hücrelerine sahip embriyolar seçilerek iki gruba ayrıldı: (A) kontrol olarak araç (H2O) enjekte edildi ve(B) H2O'da asılı nano partiküller enjekte edildi. Üçüncü grup sadece nano tanecikleri ile enjekte edildi yaş uyumlu embriyolar oldu(C). Üç grup da floresan mikroskop altında görüntülendi. Gösterilen kutulu alan görüntülerin yakalandığı yerdir (Bkz. Şekil 2-Şekil 4). Yetişkin balıklar için ölçek çubukları = 1 mm ve embriyolar için = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Zebra balığı nano tanecikleri olmadan metastatik HeLa hücreleri ile nakledildi. Sadece kırmızı floresan HeLa hücreleri bireysel(A, D)veya kırmızı kanal ve mavi kanal(C, F)overlaid görüntüleri görünür edildi. Araç enjeksiyon kontrolü(B, E)ile embriyoda spesifik mavi floresan sinyalleri saptanmadı. (A-C)deki görüntüler, Şekil 1A'dakigibi kutulanmış balık kuyruğu bölgesini göstermektedir. (D-F)deki görüntüler kutulu alanların(A-C)genişlemiş görünümleridir. (A-C) = 200 μm ve içinde (D-F) = 100 μm. Ölçek çubukları bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zebra balıklarında kırmızı floresan HeLa hücreleri ve mavi floresan nano partiküllerin kolokalizasyonu. Zebra balığı kuyrukları hem düşük(A-C)hem de kırmızı ve mavi kanalda yüksek(D-F)büyütme de görüntülendi. Kırmızı floresan sinyalleri metastatik HeLa hücreleri ortaya(A, D), mavi floresan sinyalleri nano tanecikleri gösterdi ise (B, E). Hem kırmızı hem de mavi kanallardan(C, F)gelen kapatılan görüntüler HeLa hücrelerinin ve nano partiküllerin birlikte yerelleştirilmesini gösterir. Görüntüler ultra parlak silika nano tanecikleri ile enjeksiyon dan 3,5 saat sonra alınmıştır. (A-C)deki görüntüler, şekil 1B'dekutulanmış olarak balık kuyruğu bölgesini göstermektedir. (D-F)deki görüntüler kutulu alanların(A-C)genişlemiş görünümleridir. (A-C) = 100 μm ve içinde (D-F) = 50 μm ölçek çubukları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan HeLa hücreleri olmadan nano partiküller enjekte edilen zebra balığı. Mavi floresan nano tanecikleri bireysel embriyoların dolaşım sistemine dağıtıldı(B, E) ve kırmızı ve mavi kanalın(C, F)üstü kabardı görüntüleri. Zebra balığı embriyolarında görülen bazı arka plan floresanları dışında düşük veya yüksek büyütme(A, D)de spesifik kırmızı floresan görülemesi mümkün değildi. (A-C)deki görüntüler, şekil 1C'dekutulanmış olarak balık kuyruğu bölgesini göstermektedir. (D-F)deki görüntüler kutulu alanların(A-C)genişlemiş görünümleridir. (A-C) = 100 μm ve içinde (D-F) = 50 μm. Ölçek çubukları bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, nano partiküllerin metastatik insan kanser hücrelerini tanıma ve hedefleme yeteneğini test etmek için in vivo bir sistem olarak zebra balığı kullanır. Çeşitli etkenler deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyebilir. İlk olarak, embriyoların tam olarak 48 hpf geliştirilmiş olması gerekir. Embriyoların doğru gelişim evresi, insan kanser hücrelerinin nakline dayanmalarını ve hayatta kalmalarını sağlar. 48 hpf'den küçük embriyolar, daha yaşlı ve daha gelişmiş embriyolara göre önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranına sahiptir. İkinci olarak, kanser hücreleri mümkün olduğunca sağlıklı olarak sağlanmalıdır: 1) üstel büyüme aşamasında21, 2) taze hasat 30 dk-1 saat hemen transplantasyon önce, ve 3) her zaman sıcak tutulur. Üçüncüsü, iğne tıkanmamalıdır. Pipet HeLa hücreleri en az 20x iğne içine hücre karışımı yüklemeden önce. Dördüncü olarak, insan kanser hücrelerinin nakli ve nano partiküllerin enjeksiyonu için farklı tipte iğneler kullanılmalıdır. Nanopartikül enjeksiyonu için iğne keskin ve ince ise insan hücre nakli için iğne, hücre tıkanmasını önlemek için bir açı ile, nispeten geniştir. Beşincisi, enjeksiyonun yeri farklıdır. İnsan hücrelerinin nakli için yer perivitelline kavite, ancak nanopartikül enjeksiyonu için, iğne göz arkasına takılmalıdır, zenginleştirilmiş kılcal damarlar vardır. Son olarak, transplantasyon yapan bireyin becerisi önemlidir. Deneyimli bir birey doğru perivitelline kavite uzaya HeLa hücreleri enjekte edebilir, deneyimsiz bir kişi genellikle tümör hücrelerinin ancak balık vücuduna yayıldı sarısı alana tümör hücreleri enjekte ederken. Benzer şekilde, embriyoların hayatta kalma oranı deneyimli bir birey tarafından ele edildiğinde çok daha yüksektir, embriyoların en az% 50 kanser hücreleri hayatta ile nakledilen.
Zebra balığı embriyoları genellikle 28,5 °C'de kuluçkaya yatsa da, insan kanser hücrelerinin hayatta kalmak ve göç etmek için daha yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyması22,23. Hem balık embriyolarının hem de insan kanser hücrelerinin hayatta kalmasını sağlamak için, insan kanser hücreleri ile nakledilen embriyolar 35.5 °C'de kuluçkaya yatırılır. Bu yumurta kesesi içine kanser hücreleri teslim etmek daha kolay olsa da, ancak dolaşım sistemine yayıldı. Bu nedenle, perivitelline kavite altında vaskülarize alana kanser hücrelerinin enjekte etmek için intravasasyon ve kanser hücrelerinin yayılmasını sağlamak için önemlidir. Ayrıca, enjeksiyon ve görüntüleme sırasında embriyoları anestezi ederken çok fazla veya çok konsantre MS222 eklememeye dikkat edilmelidir. Nano partiküllerin görüntülenmesi ve görüntülenmesinde yardımcı olmak için AB balığı yerine Casper zebra balığı seçildi. Casper balık Nacre ve Roy için melanosit ve iridofor yoksun bir çift mutant, AB balık14ile karşılaştırıldığında artan şeffaflık sonuçlanan . Casper zebra balığının şeffaflığı, nano partiküllerin dolaşımdaki yayılmasını niçin izlenmesini ve nano partiküllerin kanser hücrelerine hedef lanmasını sağlar. Bu protokolün zorluğu, deneyimsiz bir bireyin insan kanser hücrelerinin naklini gerçekleştirmesi durumunda embriyoların nispeten yüksek mortalite oranıdır. İlginçtir, gözün arkasında biraz nano tanecikleri enjeksiyonnispeten iyi tolere edilir. Bu durum tümör hücre naklinde kullanılan iğnelere kıyasla daha ince iğnelerin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Insan kanser hücrelerine zarar önlemek için, bir geniş açıklıklar ile iğne ler kullanmanız gerekir, ama bu uygun olmayan ele eğer embriyoların hasara yol açabilir.
Bu protokol, casper zebra balığı nın metastatik kanser hücrelerinin in vivo ile işlevselleştirilmiş nano partikülleri ile hedeflenemesini görselleştirmek için kullanılır. Bu tözönemli bir avantajı bu araştırmacılar nano tanecikleri ile kanser hücrelerinin etkileşimini izlemek için zebra balığı gelişimi boyunca gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için izin verir. Aslında, yüksek fecundity ve hızlı gelişimi nedeniyle, zebra balığı araştırmacı sadece birkaç gün içinde sonuç elde etmenizi sağlar18,19,20,24. Ayrıca, bu titreşme de en embriyolar nanopartikül belirli bir tür enjeksiyondan sonra ölmek eğer daha fazla araştırma toksik nano tanecikleri ortadan kaldırılmasına olanak sağlar. Zebra balığı bir memeli olmamasına rağmen, hızlı ve ekonomik bir şekilde nano tanecikleri çok sayıda seçimi kolaylaştırır, büyük hayvanlar ve klinik testler de downstream çalışmalar için yararlı bilgiler sağlayan. Birlikte ele alındığında, zebra balığı kansere özgü hedefleme yoluyla erken teşhis ve kanser hücrelerinin potansiyel imha için uygun nanoproblar seçmenize yardımcı olarak nanotıp ve nanoteknoloji bir etki yapıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. NanoScience Solutions, LLC (STTR NIH R41AI142890 hibe alıcısı) ilgi beyan eder. Diğer tüm yazarlar çıkar çatışması beyan etmez.
Acknowledgments
Yazarlar Bayan Kaylee Smith, Bayan Lauren Kwok ve Bay Alexander Floru'ya taslağı okudukleri için teşekkür eder. H.F. NIH (CA134743 ve CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) ve St. Baldrick Vakfı'ndan hibe desteği kabul eder. F.J.F.L. Boston Üniversitesi İnovasyon Merkezi-BUnano Çapraz Disiplin Eğitimi Kanser için Nanoteknoloji (XTNC) bir burs kabul eder. I.S, NSF desteğini (cbet 1605405 hibe) ve NIH R41AI142890'ı kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
