Summary
Описанный здесь метод использования эмбрионов зебры для изучения способности функциональных наночастиц для целевой человеческих раковых клеток in vivo. Этот метод позволяет проводить оценку и отбор оптимальных наночастиц для будущих испытаний на крупных животных и в клинических испытаниях.
Abstract
Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес в области наномедицины. Модели животных In vivo необходимы для приведения нанотехнологий к его биомедицинскому применению. Мышь представляет собой традиционную модель животных для доклинкического тестирования; однако, мыши относительно дороги для того чтобы держать и имеют длинные экспериментальные циклы из-за лимитированного потомства от каждой матери. Зебрафиш стала мощной модельной системой для развития и биомедицинских исследований, включая исследования рака. В частности, благодаря оптической прозрачности и быстрому развитию эмбрионы зебры хорошо подходят для мониторинга поведения раковых клеток и их взаимодействия с микроокнироникой в режиме реального времени. Этот метод был разработан для последовательного введения раковых клеток человека и функционализированных наночастиц в прозрачных эмбрионах Каспер зебры и мониторинга распознавания in vivo и ориентации раковых клеток наночастицами в режиме реального времени. Этот оптимизированный протокол показывает, что флуоресцентно помеченные наночастицы, которые функционируют с группами фолиевой кислоты, могут конкретно распознавать и таргетировать метастатические клетки рака шейки матки человека, помеченные другим флуорохромом. Процесс распознавания и таргетинга может произойти уже через 30 минут после вятия проверенных наночастиц. Весь эксперимент требует только разведения нескольких пар взрослых рыб и занимает менее 4 дней. Кроме того, эмбрионы зебры не имеют функциональной адаптивной иммунной системы, что позволяет присвещать широкий спектр раковых клеток человека. Таким образом, полезность описанного здесь протокола позволяет тестировать наночастицы на различных типах раковых клеток человека, облегчая отбор оптимальных наночастиц в каждом конкретном контексте рака для будущего тестирования у млекопитающих и клиники.
Introduction
Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес как для физиков, так и для биомедицинских исследователей. Появление наномедицины привело к разработке нескольких наночастиц, таких как те, которые спрягаются с таргетингом лигандов и/или химиотерапевтическихпрепаратов 1,,2,,3. Добавленные свойства наночастиц позволяют их взаимодействие с биологической системой, зондирование и мониторинг биологических событий с высокой эффективностью и точностью наряду с терапевтическим применением. Наночастицы оксида золота и железа в основном используются в компьютерной томографии и магнитно-резонансной томографии, соответственно. В то время как энзиматическая деятельность наночастиц золота и оксида железа позволяет обнаруживать раковые клетки с помощью колоритных анализов, флуоресцентные наночастицы хорошо подходят для применения изображений in vivo4. Среди них, ультрабелые флуоресцентные наночастицы особенно полезны, из-за их способности обнаруживать рак на ранних стадиях с меньшим количеством частиц и снижениетоксичности 5.
Несмотря на эти преимущества, наночастицы требуют экспериментов с использованием моделей животных in vivo для выбора подходящих наноматериалов и оптимизации процесса синтеза. Кроме того, как и наркотики, наночастицы полагаются на модели животных для доклинического тестирования, чтобы определить их эффективность и токсичность. Наиболее широко используемой доклинической моделью является мышь, которая является млекопитающим, содержание которого стоит относительно дорого. Для исследований рака, либо генетически модифицированных мышей или ксенотрансплантированных мышей, как правило,используются 6,7. Продолжительность этих экспериментов часто охватывает от нескольких недель до нескольких месяцев. В частности, для исследований метастазирования рака раковые клетки непосредственно вводятся в кровеносную систему мышей в таких местах, как веныхвоста и селезенки 8,,9,,10. Эти модели представляют собой только конечные стадии метастазирования, когда опухолевые клетки экстравазают и колонизируют отдаленные органы. Кроме того, из-за проблем с видимостью, это особенно сложно контролировать миграцию опухолевых клеток и наночастиц ориентации опухолевых клеток у мышей.
Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной позвоночной системой для исследований рака из-за его высокой плодовитости, низкой стоимости, быстрого развития, оптической прозрачности игенетических консерваций 11,,12. Еще одним преимуществом зебры над моделью мыши является оплодотворение рыбьих яиц ex utero, что позволяет контролировать эмбрионы на протяжении всего их развития. Эмбриональное развитие быстро у зебры, и в течение 24 часов послеферетия (hpf), позвоночных плоскости тела ужесформировано 13. К 72 л.с. яйца вылупляются из хориона, переходя от эмбриональной к стадии жарки. Прозрачность зебры, штамм Каспер, в частности 14, предоставляет уникальную возможность визуализировать миграцию раковых клеток и их распознавания и ориентации наночастиц в живом животном. Наконец, зебрафиш развивать свою врожденную иммунную систему на 48 л.с., с адаптивной иммунной системы отстает и только становится функциональным на 28 днейпослеференции 15. Этот разрыв во времени идеально подходит для трансплантации различных типов раковых клеток человека в эмбрионы зебры, не испытывая иммунного отторжения.
Описанный здесь метод, который использует прозрачность и быстрое развитие зебры, чтобы продемонстрировать признание и ориентацию раковых клеток человека флуоресцентными наночастицами in vivo. В этом анализе, раковые клетки шейки матки человека (клетки HeLa) генетически модифицированные, чтобы выразить красный флуоресцентный белок были введены в васкуляризованной области в перивителлинной полости 48 л.с. эмбрионов. После 20-24 ч, heLa клетки уже распространились по всей эмбрионов через систему кровообращения рыб. Эмбрионы с явными метастазами были микроинъектированы с 0,5 нл раствора наночастиц прямо за глазом, где находится богатая капиллярная кровать. Используя этот метод, ультрабрайт флуоресцентные наночастицы кремнезема могут ориентироваться на клетки HeLa так быстро, как 20-30 мин постинъекции. Благодаря своей простоте и эффективности, зебрафиш представляет собой надежную модель in vivo для тестирования различных наночастиц на их способность ориентироваться на конкретные раковые клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Медицинской школе Бостонского университета в соответствии с протоколом No: PROTO201800543.
1. Поколение эмбрионов Каспер зебры
- Выберите взрослых рыб Каспер, которые по крайней мере 3 месяцев для естественного разведения для создания прозрачных эмбрионов Каспер зебры.
- Заполните двухкамерные брачные резервуары рыбной водой вечером, разделите верхние резервуары с помощью разделителей, поместите одну самку рыбы в одну сторону камеры и одну или две самки рыбы на другую сторону камеры и оставьте рыбу, отделенную на ночь разделителями.
- Вытащите разделители на следующее утро в 8:00 утра, когда свет на. Добавьте искусственные обогатительный завод и слегка наклоните верхнюю камеру, чтобы создать неглубокую площадь воды. Разрешить рыбе размножаться в течение 3-4 ч.
- Поднимите верхние камеры брачных резервуаров, которые содержат рыбу и вернуть их в свои оригинальные резервуары.
- Собирайте яйца, расположенные в нижних камерах, заливая воду через сетчатую сетку. Перенесите яйца в стерильную чашку Петри с плотностью не более 200 яиц на тарелку. Удалите мертвые или неутверейтеные яйца и заполните блюдо 2/3, наполненное пресной рыбной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оплодотворенные и здоровые яйца должны быть полупрозрачными и круглыми. Любые яйца, которые облачно, белый, или изуродованы должны быть удалены. Рыбная вода получается из аквариумов на рыбном объекте. - Инкубация эмбрионов в инкубаторе при 28,5 градусов по Цельсию за ночь.
- Отбелить эмбрионы на следующее утро с помощью стандартного протокола, как описано в Зебрафиш Книга16, и положить эмбрионы обратно в инкубатор (необязательный шаг).
- Возьмите 24 л.с. эмбрионов из инкубатора во второй половине дня и dechorionate эмбрионов с помощью проназ.
- Удалите как можно больше рыбной воды из эмбрионов в чашке Петри и добавьте в блюдо несколько капель проназового раствора (1 мг/мл в рыбной воде). Аккуратно закружить чашку Петри. После того, как хорионы проявляют признаки распада, пипетки эмбрионов вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать хорионов, чтобы освободить эмбрионы.
- Добавить свежую рыбную воду сразу же в чашку Петри, чтобы прекратить процесс, как только большинство эмбрионов из хорионов. Промыть эмбрионы 3x больше с помощью рыбной воды, чтобы удалить плавающие хорионы. Верните эмбрионы в инкубатор.
2. Подготовка раковых клеток человека к трансплантации
- Установите температуру инкубатора ровно до 35,5 градусов по Цельсию. Мониторинг инкубатора для обеспечения стабильной и стабильной температуры с помощью термометра внутри инкубатора.
- Автоклав 1 л рыбной воды в стеклянной бутылке. Сделайте 3% раствор агарозы, добавив 3 г агарозы электрофорезного сорта в 100 мл автоматической рыбной воды и микроволновой воды до полного растворения агарозы.
- Налейте горячий раствор агарозы в чашку Петри, пока она не будет заполнена на 3/4. Поместите микроинъекцию плесени на агарозу. Убедитесь, что плесень не находится в контакте с нижней части чашки Петри и не пузырьки форме под.
- Разрешить решение затвердеть и тщательно удалить плесень из тарелки. Заполните тарелку с автоклавной рыбной водой и храните тарелку при 4 градусах Цельсия. Довоенной агарозной тарелки и рыбной воды в инкубаторе 35,5 градусов по Цельсию перед сбором клеток HeLa.
- Потяните 1,0 мм O.D. x 0,78 мм борозиликатные стеклянные капилляры на пипетке с использованием следующих настроек: давление на 500, тепло на 560, тянуть на 100, скорость на 100, и время / задержка в 200. Храните иглы на путте в большой чашке Петри, которая была вытерта этанол полотенцем.
ВНИМАНИЕ: Вытащил иглы очень острые и хрупкие. Используйте осторожность при обработке. - Приготовьте стоковый раствор трикаина метансульфоната (MS222, 4 мг/мл) путем растворения MS222 в автоклавную рыбью воду. Вихрь задолго до использования. Разбавить раствор бульона MS222 1:100 в рыбной воде (т.е. добавить 200 МКЛ раствора бульона MS222 до 20 мл рыбной воды до конечной концентрации 40 мкг/мл) для обезболивать эмбрионы для следующих процедур.
- Культура hLabel HeLa клетки путем PLenti6.2_miRFP670 с лентивирусом с помощью протокола описано17. Урожай RFP' HeLa клетки 30 мин-1 ч до трансплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие клетки HeLa были выучены в инкубаторе культуры тканей до 70% стечения в полной среде роста (DMEM средний с 10% FBS) на 37 C дополнено 5% CO2.- Удалите среду клетки HeLa путем устремления в капюшоне культуры ткани. Кратко промойте слой клетки с стерильным PBS для того чтобы извлечь все следы сыворотки.
- Добавьте 3,0 мл стерильного раствора трипсина-ЭДТА в колбу Т-75 и поместите клетки обратно в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 3-5 минут для облегчения энзиматического пищеварения. Наблюдайте за колбой под микроскопом до тех пор, пока 80% клеток не станут подвешенны.
- Добавьте в колбу 6-8 мл среды полного роста. Соберите клетки в стерильную трубку 15 мл, аккуратно трубя. Центрифуга при 135 x g в течение 5 мин.
- Аспирировать сверхнатантные и повторное течение HeLa клеток в 3 мл полной среды роста. Повторите выше стиральный шаг 2x. Повторное использование клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитать клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра.
- Спин клетки вниз снова, удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в 1,5 мл микроцентрифуг трубки в концентрации 5 х 107 клеток / мл. Держите клетки в тепле, держа трубку в одной руке при транспортировке на рыбный объект.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите клетки в тепле, сохраняя клетки внутри инкубатора 35,5 градусов по Цельсию до или во время инъекций эмбрионов.
3. Трансплантация раковых клеток человека
- Очистите рабочую зону с помощью этанола полотенца перед трансплантацией (например, ножницы, пинцет, пластиковые пипетки, лезвия бритвы).
- Выровнять эмбрионы в канавках агарозной пластины с помощью пластиковой пипетки. Положите эмбрионы на бок с передней облицовкой вперед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рыбья вода покрывает эмбрионы. Установите некоторые эмбрионы в сторону, чтобы не вводить раковые клетки и использовать в качестве контроля. - Включите источник воздуха и микроинъектор. Возьмите HeLa клетки из инкубатора и пипетки клетки вверх и вниз 20-30x с помощью P200 отзыв. Загрузите 3 МКЛ клеточной смеси сразу в иглу с помощью наконечника загрузки геля с разрезанной концом. Аккуратно вставьте наконечник к резкому нижнему концу иглы. При необходимости встряхните иглу, чтобы клеточная смесь движется вниз по игле, чтобы заполнить острый конец.
- Вставьте иглу в держатель иглы. Используйте пару пинцетов, чтобы тщательно открыть кончик иглы. Отрегулируйте давление и продолжительность времени на микроинъекторе, чтобы вытолкнуть все пузырьки воздуха внутри кончика иглы. Уменьшите время давления и продолжительности инъекций до тех пор, пока размер капель инъекции не будет 1 нл.
- Поместите инъекционной пластины под микроскопом в соответствующем положении, чтобы желток стороне эмбрионов, стоящих перед иглой. Обезболивать эмбрионы, добавляя пять капель разбавленного раствора MS222 (40 мкг/мл).
- Распоистите инжектор и позвольте игле коснуться перивителиновой полости каждого эмбриона.
- Введите клеточную смесь в эмбрионы в васкуляризированной области под полостью перивителина, нажав на педаль стопы.
- Используйте недоминантную руку, чтобы переместить инъекционной пластины к следующему эмбриону. Используйте доминирующую руку, чтобы расширить и втянуть инжектор при нажатии на педаль ноги одновременно, чтобы продолжить инъекцию. Pipette несколько капель стерильной воды рыбы на эмбрионы, которые были введены. Как только инъекция всех эмбрионов на тарелку будет завершена, смойте эмбрионы стерильной рыбной водой, положите их на стерильную чашку Петри и немедленно переместите их в инкубатор 35,5 градусов по Цельсию.
- После 3 часов, изучить вводили эмбрионы и удалить мертвые.
- Верните живые эмбрионы в инкубатор 35,5 градусов по Цельсию и инкубировать их на 20-24 ч, чтобы клетки HeLa распространились от места инъекции к другим частям тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы хранятся в инкубаторе 35,5 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить выживание и миграцию раковых клеток человека, потому что клетки не очень хорошо себя делают при температуре 28,5 градусов по Цельсию, температура эмбрионов рыб, как правило, инкубируется.
4. Инъекция наночастиц или транспортного средства
- Обезболить пересаженые эмбрионы на следующее утро пятью каплями разбавленного раствора MS222. Не добавляйте слишком много MS222, потому что это убьет эмбрионы. Под флуоресцентным микроскопом тщательно подбирайте эмбрионы с метастазами хвоста клеток RFP' HeLa и помойте их в новую чашку Петри со стерильной рыбной водой.
- Сделайте иглы впрыска как ранее описано в разделе 2 используя следующие установки: давление на 500, жара на 645, вытяните на 60, скорость на 50, и время/задержка на 100.
- Следуйте процедурам шагами 3.1-3.3, чтобы выровнять эмбрионы и загрузить транспортное средство (например, H2O) или раствор наночастиц в иглу.
- Ввись 0,5 нл раствора 1 мг/мл наночастиц за глазом и продолжайте инъекцию, как описано в шагах 3,5-3,6(рисунок 1B). Это расположение за глазами обогащается капиллярами, что позволяет наночастицы, чтобы войти в циркуляцию.
- После аналогичной процедуры, вводить транспортное средство (например, H2O), который был использован для приостановки наночастиц в эмбрионы с Клетками HeLa пересажены и те, без (т.е. элементы управления) (Рисунок 1A, C).
- Инкубировать все инъекционные эмбрионы при 35,5 градусов по Цельсию.
5. Визуализация и отслеживание наночастиц и раковых клеток
- Изучите инъекционные эмбрионы под флуоресцентным микроскопом в 0, 30, 60, 90, 120, 180 и 210 мин после введения наночастиц для мониторинга их распределения в циркуляции и степени ориентации раковых клеток. Ориентация раковых клеток наночастицами может наблюдаться уже через 30 минут после влечения в зависимости от типа наночастиц испытания.
- Pipette 2-3 эмбрионов в чашку Петри и обездвижить их, добавив пять капель разбавленного раствора MS222 (40 мкг/мл). Как только эмбрионы перестанут плавать, удалите большую часть воды, чтобы позволить эмбрионам лежать на боку.
- Используйте пипетку с тонкой, мягкой кистью, прикрепленной к ее концу, чтобы выровнять эмбрионы, чтобы они лежали по бокам с передней облицовкой вперед и только один глаз виден.
- Изображение эмбрионов в красных, синих и ярких каналах при низком увеличении (2x), чтобы захватить весь эмбрион и повторить при более высоком увеличении (6,4x), чтобы захватить область хвоста. Сосредоточьте эмбрион под красным каналом, чтобы избежать кровотечения наночастиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы не должны двигаться во время визуализации. Любое движение приведет к размытым изображениям и невозможности перекрытия изображений из разных каналов. - Добавьте пресную рыбную воду эмбрионам сразу после визуализации и верните их в инкубатор. Повторите шаги 5.2-5.4, чтобы изображение эмбрионов в разных точках времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема протокола на рисунке 1 иллюстрирует общие процедуры этого исследования. Прозрачные Каспер мужской и женской взрослых рыб были выведены для создания эмбрионов (раздел 1). Клетки РППЗ HeLa вводились в васкуляризованную область под перивителиновой полостью эмбрионов зебры при 48 л.с., с необъективными эмбрионами в качестве элементов управления (раздел 3). Для людей, опытных в микроинъекции, выживаемость эмбрионов часто высока, по крайней мере 50% эмбрионов, пересаженных с раковыми клетками, выживших в инкубаторе 35,5 градусов по Цельсию, температура неоптимального для эмбрионов зебры, но необходимых для выживания и миграции раковых клеток человека. Клетки HeLa являются высокоинвазивными и могут интравазать и распространяться в хвостовой части эмбрионов так быстро, как 8 h постуинъекции. К 20-24 ч после трансплантации, 50% пересаженных эмбрионов показали признаки метастатического распространения клеток HeLa. Эти эмбрионы с метастазами хвоста раковых клеток были отобраны для экспериментов ниже по течению. На 72 л.с., эти эмбрионы были впоследствии введены за глазами либо с синими флуоресцентными наночастицами (раздел 4 и рисунок 1B) или исключительно с транспортным средством в качестве элементов управления (Рисунок 1A). Возрастные эмбрионы, вводимые с наночастицами, но без трансплантации раковых клеток, были второй группой элементов управления(рисунок 1C). Более подробную информацию об синтезе, подготовке и характеристике наночастиц можно получить см. Peerzade et al.18.
В 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 мин постинъекции наночастиц, вводили эмбрионы были проверены с помощью изображений, чтобы определить взаимодействие наночастиц с клетками RFP' HeLa, используя автомобиль вводили эмбрионов в качестве элементов управления. В частности, области хвоста зебры, в которые распространились клетки RFP' HeLa, были изображены при красном, синем и ярком освещении с помощью флуоресцентного микроскопа (раздел 5). Подробная характеристика способности ультрабрайт наночастиц для целевой ксенотрансплантированных раковых клеток в зебрафиш с течением времени показано на рисунке 5 Peerzade идр. 18. Красные точки, замеченные в хвосте эмбрионов, являются метастатическими раковыми клетками шейки матки человека, которые были видны как в эмбрионах, вводимых транспортным средством, так и внаночастицах (рисунок 2A, D; Рисунок 3A, D). Как и ожидалось, никаких специфических синих флуоресцентных сигналов не было обнаружено в эмбрионах с инъекцией только для автомобиля(рисунок 2B, E). Кроме того, когда изображения, снятые в красных и синих каналах были объединены, только красные раковые клетки в хвостовой области без каких-либо синих сигналовнаблюдались (рисунок 2C, F). Однако, в эмбрионах, которые были введены с ультрабрайт флуоресцентных наночастиц кремнезема, были синие точки в хвостах, сосредоточены вблизи и вокруг раковых клеток на 3,5 ч (Рисунок 3B, E). На наложенных изображениях, снятых с красных и синих каналов, красные клетки HeLa и синие наночастицы колокализованы, рассматриваются какрозовые точки (рисунок 3C, F). В тех эмбрионах, которые вводились исключительно с наночастицами, но не пересаживались с клетками HeLa, синие флуоресцентные частицы не концентрируются в каких-либо конкретных клетках или областях, но распределены относительно равномерно в кровеносную систему эмбрионов, подчеркивая кровеносные сосуды(рисунок 4B, E). Как и ожидалось, никаких специфических красных флуоресцентных сигналов не было обнаружено в этих эмбрионах, несмотря на некоторые слабые фоновыефлуоресцентные сигналы (рисунок 4A, C, D, F).
Этот протокол впоследствии был использован для тестирования различных типов наночастиц18,19,20. Колокализация раковых клеток с определенными типами наночастиц наблюдалась уже в 30 мин постинъекции в зависимости от свойств протестированных наночастиц. К 120 мин, было 80% ориентации раковых клеток этих наночастиц в хвостовой части рыбы. Тем не менее, для других наночастиц, минимальные ориентации раковых клеток было отмечено, в соответствии с их отсутствием рака конкретных лиганд. Подробные результаты и анализ включены в Peerzade et al. (см. рисунок 3 и рисунок 4, дополнительные цифры S12-S16 и дополнительную таблицу S6)18. Эти результаты продемонстрировали дифференциальное таргетинг наночастиц на ксенотрансплантированные клетки HeLa у зебры. Таким образом, используя этот протокол, следует быть в состоянии эффективно выбирать наночастицы на основе их способности распознавать и целевых метастатических раковых клеток человека in vivo.
Рисунок 1: Схема протокола для изучения способности наночастиц ориентироваться на раковые клетки человека. Прозрачные эмбрионы Каспера были созданы путем разведения мужской и женской взрослой рыбы. Оплодотворенные эмбрионы были собраны в чашку Петри. На 48 л.с., RFP' HeLa клетки были введены в эмбрионы зебры в полосте perivitelline, в результате чего некоторые возрастные эмбрионы не были введены в качестве элементов управления. На 72 л.с., эмбрионы с метастатическими клетками RFP' HeLa были отобраны и разделены на две группы: (A) вводили с транспортным средством (H2O) в качестве управления и (B) вводили с наночастицами приостановлено в H2O. Третья группа была возрастных эмбрионов, которые были введены с наночастицами в одиночку (C). Все три группы были изображены под флуоресцентным микроскопом. Показанная область коробки — это место, где были сняты изображения (см. рисунок 2-Рисунок 4). Масштаб баров для взрослых рыб 1 мм и для эмбрионов 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Зебрафиш пересажены с метастатическими клетками HeLa без наночастиц. Только красные флуоресцентные клетки HeLa были видныв отдельных( A, D ) или наложенные изображения красного канала и синего канала (C, F). Никаких специфических синих флуоресцентных сигналов не было обнаружено в эмбрионе с контролем впрыска транспортного средства(B, E). Изображения в (A-C) показывают область хвоста рыбы в коробке, как на рисунке 1A. Изображения в (D-F) являются расширенные виды коробоных областях в (A-C). Масштаб баров в (A-C) 200 мкм и в (D-F) 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Колокализация красных флуоресцентных клеток HeLa и синих флуоресцентных наночастиц у зебры. Хвосты зебры были изображены как при низком(A-C),так и при высоком увеличении(D-F)в красном и синем канале. Красные флуоресцентные сигналы показали метастатические клетки HeLa (A, D), в то время как синие флуоресцентные сигналы показали наночастицы(B, E). Наложенные изображения с красных и синих каналов(C, F) показывают колокализацию клеток HeLa и наночастиц. Снимки были сделаны после 3,5 ч от инъекции с ультрабрайт кремнезема наночастиц. Изображения в (A-C) показывают область хвоста рыбы, как в коробке на рисунке 1B. Изображения в (D-F) являются расширенные виды коробоных областях в (A-C). Шкала баров в (A-C) - 100 мкм и в (D-F) - 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Зебрафиш вводят с наночастицами без человеческих клеток HeLa. Синие флуоресцентные наночастицы были распределены в кровеносную систему эмбрионов в отдельных (B, E) и наложенные изображения красного и синего канала (C, F). Никаких конкретных красных флуоресценции не было видно на любом низком или высоком увеличении (A, D), за исключением некоторых фоновых флуоресценции, общие для эмбрионов зебры. Изображения в (A-C) показывают область хвоста рыбы, как в коробке на рисунке 1C. Изображения в (D-F) являются расширенные виды коробоных областях в (A-C). Масштаб баров в (A-C) 100 мкм и в (D-F) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь использует зебры в качестве системы in vivo для проверки способности наночастиц распознавать и целевых метастатических раковых клеток человека. На успешное выполнение экспериментов может повлиять несколько факторов. Во-первых, эмбрионы должны быть полностью разработаны при 48 л.с. Правильная стадия развития эмбрионов позволяет им выдержать и пережить трансплантацию раковых клеток человека. Эмбрионы моложе 48 л.с. имеют значительно более низкую выживаемость по сравнению со старыми и более развитыми эмбрионами. Во-вторых, раковые клетки должны быть как можно более здоровыми, гарантируя, что они находятся: 1)в экспоненциальной фазе роста 21, 2) свежесобранные 30 мин-1 ч непосредственно перед трансплантацией, и 3) хранится в тепле во все времена. В-третьих, игла не должна быть забита. Pipette heLa клетки вверх и вниз, по крайней мере 20x перед загрузкой клеточной смеси в иглу. В-четвертых, различные типы игл должны использоваться для трансплантации раковых клеток человека и инъекций наночастиц. Игла для трансплантации клеток человека является относительно широким, с углом, чтобы избежать засорения клеток, в то время как игла для инъекций наночастиц является резким и тонким. В-пятых, расположение инъекции отличается. Местом трансплантации клеток человека является перивителиновая полость, но для инъекций наночастиц игла должна быть вставлена за глазом, где есть обогащенные капилляры. Наконец, мастерство человека, который выполняет трансплантации вопросы. Опытный человек может точно вводить клетки HeLa в пространство полостей перивителла, в то время как неопытный человек часто вводит опухолевые клетки в область желтка, где опухолевые клетки едва распространяются в организм рыбы. Аналогичным образом, выживаемость эмбрионов гораздо выше, когда обрабатываются опытным человеком, по крайней мере 50% эмбрионов пересажены с раковыми клетками выживших.
Хотя эмбрионы зебры, как правило, инкубируется при температуре 28,5 градусов по Цельсию, раковые клетки человека требуют более высоких температур,чтобы выжить и мигрировать 22,23. Чтобы обеспечить выживание как эмбрионов рыб, так и раковых клеток человека, эмбрионы, пересаженные раковыми клетками человека, инкубированы при 35,5 градусов по Цельсию. Хотя это может быть легче доставить раковые клетки в желточный мешок, они едва распространились в кровеносной системе. Поэтому крайне важно вводить раковые клетки в васкуляризованную область под перивителиновой полостью для обеспечения интравазии и распространения раковых клеток. Кроме того, необходимо позаботиться о том, чтобы не добавлять слишком много или слишком концентрированный MS222 при анестезии эмбрионов во время инъекций и визуализации. Чтобы помочь в визуализации и визуализации наночастиц, Каспер зебрафиш был выбран вместо рыбы AB. Рыба Каспер является двойным мутантом для Накре и Роя, что не хватает меланоцитов и иридофоров, в результате чего повышенная прозрачность по сравнению с ABрыбы 14. Прозрачность Зебры Каспера позволяет контролировать распространение наночастиц в обращении и таргетинг наночастиц на раковые клетки. Проблема этого протокола заключается в относительно высоком уровне смертности эмбрионов, если неопытный человек выполняет трансплантацию раковых клеток человека. Интересно, что инъекция наночастиц немного за глазами относительно хорошо переносится. Это, вероятно, из-за использования тонких игл по сравнению с иглами, используемыми для трансплантации опухолевых клеток. Чтобы избежать повреждения раковых клеток человека, необходимо использовать иглы с широкими отверстиями, но это может привести к повреждению эмбрионов, если обращаться ненадлежащим образом.
Этот протокол использует Каспер зебрафиш для визуализации ориентации метастатических раковых клеток с функциональными наночастицами in vivo. Основным преимуществом этого анализа является то, что он позволяет исследователям выполнять изображения в режиме реального времени в течение развития зебры для мониторинга взаимодействия раковых клеток с наночастицами. В самом деле, из-за его высокой плодовитости и быстрого развития, зебрафиш позволяет исследователю получить результаты всегоза afew дней 18,19,20,24. Кроме того, этот анализ также позволяет вывести токсичные наночастицы из дальнейших исследований, если большинство эмбрионов умирают после инъекции определенного типа наночастиц. Хотя зебрафиш не является млекопитающим, он облегчает выбор большого количества наночастиц в быстрой и экономичной манере, предоставляя полезную информацию для исследований вниз по течению в крупных животных и клинических испытаний. В совокупности зебрафиш оказывает влияние на наномедицину и нанотехнологии, помогая выбрать подходящие нанопробы для раннего выявления и потенциального уничтожения раковых клеток с помощью таргетирования рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S. заявляет об интересе к NanoScience Solutions, LLC (получатель гранта STTR NIH R41AI142890). Все остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят г-жу Кейли Смит, г-жу Лорен Квок и г-на Александра Флору за корректорирование рукописи. H.F. признает грантовую поддержку со стороны NIH (CA134743 и CA215059), Американского онкологического общества (RSG-17-204 01-TBG) и Фонда Святого Болдрика. F.J.F.L. признает стипендию от Бостонского университета Инновационный центр-BUnano междисциплинарной подготовки в области нанотехнологий для рака (XTNC). I.S признает поддержку NSF (грант CBET 1605405) и NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
