Summary
Descrito aqui é um método para utilizar embriões de zebrafish para estudar a capacidade de nanopartículas funcionalizadas para atingir células cancerígenas humanas in vivo. Este método permite a avaliação e seleção de nanopartículas ideais para testes futuros em animais de grande porte e em ensaios clínicos.
Abstract
Desenvolver nanopartículas capazes de detectar, atingir e destruir células cancerígenas é de grande interesse no campo da nanomedicina. Modelos in vivo animais são necessários para fazer a ponte da nanotecnologia à sua aplicação biomédica. O camundongo representa o modelo animal tradicional para testes pré-clínicos; no entanto, os ratos são relativamente caros de manter e têm longos ciclos experimentais devido à prole limitada de cada mãe. O zebrafish emergiu como um poderoso sistema modelo para pesquisas biomédicas e de desenvolvimento, incluindo pesquisas sobre câncer. Em particular, devido à sua transparência óptica e rápido desenvolvimento, os embriões de zebrafish são adequados para o monitoramento in vivo em tempo real do comportamento das células cancerígenas e suas interações com seu microambiente. Este método foi desenvolvido para introduzir sequencialmente células cancerígenas humanas e nanopartículas funcionalizadas em embriões transparentes de zebrafish Casper e monitorar o reconhecimento in vivo e o direcionamento das células cancerosas por nanopartículas em tempo real. Este protocolo otimizado mostra que nanopartículas fluorescentes rotuladas, que são funcionalizadas com grupos de folato, podem reconhecer e atingir especificamente células cancerígenas colossticas do colo do útero, rotuladas com um fluorocromo diferente. O processo de reconhecimento e segmentação pode ocorrer já em 30 minutos de pós-injeção das nanopartículas testadas. Todo o experimento requer apenas a criação de alguns pares de peixes adultos e leva menos de 4 dias para ser concluído. Além disso, os embriões de zebrafish carecem de um sistema imunológico adaptativo funcional, permitindo o engrafamento de uma ampla gama de células cancerígenas humanas. Assim, a utilidade do protocolo aqui descrito permite o teste de nanopartículas em vários tipos de células cancerígenas humanas, facilitando a seleção de nanopartículas ideais em cada contexto específico de câncer para testes futuros em mamíferos e na clínica.
Introduction
O desenvolvimento de nanopartículas capazes de detectar, direcionar e destruir células cancerígenas é de grande interesse tanto para físicos quanto para pesquisadores biomédicos. O surgimento da nanomedicina levou ao desenvolvimento de várias nanopartículas, como aquelas conjugadas com ligantes de alvo e/ou quimioterapia1,,2,,3. As propriedades adicionadas das nanopartículas permitem sua interação com o sistema biológico, detectando e monitorando eventos biológicos com alta eficiência e precisão, juntamente com aplicações terapêuticas. As nanopartículas de óxido de ouro e ferro são usadas principalmente em tomografia computadorizada e aplicações de ressonância magnética, respectivamente. Enquanto as atividades enzimáticas das nanopartículas de óxido de ferro e ouro permitem a detecção de células cancerosas através de assins de assinso colorimétricos, as nanopartículas fluorescentes são adequadas para aplicações de imagem in vivo4. Entre elas, as nanopartículas fluorescentes ultra-francas são particularmente benéficas, devido à sua capacidade de detectar cânceres precocemente com menos partículas e toxicidades reduzidas5.
Apesar dessas vantagens, as nanopartículas requerem experimentação utilizando modelos in vivo animais para seleção de nanomateriais adequados e otimização do processo de síntese. Além disso, assim como as drogas, as nanopartículas dependem de modelos animais para testes pré-clínicos para determinar sua eficácia e toxicidades. O modelo pré-clínico mais utilizado é o rato, que é um mamífero cuja manutenção tem um custo relativamente alto. Para estudos de câncer, camundongos geneticamente modificados ou camundongos xenógrafos são tipicamente usados6,,7. A duração desses experimentos geralmente se estende de semanas a meses. Em particular, para estudos de metástase do câncer, as células cancerígenas são injetadas diretamente no sistema circulatório dos camundongos em locais como veias traseiras e baços8,,9,,10. Esses modelos representam apenas os estágios finais da metástase quando as células tumorais extravasam e colonizam órgãos distantes. Além disso, devido a problemas de visibilidade, é particularmente desafiador monitorar a migração de células tumorais e o direcionamento de nanopartículas de células tumorais em camundongos.
O zebrafish (Danio rerio) tornou-se um poderoso sistema vertebrado para a pesquisa do câncer devido à sua alta fecundidade, baixo custo, desenvolvimento rápido, transparência óptica e conservações genéticas11,12. Outra vantagem do zebrafish sobre o modelo de camundongos é a fertilização dos ovos de peixe ex utero, o que permite que os embriões sejam monitorados durante todo o seu desenvolvimento. O desenvolvimento embrionário é rápido em zebrafish, e dentro de 24 horas de pós-fertilização (hpf), o plano corporal vertebrado já formou13. Por 72 hpf, os ovos são eclodidos do acorde, transitando do embrionário para o estágio de fritura. A transparência do zebrafish, a cepa Casper em particular14,oferece uma oportunidade única para visualizar a migração de células cancerígenas e seu reconhecimento e direcionamento por nanopartículas em um animal vivo. Finalmente, os zebrafish desenvolvem seu sistema imunológico inato em 48 hpf, com o sistema imunológico adaptativo ficando para trás e ficando funcional apenas aos 28 dias após a fertilização15. Esta lacuna de tempo é ideal para o transplante de vários tipos de células cancerígenas humanas em embriões de zebrafish sem experimentar rejeições imunológicas.
Descrito aqui é um método que aproveita a transparência e o rápido desenvolvimento do zebrafish para demonstrar o reconhecimento e direcionamento das células cancerígenas humanas por nanopartículas fluorescentes in vivo. Neste ensaio, células cancerígenas cervicais humanas (células HeLa) geneticamente projetadas para expressar uma proteína fluorescente vermelha foram injetadas na área vascularizada na cavidade perivitelline de 48 hpf embriões. Após 20-24 h, as células HeLa já haviam se espalhado pelos embriões através do sistema circulatório de peixes. Embriões com metástase aparente foram microinjetados com ~0,5 nL de uma solução de nanopartículas logo atrás do olho, onde está localizado o rico leito capilar. Usando esta técnica, as nanopartículas de sílica fluorescentes ultrabright podem atingir células HeLa tão rapidamente quanto 20-30 min de pós-injeção. Devido à sua simplicidade e eficácia, o zebrafish representa um modelo in vivo robusto para testar uma variedade de nanopartículas por sua capacidade de atingir células cancerígenas específicas.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Boston University School of Medicine sob o protocolo #: PROTO201800543.
1. Geração de embriões de zebrafish Casper
- Escolha peixes casper adultos com pelo menos 3 meses de idade para reprodução natural para gerar embriões transparentes de zebrafish Casper.
- Encha tanques de acasalamento de duas câmaras com água de peixe à noite, separe os tanques superiores usando divisores, coloque um peixe macho em um lado da câmara e um ou dois peixes fêmeas para o outro lado da câmara, e deixe os peixes separados durante a noite por divisórias.
- Retire os divisores na manhã seguinte às 8:00 da manhã quando as luzes estiverem acesas. Adicione plantas de enriquecimento artificial e incline ligeiramente a câmara superior para criar uma área rasa de água. Deixe o peixe procriar por 3-4 h.
- Levante as câmaras superiores dos tanques de acasalamento que contêm os peixes e devolva-os aos tanques originais.
- Colete ovos localizados nas câmaras inferiores despejando a água através de uma rede de malha. Transfira ovos para uma placa de Petri estéril a uma densidade não superior a 200 ovos por prato. Remova qualquer ovo morto ou não fertilizado e encha o prato 2/3 cheio com água de peixe fresco.
NOTA: Os ovos fertilizados e saudáveis devem ser translúcidos e redondos. Todos os ovos nublados, brancos ou desfigurados devem ser removidos. A água dos peixes é obtida de tanques de peixes na instalação de peixes. - Incubar embriões na incubadora a 28,5 °C durante a noite.
- Branquear os embriões na manhã seguinte usando o protocolo padrão, conforme descrito no Livro zebrafish16, e colocar os embriões de volta à incubadora (passo opcional).
- Tire os embriões de 24 hpf da incubadora à tarde e descorrionato os embriões usando pronase.
- Retire o máximo de água de peixe possível dos embriões na placa de Petri e adicione algumas gotas da solução de pronase (1 mg/mL na água do peixe) ao prato. Gire suavemente a placa de Petri. Uma vez que os acordes mostram sinais de desintegração, pipeta os embriões para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os acordes para liberar os embriões.
- Adicione água de peixe fresco imediatamente na placa de Petri para terminar o processo uma vez que a maioria dos embriões estão fora dos acordes. Enxágüe os embriões 3x mais usando água de peixe para remover os acordes flutuantes. Devolva os embriões à incubadora.
2. Preparação de células cancerígenas humanas para transplante
- Coloque a temperatura da incubadora para exatamente 35,5 °C. Monitore a incubadora para garantir uma temperatura consistente e estável usando um termômetro dentro da incubadora.
- Autoclave 1 L de água de peixe em uma garrafa de vidro. Faça uma solução de 3% de agarose adicionando 3 g de agarose de grau de eletroforese a 100 mL de água de peixe autoclaved e microwaving até que a ágarose seja completamente dissolvida.
- Despeje a solução de agarose quente em uma placa de Petri até que esteja 3/4 cheia. Coloque o molde de microinjeção na agarose. Certifique-se de que o molde não está em contato com a parte inferior da placa de Petri e nenhuma bolha se forma por baixo.
- Deixe a solução solidificar e remova cuidadosamente o molde da placa. Encha a placa com água de peixe autoclaved e armazene a placa a 4 °C. Pré-aquecimento a placa de agarose e água de peixe na incubadora de 35,5 °C antes de colher células HeLa.
- Puxe 1,0 mm O.D. x 0,78 mm borossilicate capilares de vidro em um puxador de pipeta usando as seguintes configurações: pressão em 500, calor em 560, puxar em 100, velocidade em 100 e tempo/atraso em 200. Guarde agulhas na massa em uma grande placa de Petri que foi limpa com uma toalha de etanol.
ATENÇÃO: As agulhas puxadas são muito afiadas e frágeis. Tenha cuidado ao manusear. - Prepare uma solução de estoque de metanos de tricaine (MS222, 4 mg/mL) dissolvendo MS222 em água de peixe autoclaved. Vórtice bem antes de usar. Solução de estoque MS222 Diluir 1:100 em água de peixe (ou seja, adicionar 200 μL de solução de estoque MS222 a 20 mL de água de peixe a uma concentração final de 40 μg/mL) para anestesiar embriões para os seguintes procedimentos.
- Cultura hLabel HeLa cells, transduzindo-as com PLenti6.2_miRFP670 lentivírus usando o protocolo descrito17. Colheita RFP+ Células HeLa 30 min-1 h antes do transplante.
NOTA: As células HeLa humanas foram cultivadas em uma incubadora de cultura tecidual de até 70% de confluência em meio de crescimento completo (médio DMEM com 10% de FBS) a 37 °C suplementado com 5% de CO2.- Remova o meio celular HeLa por aspiração em uma capa de cultura de tecido. Enxágue brevemente a camada celular com PBS estéril para remover todos os traços do soro.
- Adicione 3,0 mL de solução Trippsin-EDTA estéril a um frasco T-75 e coloque as células de volta na incubadora de cultura tecidual de 37 °C por 3-5 minutos para facilitar a digestão enzimática. Observe o frasco sob o microscópio até que ~80% das células fiquem suspensas.
- Adicione 6-8 mL de meio de crescimento completo no frasco. Colete as células em um tubo estéril de 15 mL por pipetação suave. Centrífuga a 135 x g por 5 min.
- Aspire as células HeLa supernascidas e resuspendas em 3 mL de meio de crescimento completo. Repita o passo de lavagem acima 2x. Resuspend as células em 1 mL de meio de crescimento completo e conte as células sob o microscópio usando um hemótmetro.
- Gire as células novamente, remova o supernascer e resuspenja as células em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL a uma concentração de 5 x 107 células/mL. Mantenha as células aquecidas segurando o tubo em uma mão ao transportar para a instalação de peixes.
NOTA: Mantenha sempre as células aquecidas armazenando as células dentro da incubadora de 35,5 °C antes ou durante a injeção dos embriões.
3. Transplante de células cancerígenas humanas
- Limpe a área de trabalho usando toalhas de etanol antes do transplante (por exemplo, tesoura, pinças, pipetas plásticas, lâminas de barbear).
- Alinhe embriões dentro das ranhuras da placa de agarose usando uma pipeta de plástico. Coloque embriões ao lado com o anterior voltado para a frente.
NOTA: Certifique-se de que a água do peixe cubra os embriões. Reserve alguns embriões para não injetar células cancerígenas e use como controles. - Ligue a fonte de ar e o microinjetor. Tire as células HeLa da incubadora e pipeta as células para cima e para baixo 20-30x usando uma ponta P200. Carregue 3 μL de mistura celular imediatamente em uma agulha usando uma ponta de carregamento de gel com uma extremidade de corte. Insira cuidadosamente a ponta na extremidade inferior afiada da agulha. Se necessário, agite a agulha para garantir que a mistura celular se mova para baixo da agulha para encher a ponta afiada.
- Insira a agulha no suporte da agulha. Use um par de pinças para abrir cuidadosamente a ponta da agulha. Ajuste a pressão e a duração do tempo no microinjetor para empurrar todas as bolhas de ar dentro da ponta da agulha. Reduza o tempo de duração da pressão e da injeção até que o tamanho das gotículas de injeção seja ~1 nL.
- Coloque a placa de injeção sob o microscópio em uma posição apropriada para ter o lado da gema dos embriões voltados para a agulha. Anestesiar os embriões adicionando cinco gotas da solução MS222 diluída (40 μg/mL).
- Posicione o injetor e deixe que a agulha toque na cavidade perivitelline de cada embrião.
- Injete a mistura celular nos embriões na área vascularizada sob a cavidade perivitelline pressionando o pedal do pé.
- Use a mão nondominante para mover a placa de injeção para o próximo embrião. Use a mão dominante para estender e retrair o injetor enquanto pressiona o pedal do pé simultaneamente para continuar a injeção. Pipeta algumas gotas de água de peixe estéril em embriões que foram injetados. Uma vez que a injeção de todos os embriões na placa é concluída, lave os embriões com água de peixe estéril, coloque-os em uma placa de Petri estéril e mova-os imediatamente para a incubadora de 35,5 °C.
- Depois de 3h, examine os embriões injetados e remova os mortos.
- Devolva os embriões vivos à incubadora de 35,5 °C e incuba-os por 20-24 h para permitir que as células HeLa se espalhem do local da injeção para outras partes do corpo.
NOTA: Os embriões são mantidos na incubadora de 35,5 °C para permitir a sobrevivência e migração de células cancerígenas humanas porque as células não se sairam bem a 28,5 °C, a temperatura dos embriões de peixes são normalmente incubadas.
4. Injeção de nanopartículas ou veículo
- Anestesiar os embriões transplantados na manhã seguinte com cinco gotas de solução MS222 diluída. Não adicione muito MS222, porque isso vai matar os embriões. Sob um microscópio fluorescente, pegue cuidadosamente embriões com metástase traseira de células RFP+ HeLa e coloque-os em uma nova placa de Petri com água de peixe estéril.
- Faça as agulhas de injeção como descrito anteriormente na seção 2 usando as seguintes configurações: pressão a 500, calor a 645, puxar a 60, velocidade em 50 e tempo/atraso em 100.
- Siga os procedimentos nas etapas 3.1-3.3 para alinhar embriões e veículo de carga (por exemplo, H2O) ou a solução de nanopartículas na agulha.
- Injete 0,5 nL de solução de nanopartículas de 1 mg/mL atrás do olho e continue a injeção conforme descrito nas etapas 3.5-3.6(Figura 1B). Este local atrás dos olhos é enriquecido com capilares, permitindo que as nanopartículas entrem em circulação.
- Seguindo um procedimento semelhante, injete o veículo (por exemplo, H2O) que foi usado para suspender as nanopartículas em embriões com células HeLa transplantadas e aquelas sem (ou seja, controles) (Figura 1A, C).
- Incubar todos os embriões injetados a 35,5 °C.
5. Imagem e rastreamento de nanopartículas e células cancerosas
- Examine embriões injetados sob um microscópio fluorescente em 0, 30, 60, 90, 120, 180 e 210 min pós-injeção de nanopartículas para monitorar sua distribuição em circulação e o grau de direcionamento de células cancerosas. O direcionamento de células cancerígenas por nanopartículas pode ser observado já em 30 minutos de pós-injeção, dependendo do tipo de nanopartícula testada.
- Pipeta 2-3 embriões em uma placa de Petri e imobilizá-los adicionando cinco gotas de solução MS222 diluída (40 μg/mL). Uma vez que os embriões parem de nadar, remova a maior parte da água para permitir que os embriões deitem-se em seus lados.
- Use uma pipeta com uma escova fina e macia presa à extremidade para alinhar os embriões para que eles se deitem de lado com o anterior voltado para a frente e apenas um olho visível.
- Imagem os embriões em vermelho, azul e canais de campo brilhante em baixa ampliação (2x) para capturar todo o embrião e repetir em maior ampliação (6,4x) para capturar a área da cauda. Concentre o embrião sob o canal vermelho para evitar o sangramento das nanopartículas.
NOTA: Os embriões não devem se mover durante a imagem. Qualquer movimento levará a imagens embaçadas e à incapacidade de sobrepor imagens de diferentes canais. - Adicione água de peixe fresco aos embriões imediatamente após a imagem e devolva-os à incubadora. Repita os passos 5.2-5.4 para a imagem dos embriões em diferentes pontos de tempo.
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Representative Results
O esquema protocolar na Figura 1 ilustra os procedimentos gerais deste estudo. Peixes adultos machos e fêmeas transparentes foram criados para gerar embriões (seção 1). As células RFP+ HeLa foram injetadas na área vascularizada sob a cavidade perivitelline dos embriões de zebrafish a 48 hpf, com embriões não injetados como controles (seção 3). Para indivíduos com experiência em microinjeção, a taxa de sobrevivência dos embriões é frequentemente alta, com pelo menos 50% dos embriões transplantados com células cancerígenas sobrevivendo na incubadora de 35,5 °C, uma temperatura subótima para embriões de zebrafish, mas necessária para a sobrevivência e migração de células cancerígenas humanas. As células HeLa são altamente invasivas e podem intravasar e se espalhar para a região traseira dos embriões tão rapidamente quanto a pós-injeção de 8h. Por 20-24 h após o transplante, ~50% dos embriões transplantados mostraram sinais de propagação metastática das células HeLa. Esses embriões com metástases de cauda de células cancerosas foram selecionados para experimentos a jusante. Com 72 cv, esses embriões foram posteriormente injetados atrás dos olhos, seja com nanopartículas fluorescentes azuis (seção 4 e Figura 1B) ou exclusivamente com o veículo como controles(Figura 1A). Embriões com correspondência etária injetados com nanopartículas, mas sem transplante de células cancerosas foram o segundo grupo de controles(Figura 1C). Para obter informações mais detalhadas sobre síntese de nanopartículas, preparação e caracterização, consulte Peerzade et al.18.
Às 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min de pós-injeção de nanopartículas, os embriões injetados foram monitorados por imagens para determinar a interação de nanopartículas com células RFP+ HeLa, utilizando os embriões injetados pelo veículo como controles. Especificamente, as áreas da cauda de zebrafish onde as células RFP+ HeLa haviam se espalhado foram imagens em iluminação vermelha, azul e brightfield usando um microscópio fluorescente (seção 5). A caracterização detalhada da capacidade das nanopartículas ultra-vermelhas de atingir células cancerígenas xenoengrafadas em zebrafish ao longo do tempo é mostrada na Figura 5 de Peerzade et al.18. Os pontos vermelhos vistos na cauda dos embriões são células cancerígenas do colosstáticas humanas que eram visíveis em embriões injetados por veículos e nanopartículas(Figura 2A, D; Figura 3A, D). Como esperado, nenhum sinal fluorescente azul específico foi detectado em embriões com a injeção somente do veículo(Figura 2B, E). Além disso, quando as imagens capturadas nos canais vermelho e azul foram fundidas, apenas células vermelhas de câncer na região da cauda sem sinais azuis foram observadas(Figura 2C, F). No entanto, em embriões que foram injetados com nanopartículas de sílica fluorescentes ultra-francas, havia pontos azuis nas caudas, concentrados perto e ao redor das células cancerígenas a 3,5 h(Figura 3B, E). Nas imagens sobrepostas capturadas de canais vermelhos e azuis, as células HeLa vermelhas e as nanopartículas azuis foram colocadas, vistas como pontos rosados(Figura 3C, F). Naqueles embriões que foram injetados apenas com nanopartículas, mas não transplantados com células HeLa, as partículas fluorescentes azuis não se concentraram em nenhuma célula ou áreas específicas, mas distribuídas relativamente uniformemente no sistema circulatório dos embriões, destacando os vasos sanguíneos(Figura 4B, E). Como esperado, nenhum sinal fluorescente vermelho específico foi detectado nestes embriões, apesar de alguns sinais fluorescentes de fundo fracos(Figura 4A, C, D, F).
Este protocolo foi posteriormente utilizado para testar diferentes tipos de nanopartículas18,,19,20. A colocalização de células cancerígenas com certos tipos de nanopartículas foi observada já em 30 minutos de pós-injeção, dependendo das propriedades da nanopartícula testada. Em 120 min, houve >80% de direcionamento de células cancerígenas por essas nanopartículas na região traseira do peixe. No entanto, para outras nanopartículas, observou-se o direcionamento mínimo das células cancerosas, consistente com a falta de ligante específico para o câncer. Os resultados e análises detalhados estão incluídos em Peerzade et al. (ver Figura 3 e Figura 4, Figuras Suplementares S12-S16 e Tabela Suplementar S6)18. Esses resultados demonstraram o direcionamento diferencial de nanopartículas para células HeLa xenertadas em zebrafish. Assim, usando este protocolo, deve-se ser capaz de selecionar eficientemente nanopartículas com base em sua capacidade de reconhecer e atingir células cancerígenas humanas metastáticas in vivo.
Figura 1: Esquema de protocolo para estudar a capacidade das nanopartículas de atingir células cancerígenas humanas. Embriões casper transparentes foram gerados através da criação de peixes adultos machos e fêmeas. Embriões fertilizados foram coletados em uma placa de Petri. Com 48 hpf, as células RFP+ HeLa foram injetadas em embriões de zebrafish na cavidade perivitelina, deixando alguns embriões com correspondência etária sem injeção como controles. Com 72 cvf, embriões com células HeLa metastáticas RFP+ foram selecionados e divididos em dois grupos: (A) injetado com veículo (H2O) como controle e (B) injetado com nanopartículas suspensas em H2O. O terceiro grupo foi de embriões com idade compatível com nanopartículas(C). Todos os três grupos foram imagens sob um microscópio fluorescente. A área encaixotada é onde as imagens foram capturadas (ver Figura 2-Figura 4). Barras de escala para peixes adultos = 1 mm e para embriões = 500 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Zebrafish transplantado com células HeLa metastáticas sem nanopartículas. Apenas as células HeLa fluorescentes vermelhas eram visíveis nas imagens individuais(A, D) ou sobrepostas do canal vermelho e do canal azul(C, F). Não foram detectados sinais fluorescentes azuis específicos no embrião com controle de injeção veicular(B, E). As imagens em (A-C) mostram a região da cauda de peixe encaixotada como na Figura 1A. As imagens em(D-F) são vistas ampliadas das áreas encaixotadas em (A-C). Barras de escala em (A-C) = 200 μm e em (D-F) = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Colocalização de células hela fluorescentes vermelhas e nanopartículas fluorescentes azuis em zebrafish. As caudas de zebrafish foram imagens tanto em baixa (A-C) quanto alta(D-F)ampliação no canal vermelho e azul. Sinais fluorescentes vermelhos revelaram células hela metastáticas(A, D),enquanto sinais fluorescentes azuis mostraram as nanopartículas(B, E). As imagens sobrepostas dos canais vermelho e azul(C, F) mostram a colocalização de células HeLa e nanopartículas. As imagens foram tiradas após 3,5 h de injeção com nanopartículas de sílica ultrabright. As imagens em (A-C) mostram a região da cauda de peixe como encaixotado na Figura 1B. As imagens em(D-F) são vistas ampliadas das áreas encaixotadas em (A-C). Barras de escala em (A-C) = 100 μm e em (D-F) = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Zebrafish injetado com nanopartículas sem células hela humanas. As nanopartículas fluorescentes azuis foram distribuídas no sistema circulatório dos embriões no indivíduo (B, E) e imagens sobrepostas do canal vermelho e azul(C, F). Nenhuma fluorescência vermelha específica foi visível em alta ou baixa ampliação(A, D), exceto alguma fluorescência de fundo comum aos embriões de zebrafish. As imagens em (A-C) mostram a região da cauda de peixe como encaixotado na Figura 1C. As imagens em(D-F) são vistas ampliadas das áreas encaixotadas em (A-C). Barras de escala em (A-C) = 100 μm e em (D-F) = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui utiliza o zebrafish como um sistema in vivo para testar a capacidade das nanopartículas de reconhecer e atingir células cancerígenas metastáticas. Vários fatores podem impactar a execução bem sucedida dos experimentos. Primeiro, os embriões precisam ser totalmente desenvolvidos a 48 hpf. O estágio correto de desenvolvimento dos embriões permite que eles resistam e sobrevivam ao transplante de células cancerígenas humanas. Embriões com menos de 48 cv têm uma taxa de sobrevivência significativamente menor em comparação com embriões mais velhos e mais desenvolvidos. Em segundo lugar, as células cancerígenas devem ser mantidas o mais saudáveis possível, garantindo que estejam: 1) na fase de crescimento exponencial21, 2) recém-colhidas 30 min-1 h imediatamente antes do transplante, e 3) mantidas aquecidas o tempo todo. Terceiro, a agulha não deve estar entupida. Pipeta as células HeLa para cima e para baixo pelo menos 20x antes de carregar a mistura celular na agulha. Em quarto lugar, diferentes tipos de agulhas devem ser usadas para transplante de células cancerígenas humanas e injeção de nanopartículas. A agulha para transplante de células humanas é relativamente larga, com um ângulo para evitar entupimento celular, enquanto a agulha para injeção de nanopartículas é afiada e fina. Quinto, a localização da injeção difere. O local para transplante de células humanas é a cavidade perivitelline, mas para injeção de nanopartículas, a agulha deve ser inserida atrás do olho, onde há capilares enriquecidos. Por fim, a habilidade do indivíduo que realiza o transplante importa. Um indivíduo experiente pode injetar com precisão células HeLa no espaço da cavidade perivitelina, enquanto uma pessoa inexperiente frequentemente injeta células tumorais na área da gema onde as células tumorais mal se espalham para o corpo dos peixes. Da mesma forma, a taxa de sobrevivência dos embriões é muito maior quando manuseado por um indivíduo experiente, com pelo menos 50% dos embriões transplantados com células cancerígenas sobrevivendo.
Embora os embriões de zebrafish sejam geralmente incubados a 28,5 °C, as células cancerígenas humanas requerem temperaturas mais altas para sobreviver e migrar22,23. Para permitir a sobrevivência de embriões de peixes e células cancerígenas humanas, os embriões transplantados com células cancerígenas humanas são incubados a 35,5 °C. em vez disso. Embora possa ser mais fácil entregar células cancerígenas no saco de gema, elas mal se espalham para o sistema circulatório. Por isso, é fundamental injetar as células cancerígenas na área vascularizada sob a cavidade perivitelline para garantir a intravasão e a disseminação das células cancerígenas. Além disso, deve-se tomar cuidado para não adicionar muito ou muito concentrado MS222 ao anestesiar os embriões durante a injeção e a imagem. Para auxiliar na imagem e visualização de nanopartículas, o peixe-zebra Casper foi escolhido em vez de peixe AB. O peixe Casper é um mutante duplo para Nacre e Roy que carece de melanócitos e iridoforos, resultando em maior transparência em comparação com o peixe AB14. A transparência do peixe-zebra Casper permite monitorar a disseminação de nanopartículas em circulação e o direcionamento das nanopartículas para as células cancerosas. O desafio deste protocolo é a taxa de mortalidade relativamente alta dos embriões se um indivíduo não experiência realizar o transplante de células cancerígenas humanas. Curiosamente, a injeção de nanopartículas ligeiramente atrás dos olhos é relativamente bem tolerada. Isso é provavelmente devido ao uso de agulhas mais finas em comparação com as agulhas usadas para transplante de células tumorais. Para evitar danificar as células cancerígenas humanas, deve-se usar agulhas com aberturas largas, mas estas podem levar a danos dos embriões se manuseadas de forma inadequada.
Este protocolo utiliza o zebrafish Casper para visualizar o direcionamento de células cancerígenas metastáticas com nanopartículas funcionalizadas in vivo. Uma grande vantagem deste ensaio é que permite que os pesquisadores realizem imagens em tempo real ao longo do desenvolvimento de zebrafish para monitorar a interação de células cancerígenas com nanopartículas. De fato, devido à sua alta fecundidade e rápido desenvolvimento, o zebrafish permite que o pesquisador obtenha resultados apenas nos dias18,19,,20,24. Além disso, este ensaio também permite a eliminação de nanopartículas tóxicas de novas pesquisas se a maioria dos embriões morrer após a injeção de um determinado tipo de nanopartícula. Embora o zebrafish não seja um mamífero, facilita a seleção de um grande número de nanopartículas de forma rápida e econômica, fornecendo informações úteis para estudos a jusante em animais de grande porte e testes clínicos. Juntos, o zebrafish está causando um impacto na nanomedicina e na nanotecnologia, ajudando a selecionar nanoprobes adequados para detecção precoce e destruição potencial de células cancerígenas através de alvos específicos do câncer.
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Disclosures
A I.S. declara interesse na NanoScience Solutions, LLC (beneficiária da bolsa STTR NIH R41AI142890). Todos os outros autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Srta. Kaylee Smith, Sra. Lauren Kwok e Sr. Alexander Floru por revisarem o manuscrito. H.F. reconhece o apoio de subvenções do NIH (CA134743 e CA215059), da American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) e da Fundação St. Baldrick. F.J.F.L. reconhece uma bolsa de estudos do Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinar Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). O I.S reconhece o suporte à NSF (conceder CBET 1605405) e o NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
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