Summary
ここで説明するゼブラフィッシュ胚を利用して、生体内のヒト癌細胞を標的とする機能化されたナノ粒子の能力を研究する方法について説明する。この方法は、大型動物および臨床試験における将来の試験に最適なナノ粒子の評価と選択を可能にする。
Abstract
がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、ナノメディシン分野において大きな関心を持っています。生体内の動物モデルは、ナノテクノロジーを生体医学の応用に橋渡しするために必要とされています。マウスは、前臨床試験のための伝統的な動物モデルを表します。しかし、マウスは比較的高価であり、各母親からの限られた子孫のために長い実験サイクルを有する。ゼブラフィッシュは、がん研究を含む発達および生物医学研究のための強力なモデルシステムとして登場しました。特に、その光学的透明性と急速な発達により、ゼブラフィッシュ胚は、がん細胞の挙動およびそれらの微小環境との相互作用をリアルタイムでインビボで監視するのに適しています。この方法は、透明キャ スパー ゼブラフィッシュ胚にヒトがん細胞と機能化ナノ粒子を順次導入し、ナノ粒子によるがん細胞の認識と標的化をリアルタイムで監視するために開発されました。この最適化されたプロトコルは、葉酸基で機能する蛍光標識ナノ粒子が、異なるフルオロクロムで標識されたヒト子宮頸部上皮癌細胞を特異的に認識し、標的化できることを示している。認識および標的化プロセスは、試験したナノ粒子の注入後30分で早くも起こり得る。全体の実験は、成魚のいくつかのペアの繁殖を必要とし、完了するまでに4日未満かかります。さらに、ゼブラフィッシュ胚は機能的な適応免疫系を欠き、幅広いヒト癌細胞の生着を可能にする。したがって、ここで説明するプロトコルの有用性により、さまざまなタイプのヒト癌細胞上でナノ粒子を試験することができ、哺乳類および診療所における将来の検査のために、各特定の癌コンテキストにおける最適なナノ粒子の選択を促進する。
Introduction
がん細胞の検出、標的化、破壊が可能なナノ粒子の開発は、物理学者と生物医学研究者の両方にとって大きな関心事です。ナノメディシンの出現は、リガンドおよび/または化学療法薬,1、2、32を標的としたものなど、いくつかのナノ粒子の開発につながった。13ナノ粒子の追加特性により、生物学的システムとの相互作用が可能となり、治療用途とともに高効率かつ正確な生体事象を検出および監視することができます。金と酸化鉄のナノ粒子は、主にコンピュータ断層撮影および磁気共鳴画像化アプリケーションで使用されます。金および酸化鉄ナノ粒子の酵素的活動は、着色アッセイを介して癌細胞の検出を可能にするが、蛍光性ナノ粒子はインビボイメージングアプリケーション4に適している。中でも、超明るい蛍光性ナノ粒子は、より少ない粒子と毒性の低減を伴う早期に癌を検出する能力のために、特に有益である。
これらの利点にもかかわらず、ナノ粒子は、適切なナノ材料の選択と合成プロセスの最適化のためにin vivo動物モデルを使用して実験を必要とする。さらに、薬物と同様に、ナノ粒子は、その有効性と毒性を決定するために前臨床試験のために動物モデルに依存しています。最も広く使用されている前臨床モデルは、その維持が比較的高いコストで来る哺乳類であるマウスです。癌研究のために、遺伝子操作されたマウスまたは異種移植マウスのいずれかが典型的には66,77を用いる。これらの実験の長さは、多くの場合、数週間から数ヶ月に及びます。特に、癌転移研究のために、癌細胞は、尾,静脈および脾臓88、9、10などの場所でマウスの循環系に直接注入される。,910これらのモデルは、腫瘍細胞が遠くの器官を精外に出して植民地化する場合の転移の終わりの段階を表すだけです。また、視認性の問題により、マウスにおける腫瘍細胞遊動やナノ粒子標的化を監視することは特に困難である。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、その高い菌性、低コスト、急速な発達、光学的透明性、および遺伝的保存11、12,12のために癌研究のための強力な脊椎動物システムとなっています。マウスモデルに対するゼブラフィッシュのもう一つの利点は、発達を通じて胚を監視することを可能にする魚の卵元子宮の受精である。胚発生はゼブラフィッシュにおいて急速であり、そして24時間以内に受精後(hpf)、脊椎動物のボディプレーンはすでに13を形成している。72 hpfによって、卵は絨毛膜から孵化し、胚から稚魚の段階に移る。ゼブラフィッシュの透明性、特に14のキャスパー株は、生きている動物のナノ粒子による癌細胞の移動とその認識および標的化を視覚化するユニークな機会を提供する。最後に、ゼブラフィッシュは48hpfによって自然免疫系を発達させ、適応免疫系は遅れ、受精後28日で機能するだけである。このギャップは、免疫拒絶反応を経験することなく、ゼブラフィッシュ胚への様々なタイプのヒト癌細胞の移植に理想的である。
ここで説明するゼブラフィッシュの透明性と急速な発達を利用して、生体内の蛍光性ナノ粒子によるヒト癌細胞の認識および標的化を実証する方法を説明する。このアッセイでは、赤蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されたヒト子宮頸癌細胞(HeLa細胞)を、48hpf胚の膜腔内の血管化領域に注入した。20-24時間後、HeLa細胞はすでに魚の循環系を通じて胚全体に広がっていた。明らかな転移を有する胚は、高い毛細血管床がある眼の真後ろにナノ粒子溶液の〜0.5nLをマイクロインジェクションした。この技術を使用すると、超明るい蛍光シリカナノ粒子は、注射後20〜30分の速さでHeLa細胞を標的にすることができます。そのシンプルさと有効性のために、ゼブラフィッシュは、特定の癌細胞を標的とする能力について様々なナノ粒子をテストするための堅牢なin vivoモデルを表しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物の手順は、プロトコルの下でボストン大学医学部の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました #: PROTO201800543.
1. キャスパー ゼブラフィッシュ胚の生成
- 透明なキャスパーゼブラフィッシュ胚を生成するために、自然繁殖のために少なくとも3Casperヶ月齢の成虫魚を選択してください。
- 夕方に魚の水で2部屋の交配タンクを充填し、仕切りを使用して上部のタンクを分離し、チャンバーの片側に1つまたは2つのメスの魚を置き、分割機で一晩分離した魚を残します。
- 翌朝8時にライトが点灯したときに、ディバイダーを引き出します。人工濃縮植物を追加し、水の浅い領域を作成するために、上部チャンバーをわずかに傾けます。魚が3-4時間繁殖することを許可します。
- 魚を含む交配タンクの上部チャンバーを持ち上げ、元のタンクに戻します。
- メッシュネットを通して水を注ぐことによって底の部屋に位置する卵を収集します。1皿あたり200個以下の密度で無菌ペトリ皿に卵を移します。死んだ卵や未受精卵を取り除き、新鮮な魚の水で2/3いっぱいの料理を満たします。
注:受精し、健康な卵は半透明で丸いでなければなりません。白濁、白、または不姿の卵は除去する必要があります。魚の水は、魚の施設内の魚のタンクから得られます。 - 28.5 °Cでインキュベーターで胚を一晩インキュベートする。
- 翌朝、ゼブラフィッシュブック16に記載されている標準プロトコルを使用して胚を漂白し、胚をインキュベーターに戻します(任意のステップ)。
- 午後にインキュベーターから24hpf胚を取り出し、プロナーゼを使用して胚をデコール化する。
- ペトリ皿の胚からできるだけ多くの魚の水を取り出し、プロナーゼ溶液(魚水に1mg / mL)を数滴加えます。ペトリ皿をそっと渦巻きます。いったん、発痛の兆候が現れたら、数回、胚を上下にピペットして、胚を放出するために、その後に、その胚を分解する。
- 新鮮な魚の水をペトリ皿にすぐに加え、胚の大半が骨盛りから出たらプロセスを終了します。浮遊するコリオンを除去するために魚の水を使用して胚を3倍以上すすります。胚をインキュベーターに戻します。
2. 移植のためのヒトがん細胞の調製
- インキュベーター温度を正確に35.5 °Cに設定します。 インキュベーターを監視して、インキュベーター内部の温度計を使用して一貫した安定した温度を確保します。
- ガラス瓶に1Lの魚の水を詰めます。100mLのオートクレーブ魚水に3gの電気泳動グレードのアガロースを加え、アガロースが完全に溶解するまでマイクロウェーブを行い、3%のアガロース溶液を作ります。
- 3/4がいっぱいになるまでペトリ皿に熱いアガロース溶液を注ぎます。アガロースにマイクロインジェクションモールドを置きます。鋳型がペトリ皿の底に接触せず、下に泡が形成されていないことを確認します。
- 溶液を固め、慎重にプレートから金型を取り除きます。プレートに魚の水を詰め込み、4°Cで保存します。 ヒラ細胞を収穫する前に、35.5°Cインキュベーターでアガロースプレートと魚の水を前温め。
- 500で圧力、560で熱、100で引っ張り、100で速度、200で時間/遅延:ピペットプラーに1.0 mm O.D.x 0.78ミリメートルのホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張ります。エタノールタオルで拭いた大きなペトリ皿にパテに針を保管してください。
注意:引っ張られた針は非常に鋭く、壊れやすい。取り扱いの際は注意してください。 - MS222をオートクレーブされた魚の水に溶解させることにより、トリケーヌメタンスルホン酸(MS222、4 mg/mL)のストック溶液を調製します。使用前に渦。希釈MS222ストック溶液1:100魚水(すなわち、20mLの魚水に20mLの魚水に200μLを加えて、最終的な濃度40μg/mL)を、次の手順で胚を麻酔します。
- 培養hLabel HeLa細胞は、17に記載されたプロトコルを用いてPLenti6.2_miRFP670レンチウイルスとそれらをトランスフェクトすることによって。移植前にRFP+HeLa細胞を30分-1時間収穫する。
注:ヒトHeLa細胞は、5%CO2で補った37°Cで完全増殖培地(DMEM培地10%FBS)において最大70%合流までの組織培養インキュベーターで培養されている。2- 組織培養フード内の吸引によりHeLa細胞培地を除去する。細胞層を滅菌PBSで簡単にすすいで、血清の痕跡をすべて除去します。
- T-75フラスコに3.0mLの滅菌トリプシン-EDTA溶液を加え、細胞を37°C組織培養インキュベーターに3〜5分間戻して酵素消化を容易にします。細胞の80%が懸濁されるまで顕微鏡下でフラスコを観察する。
- フラスコに完全な成長培地の6-8 mLを追加します。穏やかにピペットによって15 mLの無菌管に細胞を集める。遠心分離機 135 x g 5 分間
- 上清を吸引し、完全増殖培地の3mLでHeLa細胞を再懸濁する。上記の洗浄工程2xを繰り返す。完全な成長培地の1 mLで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して顕微鏡下で細胞を数えます。
- 細胞を再び回転させ、上清を取り除き、5 x 107 細胞/mLの濃度で1.5 mLマイクロ遠心分離管の細胞を再懸濁させる。魚の施設に運ぶときに片手で管を握って細胞を暖かく保つ。
注:胚を注入する前または注入中に35.5°Cインキュベーター内に細胞を保管することによって、細胞を常に暖かく保ちます。
ヒトがん細胞の移植
- 移植前にエタノールタオル(はさみ、ピンセット、プラスチックピペット、カミソリブレードなど)を使用して作業領域を清掃してください。
- プラスチックピペットを使用してアガロースプレートの溝内の胚を整列させます。前子を前方に向けて側面に胚を置きます。
注:魚の水が胚を覆っていることを確認してください。がん細胞を注入しないようにいくつかの胚を脇に置き、コントロールとして使用してください。 - 空気源とマイクロインジェクターをオンにします。培養器からHeLa細胞を取り出し、P200チップを使用して細胞を上下にピペットします。切り取られた端が付いたゲルの負荷の先端を使用して、すぐに針に3μLの細胞混合物をロードする。針の鋭い下端に向かって慎重にチップを挿入します。必要に応じて、針を振って、細胞混合物が針を下に移動して鋭い端を満たしていることを確認します。
- 針を針ホルダーに差し込みます。ピンセットを使用して、針の先端を慎重に開きます。マイクロインジェクターの圧力と時間を調整して、針先の中のすべての気泡を押し出します。射出液滴の大きさが〜1nLになるまで圧力と射出時間を短くする。
- 注射板を顕微鏡の下に置き、卵子側を針に向けて持つ適切な位置に置きます。希釈したMS222溶液(40μg/mL)を5滴添加して胚を麻酔します。
- 注射器を配置し、針が各胚の膜膜腔に触れるようにします。
- フットペダルを押して、膜腔の下の血管化領域の胚に細胞混合物を注入する。
- 非支配的な手を使用して、注射プレートを次の胚に移動させます。フットペダルを同時に押しながら注入器を伸ばしたり引き込んだりして、インジェクションを継続します。注入された胚に滅菌魚の水の数滴をピペット。プレート上のすべての胚の注入が完了したら、無菌の魚の水で胚を洗い流し、滅菌ペトリ皿に入れ、すぐに35.5°Cインキュベーターに移します。
- 3時間後、注入された胚を調べ、死んだ胚を取り除く。
- 生きた胚を35.5°Cインキュベーターに戻し、20〜24時間インキュベートして、HeLa細胞が注射部位から身体の他の部分に広がるようにします。
注:胚は、細胞が28.5°Cでうまくいっていないので、ヒト癌細胞の生存と移動を可能にするために35.5°Cインキュベーターに保管され、温度魚の胚は通常インキュベートされます。
4. ナノ粒子または車両の注入
- 希釈したMS222溶液を5滴で翌朝移植した胚を麻酔する。これは胚を殺すので、あまりにも多くのMS222を追加しないでください。蛍光顕微鏡の下で、慎重にRFP + HeLa細胞の尾転移を伴う胚を拾い、滅菌魚の水で新しいペトリ皿に入れます。
- セクション 2 で説明したとおりに、500 の圧力、645 の熱、60 で引き、速度が 50、100 の時間/遅延の設定を使用して、注射針を作成します。
- ステップ3.1-3.3の手順に従って、胚と負荷車両(例えば、H2O)またはナノ粒子溶液を針に整列させます。
- 目の後ろに1 mg/mLナノ粒子溶液の0.5 nLを注入し、ステップ3.5-3.6に記載されているように注射を続ける(図1B)。目の後ろのこの位置は毛細血管で富み、ナノ粒子が循環に入ることを可能にする。
- 同様の手順に従って、移植されたHeLa細胞と(すなわち、コントロール)を有するもの(すなわち、コントロール)を用いてナノ粒子を胚に懸濁させるために用いた車両(例えば、H2O)を注入する(図1A、C)。
- 注射した胚を35.5°Cで全てインキュベートする。
5. ナノ粒子とがん細胞のイメージングと追跡
- 0、30、60、90、120、180、および210分のナノ粒子の注入後に蛍光顕微鏡で注入された胚を調べ、その分布と癌細胞ターゲティングの程度を監視する。ナノ粒子による癌細胞の標的化は、試験したナノ粒子の種類に応じて、早ければ30分の注射後に観察することができる。
- ピペット2~3胚をペトリ皿に入れ、希釈したMS222溶液(40μg/mL)を5滴加えて固定化します。胚が泳ぐのを止めたら、ほとんどの水を取り除いて、胚が横たわっているのを許します。
- 細くて柔らかいブラシが付いたピペットを使用して胚を整列させ、前眼を前方に横たわり、片方の目だけが見えるように胚を整列させます。
- 低倍率(2x)で胚を赤、青、明るいフィールドチャンネルで画像化し、胚全体を捕獲し、より高い倍率(6.4x)で繰り返して尾部を捕獲します。ナノ粒子の出血を避けるために、赤いチャネルの下に胚を集中させます。
注: イメージング中に胚が動かないようにしてください。動きは、ぼやけた画像と異なるチャンネルからの画像を重ねることができないにつながります。 - イメージングの直後に胚に新鮮な魚の水を加え、インキュベーターに戻します。ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返して、異なる時点で胚を画像化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1のプロトコルの概略図は、この調査の全体的な手順を示しています。透明キャスパーオスおよびメスの成魚を飼育して胚を生成した(セクション1)。RFP+HeLa細胞を、48hpfでゼブラフィッシュ胚の膜膜腔下の血管化領域に注入し、未注入胚をコントロールとして(セクション3)。マイクロインジェクションで経験した個体では、胚の生存率が高いことが多く、癌細胞を移植した胚の少なくとも50%がゼブラフィッシュ胚の温度に最適でないが、ヒト癌細胞の生存および移動に必要である。HeLa細胞は非常に侵襲性があり、注射後8時間ほど早く胚の尾領域に浸食して広がることができる。移植後20〜24時間までに、移植した胚の50%がHeLa細胞の転移性広がりの徴候を示した。癌細胞の尾転移を有するそれらの胚は、下流実験のために選択された。72hpfでは、これらの胚を、その後、青色蛍光性ナノ粒子(セクション4および図1B)または制御として車両と一緒に目の後ろに注射した(図1A)。ナノ粒子を注射したが、癌細胞移植を行わない年齢に適合した胚は、第2のコントロール群であった(図1C)。ナノ粒子の合成、調製、および特性評価の詳細については、 Peerzadeら18を参照してください。
0,30,60,90,120,180,210分のナノ粒子の注入後に、注入された胚を撮像してRFP+HeLa細胞とナノ粒子の相互作用を決定し、車両注入胚をコントロールとして用いた。具体的には、RFP+HeLa細胞が広がったゼブラフィッシュの尾部領域を、蛍光顕微鏡を用いて赤、青、明視野照明で画像化した(セクション5)。超明るいナノ粒子がゼブラフィッシュの異種移植癌細胞を標的とする能力の詳細な特徴付けは、Peerzadeらの図5に示されている。胚の尾に見られる赤い点は、車両とナノ粒子注入胚の両方で見える転移性ヒト子宮頸癌細胞である(図2A, D;図3A,D)。予想通り、車両のみの注入を伴う胚では特定の青色蛍光シグナルは検出されなかった(図2B,E)。さらに、赤と青のチャネルで撮影した画像が結合されると、青色信号を伴わない尾部の赤い癌細胞のみが観察された(図2C、F)。しかし、超明るい蛍光性シリカナノ粒子を注入した胚では、尾部に青色の点があり、癌細胞の近傍と周囲に3.5hで集中していた(図3B、E)。赤と青の両方のチャネルからキャプチャされたオーバーレイ画像では、赤HeLa細胞と青色ナノ粒子が共局し、ピンクの点として見える(図3C、F)。ナノ粒子のみを注射したがHeLa細胞で移植されなかった胚では、青色蛍光粒子は特定の細胞または領域に集中せず、胚の循環系に比較的均等に分布し、血管を強調した(図4B、E)。予想通り、これらの胚では、弱いバックグラウンド蛍光シグナルにもかかわらず、特定の赤色蛍光シグナルは検出されなかった(図4A、C、D、F)。
このプロトコルは、その後、ナノ粒子18、19、20,19,20の異なるタイプをテストするために使用されました。特定のタイプのナノ粒子を有する癌細胞の共局在化は、試験したナノ粒子の特性に応じて、早くも30分の注射後に観察された。120分までに、魚の尾部領域にこれらのナノ粒子による癌細胞の標的化率が80%あった。しかし、他のナノ粒子については、癌細胞の最小標的化が観察され、癌特異的リガンドの欠如と一致した。詳細な結果と分析は、Peerzadeら(図3および図4、補足図S12-S16、および補足表S6)18に含まれています。これらの結果は、ゼブラフィッシュにおける異種移植HeLa細胞に対するナノ粒子の差動標的化を実証した。このように、このプロトコルを用いて、生体内の転移性ヒト癌細胞を認識し、標的とする能力に基づいてナノ粒子を効率的に選択できるべきである。
図1:ヒトがん細胞を標的とするナノ粒子の能力を研究するためのプロトコル概略図透明キャスパー胚は、オスとメスの成魚の繁殖を通じて生成された。受精胚をペトリ皿に集めた。48 hpfでは、RFP+HeLa細胞をペリビテリン腔のゼブラフィッシュ胚に注入し、一部の加齢に合致した胚をコントロールとして注射していない。72hpfでは、転移性RFP+HeLa細胞を有する胚を選択し、制御として車両(H2O)を注射した(A)と(B)H2Oに懸濁したナノ粒子2を注入した2つのグループに分割した。B第3群は、ナノ粒子単独で注入された年齢に一致した胚(C)であった。3群全てを蛍光顕微鏡で画像化した。表示されているボックス領域は、画像がキャプチャされた場所です (図 2-図 4を参照)。成魚=1mmと胚=500μmのスケールバー。
図2:ナノ粒子を含まない転移性HeLa細胞を移植したゼブラフィッシュ。赤い蛍光HeLa細胞のみが、個々の(A、D)または赤チャネルと青色チャネル(C、F)の重ね合わせた画像で見える。胎児では、特定の青色蛍光シグナルは、車両噴射制御(B,E)で検出されなかった。図1Aのように、(A-C)の画像は、魚の尾の領域をボックス化して示しています。内の画像 (D-F) は、 (A -C) のボックス化された領域の拡大表示です。スケールバー(A-C)= 200 μm および(D-F)= 100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゼブラフィッシュにおける赤蛍光HeLa細胞と青色蛍光性ナノ粒子の共局在化。ゼブラフィッシュの尾は、赤と青のチャネルで低い(A-C)と高い(D-F)倍率の両方で画像化されました。赤色蛍光シグナルは転移性HeLa細胞(A、D)を明らかにしたのに対し、青色蛍光シグナルはナノ粒子(B,E)を示した。赤と青の両方のチャンネル(C、F)の重ね合った画像は、HeLa細胞とナノ粒子の共局在化を示しています。画像は、超明るいシリカナノ粒子を注入してから3.5時間後に撮影された。図1Bに示されている「魚の尾の領域」を示す画像(A-C)」内の画像 (D-F) は、 (A -C) のボックス化された領域の拡大表示です。スケールバー(A-C)=100μm、(D-F)=50μm。D-Fこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒトHeLa細胞を含まないナノ粒子を注入したゼブラフィッシュ。青色蛍光ナノ粒子を、個体(B,E)の胚の循環系に分布し、赤色および青色チャネル(C,F)の画像を重ね合った。ゼブラフィッシュ胚に共通するいくつかのバックグラウンド蛍光を除いて、低または高倍率(A、D)で特定の赤色蛍光は見えませんでした。図1Cに示されている「魚の尾の領域」を示す(A-C)の画像。内の画像 (D-F) は、 (A -C) のボックス化された領域の拡大表示です。スケールバー(A-C)= 100 μm および(D-F)= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明するプロトコルは、ナノ粒子が転移性ヒト癌細胞を認識し、標的とする能力をテストするin vivoシステムとしてゼブラフィッシュを利用する。実験の成功に影響を与える要因がいくつかあります。まず、胚は48 hpfで完全に発達する必要がある。胚の正しい発達段階は、ヒト癌細胞の移植に耐え、生き残ることを可能にする。48hpf未満の胚は、古くて発達した胚に比べて生存率が有意に低い。第二に、がん細胞は、1)指数成長フェーズ21、2)移植直前に30分-1時間で新たに収穫され、3)常に暖かく保たれていることを保証することによって、可能な限り健康に保つべきです。第三に、針が詰まってはいけません。HeLa細胞を少なくとも20倍上下にピペットしてから、細胞混合物を針にロードする。第4に、ヒト癌細胞の移植やナノ粒子の注入には、異なる種類の針を用いなければならない。ヒト細胞移植用の針は比較的広く、細胞の詰まりを避ける角度を持ち、ナノ粒子注射用の針は鋭く薄い。第5に、注射の位置は異なる。ヒト細胞の移植場所は膜膜腔であるが、ナノ粒子注入の場合、針は毛細血管が豊かである眼の後ろに挿入されるべきである。最後に、移植を行う個人の技能が重要である。経験豊富な個人は、ヒラ細胞を膜膜腔腔に正確に注入することができ、経験の浅い人はしばしば腫瘍細胞が魚の体内にほとんど広がらない卵黄領域に腫瘍細胞を注入する。同様に、胚の生存率は経験豊富な個体によって処理されるとはるかに高く、少なくとも50%の胚が癌細胞を移植して生存している。
ゼブラフィッシュ胚は通常28.5°Cでインキュベートされるが、ヒト癌細胞は生き残り、22,23,23を移行するためにより高い温度を必要とする。魚の胚とヒト癌細胞の両方の生存を可能にするために、ヒト癌細胞を移植した胚は、代わりに35.5°Cでインキュベートされる。がん細胞を黄身嚢に送り込む方が簡単かもしれないが、循環系にはほとんど広がらない。したがって、がん細胞の浸入と広がりを確実にするために、がん細胞を膜膜腔下の血管領域に注入することが重要です。さらに、注射およびイメージング中に胚を麻酔する際に、MS222をあまり多くまたは濃縮しないように注意する必要があります。ナノ粒子のイメージングと可視化を支援するために、CASPerゼブラフィッシュはAB魚の代わりに選ばれました。キャスパー魚は、メラノサイトとイリドフォアを欠いているナクレとロイのための二重変異体であり、その結果、AB魚14と比較して透明性が向上する。Casperゼブラフィッシュの透明性により、循環中のナノ粒子の拡散や、ナノ粒子のがん細胞へのターゲティングを監視できます。このプロトコルの課題は、未経験者がヒト癌細胞の移植を行う場合の胚の死亡率が比較的高い。興味深いことに、目の後ろのナノ粒子の注入は比較的良好に許容される。これは、腫瘍細胞移植に使用される針と比較して、より細い針の使用による可能性が高い。ヒト癌細胞の損傷を避けるためには、広い開口部を持つ針を使用する必要がありますが、不適切に処理すると胚の損傷につながる可能性があります。
このプロトコルはCasperゼブラフィッシュを利用して、生体内で機能化されたナノ粒子を有する転移性癌細胞の標的化を可視化する。このアッセイの主な利点は、研究者がゼブラフィッシュの発達の過程でリアルタイムイメージングを行い、癌細胞とナノ粒子の相互作用を監視できることです。実際には、その高い胎児性と急速な発達のために、ゼブラフィッシュは研究者がわずか数日で結果を得ることができます18,,19,,20,,24.さらに、このアッセイはまた、ほとんどの胚が特定のタイプのナノ粒子の注射後に死んだ場合、さらなる研究から有毒なナノ粒子の除去を可能にする。ゼブラフィッシュは哺乳類ではないが、大量のナノ粒子を迅速かつ経済的に選択しやすくし、大型動物の下流研究や臨床検査に有用な情報を提供する。ゼブラフィッシュは、がん特異的ターゲティングを通じて、がん細胞の早期発見と潜在的な破壊に適したナノプローブの選択を支援することで、ナノメディシンとナノテクノロジーに影響を与えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
I.S.は、ナノサイエンスソリューションズLLC(STTR NIH R41AI142890助成金を受け取った)に関心を示しています。他のすべての著者は、利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、原稿を校正してくれたケイリー・スミス氏、ローレン・クウォック氏、アレクサンダー・フロル氏に感謝している。H.F.は、NIH(CA134743およびCA215059)、米国癌学会(RSG-17-204 01-TBG)、セントボールドリック財団からの助成金支援を認めています。F.J.F.L.は、ボストン大学イノベーションセンター-がんのためのナノテクノロジーの学際訓練(XTNC)からのフェローシップを認めています。I.S は、NSF サポート (CBET 1605405 を付与) および NIH R41AI142890 を承認します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D.
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
