Summary
Descrito aquí es un método para utilizar embriones de pez cebra para estudiar la capacidad de las nanopartículas funcionalizadas para atacar las células cancerosas humanas in vivo. Este método permite la evaluación y selección de nanopartículas óptimas para futuras pruebas en animales grandes y en ensayos clínicos.
Abstract
Desarrollar nanopartículas capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés en el campo de la nanomedicina. Los modelos animales in vivo son necesarios para unir la nanotecnología a su aplicación biomédica. El ratón representa el modelo animal tradicional para las pruebas preclínicas; sin embargo, los ratones son relativamente caros de mantener y tienen ciclos experimentales largos debido a la limitada progenie de cada madre. El pez cebra ha surgido como un potente sistema modelo para la investigación del desarrollo y la biomédica, incluida la investigación del cáncer. En particular, debido a su transparencia óptica y rápido desarrollo, los embriones de pez cebra son muy adecuados para el monitoreo in vivo en tiempo real del comportamiento de las células cancerosas y sus interacciones con su microambiente. Este método fue desarrollado para introducir secuencialmente células cancerosas humanas y nanopartículas funcionalizadas en embriones transparentes de pez cebra Casper y monitorear el reconocimiento in vivo y la focalización de las células cancerosas por nanopartículas en tiempo real. Este protocolo optimizado muestra que las nanopartículas con etiqueta fluorescente, que están funcionalizadas con grupos de folatos, pueden reconocer y atacar específicamente las células de cáncer epiteliales humanos metastásicos etiquetadas con un fluorocromo diferente. El proceso de reconocimiento y focalización puede ocurrir tan pronto como 30 min postinjection de las nanopartículas probadas. Todo el experimento sólo requiere la cría de unos pocos pares de peces adultos y tarda menos de 4 días en completarse. Además, los embriones de pez cebra carecen de un sistema inmunitario adaptativo funcional, lo que permite el injerto de una amplia gama de células cancerosas humanas. Por lo tanto, la utilidad del protocolo descrito aquí permite la prueba de nanopartículas en varios tipos de células cancerosas humanas, facilitando la selección de nanopartículas óptimas en cada contexto específico del cáncer para futuras pruebas en mamíferos y la clínica.
Introduction
El desarrollo de nanopartículas que son capaces de detectar, apuntar y destruir células cancerosas es de gran interés tanto para los físicos como para los investigadores biomédicos. La aparición de nanomedicina condujo al desarrollo de varias nanopartículas, como las conjugadas con ligandos de orientación y/o fármacos quimioterápicos1,,2,,3. Las propiedades añadidas de las nanopartículas permiten su interacción con el sistema biológico, la detección y el seguimiento de eventos biológicos con alta eficiencia y precisión junto con aplicaciones terapéuticas. Las nanopartículas de oro y óxido de hierro se utilizan principalmente en aplicaciones de tomografía computarizada y resonancia magnética, respectivamente. Mientras que las actividades enzimáticas de las nanopartículas de oro y óxido de hierro permiten la detección de células cancerosas a través de ensayos colorimétricos, las nanopartículas fluorescentes son adecuadas para aplicaciones de imágenes in vivo4. Entre ellas, las nanopartículas fluorescentes ultrabright son particularmente beneficiosas, debido a su capacidad para detectar cánceres a tiempo con menos partículas y toxicidades reducidas5.
A pesar de estas ventajas, las nanopartículas requieren experimentación utilizando modelos animales in vivo para la selección de nanomateriales adecuados y la optimización del proceso de síntesis. Además, al igual que los medicamentos, las nanopartículas se basan en modelos animales para pruebas preclínicas para determinar su eficacia y toxicidades. El modelo preclínico más utilizado es el ratón, que es un mamífero cuyo mantenimiento tiene un costo relativamente alto. Para los estudios de cáncer, ya sea ratones genéticamente diseñados o ratones xenoinjertados se utilizan típicamente6,7. La duración de estos experimentos a menudo abarca de semanas a meses. En particular, para los estudios de metástasis del cáncer, las células cancerosas se inyectan directamente en el sistema circulatorio de los ratones en lugares como las venas de cola y el bazo8,,9,10. Estos modelos sólo representan las etapas finales de la metástasis cuando las células tumorales extravasan y colonizan órganos distantes. Además, debido a problemas de visibilidad, es particularmente difícil monitorear la migración de células tumorales y la focalización de nanopartículas de las células tumorales en ratones.
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un potente sistema de vertebrados para la investigación del cáncer debido a su alta fecundidad, bajo costo, desarrollo rápido, transparencia óptica, y conservaciones genéticas11,12. Otra ventaja del pez cebra sobre el modelo de ratón es la fertilización de los huevos de pescado ex utero, que permite controlar los embriones durante todo su desarrollo. El desarrollo embrionario es rápido en el pez cebra, y dentro de las 24 horas de postfertilización (hpf), el plano del cuerpo vertebrado ya ha formado13. A los 72 hpf, los huevos son incubados de la coral, pasando de la etapa embrionaria a la etapa de alevines. La transparencia del pez cebra, la cepa Casper en particular14, ofrece una oportunidad única para visualizar la migración de las células cancerosas y su reconocimiento y focalización por nanopartículas en un animal vivo. Finalmente, el pez cebra desarrolla su sistema inmunológico innato en 48 hpf, con el sistema inmune adaptativo rezagado y sólo se vuelve funcional a los 28 días de postfertilización15. Esta brecha de tiempo es ideal para el trasplante de varios tipos de células cancerosas humanas en embriones de pez cebra sin experimentar rechazos inmunes.
Aquí se describe un método que aprovecha la transparencia y el rápido desarrollo del pez cebra para demostrar el reconocimiento y la focalización de las células cancerosas humanas mediante nanopartículas fluorescentes in vivo. En este ensayo, se inyectaron células de cáncer de cuello uterino humano (células HeLa) genéticamente diseñadas para expresar una proteína fluorescente roja en el área vascularizada en la cavidad perivitellina de 48 hpf embriones. Después de 20-24 h, las células de HeLa ya se habían diseminado por los embriones a través del sistema circulatorio de peces. Los embriones con metástasis aparente se inyectaron microincisiones con 0,5 nL de una solución de nanopartículas directamente detrás del ojo, donde se encuentra el rico lecho capilar. Usando esta técnica, las nanopartículas fluorescentes ultrabright de sílice pueden apuntar a las células de HeLa tan rápido como 20-30 min postinjection. Debido a su simplicidad y eficacia, el pez cebra representa un modelo in vivo robusto para probar una variedad de nanopartículas por su capacidad para atacar células cancerosas específicas.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Escuela de Medicina de la Universidad de Boston bajo el protocolo : PROTO201800543.
1. Generación de embriones de pez cebra Casper
- Elija peces Casper adultos que tienen al menos 3 meses de edad para la cría natural para generar embriones transparentes de pez cebra Casper.
- Llenar tanques de apareamiento de dos cámaras con agua de pescado por la noche, separar los tanques superiores usando divisores, colocar un pez macho en un lado de la cámara y uno o dos peces hembra en el otro lado de la cámara, y dejar el pez separado durante la noche por divisores.
- Saca los divisores a la mañana siguiente a las 8:00 AM cuando las luces estén encendidas. Agregue plantas de enriquecimiento artificial e incline ligeramente la cámara superior para crear un área poco profunda de agua. Dejar que el pescado se reproduzca durante 3-4 h.
- Levante las cámaras superiores de los tanques de apareamiento que contienen los peces y devuélvalos a sus tanques originales.
- Recoger los huevos situados en las cámaras inferiores vertiendo el agua a través de una red de malla. Transfiera los huevos a un plato estéril de Petri a una densidad no superior a 200 huevos por plato. Retire los huevos muertos o no fecados y llene el plato 2/3 lleno de agua dulce de pescado.
NOTA: Los huevos fertilizados y sanos deben ser translúcidos y redondos. Los huevos que estén nublados, blancos o desfigurados deben eliminarse. El agua de pescado se obtiene de las peceras en la instalación de peces. - Incubar embriones en la incubadora a 28,5 oC durante la noche.
- Blanquear los embriones a la mañana siguiente utilizando el protocolo estándar como se describe en el Zebrafish Book16, y volver a colocar los embriones en la incubadora (paso opcional).
- Saque los embriones de 24 hpf de la incubadora por la tarde y descorte los embriones con pronasa.
- Retire la mayor cantidad de agua de pescado posible de los embriones en el plato Petri y agregue unas gotas de la solución pronasa (1 mg/ml en agua de pescado) al plato. Revuelva suavemente el plato de Petri. Una vez que los coros muestran signos de desintegración, pipetear los embriones hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para descomponer los coros para liberar los embriones.
- Agregue agua fresca de pescado inmediatamente en el plato Petri para terminar el proceso una vez que la mayoría de los embriones estén fuera de los coros. Enjuague los embriones 3 veces más usando agua de pescado para eliminar los coros flotantes. Devuelva los embriones a la incubadora.
2. Preparación de células cancerosas humanas para trasplante
- Ajuste la temperatura de la incubadora a exactamente 35,5 oC. Monitoree la incubadora para asegurar una temperatura consistente y estable utilizando un termómetro dentro de la incubadora.
- Autoclave 1 L de agua de pescado en una botella de vidrio. Haga una solución de agarosa al 3% añadiendo 3 g de agarosa de grado electroforesis a 100 ml de agua de pescado autoclave y microwaving hasta que la agarosa se disuelva por completo.
- Vierta la solución de agarosa caliente en un plato de Petri hasta que esté llena 3/4. Coloque el molde de microinyección en la agarosa. Asegúrese de que el molde no esté en contacto con la parte inferior de la placa Petri y que no se formen burbujas debajo.
- Deje que la solución se solidifique y retire cuidadosamente el molde de la placa. Llene el plato con agua de pescado autoclavizada y almacene la placa a 4 oC. Precalienta la placa de agarosa y el agua de los peces en la incubadora de 35,5 oC antes de cosechar las células de HeLa.
- Tire de los capilares de vidrio borosilicato de 1,0 mm D. x 0,78 mm en un tirador de pipetas utilizando los siguientes ajustes: presión a 500, calor a 560, tracción a 100, velocidad a 100 y tiempo/retardo a 200. Almacene las agujas en la masilla en un plato grande de Petri que haya sido limpiado con una toalla de etanol.
ADVERTENCIA: Las agujas tiradas son muy afiladas y frágiles. Tenga cuidado al manipular. - Preparar una solución de material de metanesulfonato tricaine (MS222, 4 mg/ml) disolviendo MS222 en agua de pescado autoclaved. Vortex mucho antes de su uso. Diluir la solución de stock MS222 1:100 en agua de pescado (es decir, añadir 200 l de solución de serie MS222 a 20 ml de agua de pescado a una concentración final de 40 g/ml) para anestesiar embriones para los siguientes procedimientos.
- Cultivo hLabel HeLa células transduciéndolas con PLenti6.2_miRFP670 lentivirus utilizando el protocolo descrito17. Cosechar células de HeLa RFP+ 30 min-1 h antes del trasplante.
NOTA: Las células hela humanas se han cultivado en una incubadora de cultivo de tejidos de hasta un 70% de confluencia en medio de crecimiento completo (medio DMEM con 10% DE FBS) a 37 oC complementado con 5% de CO2.- Retire el medio celular HeLa por aspiración en una capucha de cultivo de tejido. Enjuague brevemente la capa celular con PBS estéril para eliminar todos los restos del suero.
- Añadir 3,0 ml de solución estéril de Trippsina-EDTA a un matraz T-75 y volver a colocar las células en la incubadora de cultivo de tejido de 37oC durante 3-5 min para facilitar la digestión enzimática. Observar el matraz bajo el microscopio hasta que se suspenda el 80 % de las células.
- Añadir 6-8 ml de medio de crecimiento completo en el matraz. Recoger las células en un tubo estéril de 15 ml por pipeteo suavemente. Centrífuga a 135 x g durante 5 min.
- Aspirar las células HeLa sobrenadantes y resuspendidas en 3 ml de medio de crecimiento completo. Repita el paso de lavado 2x anterior. Resuspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo y contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocicómetro.
- Gire las células hacia abajo de nuevo, retire el sobrenadante y resuspendir las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a una concentración de 5 x 107 células/ml. Mantenga las células calientes sosteniendo el tubo en una mano cuando se transporta a la instalación de peces.
NOTA: Mantenga siempre las células calientes almacenando las células dentro de la incubadora de 35,5 oC antes o durante la inyección de los embriones.
3. Trasplante de células cancerosas humanas
- Limpie el área de trabajo con toallas de etanol antes del trasplante (por ejemplo, tijeras, pinzas, pipetas de plástico, cuchillas de afeitar).
- Alinee los embriones dentro de las ranuras de la placa de agarosa utilizando una pipeta de plástico. Poner embriones en el lado con la parte anterior hacia adelante.
NOTA: Asegúrese de que el agua del pescado cubra los embriones. Deja a un lado algunos embriones para no inyectar células cancerosas y usarlas como controles. - Encienda la fuente de aire y el microinyector. Saque las células HeLa de la incubadora y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 20-30x usando una punta P200. Cargue 3 l de mezcla celular inmediatamente en una aguja utilizando una punta de carga de gel con un extremo cortado. Inserte cuidadosamente la punta hacia el extremo inferior afilado de la aguja. Si es necesario, agitar la aguja para asegurarse de que la mezcla celular se mueve por la aguja para llenar el extremo afilado.
- Inserte la aguja en el soporte de la aguja. Use un par de pinzas para abrir cuidadosamente la punta de la aguja. Ajuste la presión y la duración del tiempo en el microinyector para expulsar todas las burbujas de aire dentro de la punta de la aguja. Reduzca la presión y el tiempo de duración de la inyección hasta que el tamaño de las gotas de inyección sea de 1 nL.
- Coloque la placa de inyección debajo del microscopio en una posición adecuada para tener el lado de la yema de los embriones frente a la aguja. Anestesar los embriones añadiendo cinco gotas de la solución MS222 diluida (40 g/ml).
- Coloque el inyector y deje que la aguja toque la cavidad de la perivitellina de cada embrión.
- Inyectar la mezcla celular en los embriones en el área vascularizada bajo la cavidad de la perivitellina presionando el pedal.
- Utilice la mano nonteminante para mover la placa de inyección al siguiente embrión. Utilice la mano dominante para extender y retraer el inyector mientras presiona el pedal simultáneamente para continuar con la inyección. Pipetear unas gotas de agua estéril de pescado en embriones que se han inyectado. Una vez completada la inyección de todos los embriones en la placa, lave los embriones con agua estéril de pescado, colóquelos en un plato estéril de Petri y muévalos inmediatamente a la incubadora de 35,5 oC.
- Después de 3 h, examine los embriones inyectados y retire los muertos.
- Devolver los embriones vivos a la incubadora de 35,5 oC e incubarlos durante 20-24 h para permitir que las células de HeLa se propaguen desde el lugar de inyección a otras partes del cuerpo.
NOTA: Los embriones se mantienen en una incubadora de 35,5 oC para permitir la supervivencia y la migración de las células cancerosas humanas porque las células no funcionan bien a 28,5 oC, la temperatura de los embriones de peces normalmente se incuban.
4. Inyección de nanopartículas o vehículo
- Anesthetizar los embriones trasplantados a la mañana siguiente con cinco gotas de solución MS222 diluida. No agregue demasiado MS222, porque esto matará a los embriones. Bajo un microscopio fluorescente, recoge cuidadosamente embriones con metástasis de cola de células DE HeLa RFP+ y colóllalos en un nuevo plato de Petri con agua estéril de pescado.
- Haga las agujas de inyección como se describió anteriormente en la sección 2 utilizando los siguientes ajustes: presión a 500, calor a 645, tracción a 60, velocidad a 50 y tiempo/retardo a 100.
- Siga los procedimientos descritos en los pasos 3.1-3.3 para alinear embriones y cargar el vehículo (por ejemplo, H2O) o la solución de nanopartículas en la aguja.
- Inyectar 0,5 nL de 1 mg/ml de solución de nanopartículas detrás del ojo y continuar la inyección como se describe en los pasos 3.5-3.6 (Figura 1B). Esta ubicación detrás de los ojos está enriquecida con capilares, permitiendo que las nanopartículas entren en circulación.
- Tras un procedimiento similar, inyectar el vehículo (por ejemplo, H2O) que se utilizó para suspender las nanopartículas en embriones con células HeLa trasplantadas y aquellos sin (es decir, controles)(Figura 1A, C).
- Incubar todos los embriones inyectados a 35,5 oC.
5. Imágenes y seguimiento de nanopartículas y células cancerosas
- Examine los embriones inyectados bajo un microscopio fluorescente a 0, 30, 60, 90, 120, 180 y 210 min después de la inyección de nanopartículas para monitorear su distribución en circulación y el grado de apuntamiento de células cancerosas. La focalización de las células cancerosas por nanopartículas se puede observar tan pronto como 30 min postinjection dependiendo del tipo de nanopartícula probada.
- Pipetear 2-3 embriones en un plato de Petri e inmovilizarlos añadiendo cinco gotas de solución MS222 diluida (40 g/ml). Una vez que los embriones dejen de nadar, retire la mayor parte del agua para permitir que los embriones se recuestrán en sus lados.
- Utilice una pipeta con un cepillo delgado y suave unido a su extremo para alinear los embriones de modo que se recuestron en sus lados con la cara anterior hacia adelante y sólo un ojo visible.
- Imagen de los embriones en canales rojo, azul y de campo brillante a baja ampliación (2x) para capturar todo el embrión y repetir en mayor aumento (6.4x) para capturar el área de la cola. Enfoque el embrión bajo el canal rojo para evitar el sangrado de nanopartículas.
NOTA: Los embriones no deben moverse durante la toma de imágenes. Cualquier movimiento dará lugar a imágenes borrosas y la incapacidad de superponer imágenes de diferentes canales. - Agregue agua fresca de pescado a los embriones inmediatamente después de la toma de imágenes y vuelva a la incubadora. Repita los pasos 5.2-5.4 para tomar imágenes de los embriones en diferentes puntos de tiempo.
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Representative Results
El esquema de protocolo de la Figura 1 ilustra los procedimientos generales para este estudio. Se criaron peces adultos transparentes de Casper y hembras para generar embriones (sección 1). Las células HeLa RFP+ se inyectaron en el área vascularizada bajo la cavidad perivitelina de los embriones de pez cebra a 48 cvf, con embriones no inyectados como controles (sección 3). Para los individuos con experiencia en microinyección, la tasa de supervivencia de los embriones es a menudo alta, con al menos el 50% de los embriones trasplantados con células cancerosas que sobreviven en la incubadora de 35,5 oC, una temperatura subóptima para los embriones de pez cebra pero necesaria para la supervivencia y migración de las células cancerosas humanas. Las células de HeLa son altamente invasivas y pueden intravasar y propagarse a la región de la cola de los embriones tan rápido como 8 h postinyección. A las 20-24 h después del trasplante, el 50 % de los embriones trasplantados mostraron signos de propagación metastásica de las células de HeLa. Esos embriones con metástasis de cola de células cancerosas fueron seleccionados para experimentos posteriores. A 72 hpf, estos embriones se inyectaron posteriormente detrás de los ojos con nanopartículas fluorescentes azules (sección 4 y Figura 1B)o únicamente con el vehículo como controles (Figura 1A). Los embriones emparejados con la edad inyectados con nanopartículas pero sin trasplante de células cancerosas fueron el segundo grupo de controles(Figura 1C). Para obtener información más detallada sobre la síntesis, preparación y caracterización de nanopartículas, véase Peerzade et al.18.
A 0, 30, 60, 90, 120, 180, 210 min postinjection of nanoparticles, los embriones inyectados fueron monitoreados por imágenes para determinar la interacción de nanopartículas con células RFP+ HeLa, utilizando los embriones inyectados en el vehículo como controles. Específicamente, las áreas de cola de pez cebra donde las células de RFP+ HeLa se habían diseminado fueron imágenes en iluminación roja, azul y de campo brillante utilizando un microscopio fluorescente (sección 5). La caracterización detallada de la capacidad de las nanopartículas ultrabright para atacar las células cancerosas xenoinjertadas en peces cebra a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 5 de Peerzade et al.18. Los puntos rojos observados en la cola de los embriones son células de cáncer cervical humano metastásicos que eran visibles en embriones inyectados en vehículos y nanopartículas(Figura 2A, D; Figura 3A, D). Como era de esperar, no se detectaron señales fluorescentes azules específicas en embriones con la inyección solo para vehículos(Figura 2B, E). Además, cuando las imágenes capturadas en los canales rojo y azul se fusionaron, sólo se observaron células cancerosas rojas en la región de la cola sin señales azules(Figura 2C, F). Sin embargo, en los embriones que se inyectaron con nanopartículas de sílice fluorescentes ultrabright, había puntos azules en las colas, concentrados cerca y alrededor de las células cancerosas a 3,5 h(Figura 3B, E). En las imágenes superpuestas capturadas de canales rojos y azules, las células rojas de HeLa y las nanopartículas azules colocadas, vistas como puntos rosados(Figura 3C, F). En aquellos embriones que se inyectaron únicamente con nanopartículas pero no se trasplantaron con células HeLa, las partículas fluorescentes azules no se concentraron en ninguna célula o área en particular, sino que se distribuyeron relativamente uniformemente en el sistema circulatorio de los embriones, destacando los vasos sanguíneos(Figura 4B, E). Como era de esperar, no se detectaron señales fluorescentes rojas específicas en estos embriones a pesar de algunas señales fluorescentes de fondo débiles(Figura 4A, C, D, F).
Este protocolo se utilizó posteriormente para probar diferentes tipos de nanopartículas18,19,20. La colocación de células cancerosas con ciertos tipos de nanopartículas se observó tan pronto como 30 min de postinyección dependiendo de las propiedades de la nanopartícula probada. A los 120 min, había >80% apuntando a las células cancerosas por estas nanopartículas en la región de la cola de los peces. Sin embargo, para otras nanopartículas, se observó una focalización mínima de las células cancerosas, consistente con su falta de ligando específico para el cáncer. Los resultados y análisis detallados se incluyen en Peerzade et al. (ver Figura 3 y Figura 4, Figuras Suplementarias S12-S16, y Tabla Suplementaria S6)18. Estos resultados demostraron la focalización diferencial de nanopartículas a células hela xenoinjertadas en peces cebra. Por lo tanto, utilizando este protocolo, uno debe ser capaz de seleccionar eficientemente nanopartículas en función de su capacidad para reconocer y atacar las células de cáncer humano metastásicas in vivo.
Figura 1: Esquema de protocolo para estudiar la capacidad de las nanopartículas para atacar las células cancerosas humanas. Los embriones Casper transparentes se generaron a través de la cría de peces adultos machos y hembras. Los embriones fertilizados se recogieron en un plato de Petri. Con 48 cvf, las células HeLa RFP+ se inyectaron en embriones de pez cebra en la cavidad de la perivitellina, dejando algunos embriones anticuados sin inyectar como controles. A 72 cvf, se seleccionaron embriones con células RFP+ HeLa metastásicas y se dividieron en dos grupos: (A) inyectados con vehículo (H2O) como control y (B) inyectados con nanopartículas suspendidas en H2O. El tercer grupo fueron embriones a la edad que se inyectaron solo con nanopartículas(C). Los tres grupos fueron imageados bajo un microscopio fluorescente. El área en caja mostrada es donde se capturaron las imágenes (véase la figura 2-figura 4). Barras de escala para peces adultos de 1 mm y para embriones de 500 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pez cebra trasplantado con células hela metastásicas sin nanopartículas. Sólo las células heLa fluorescentes rojas eran visibles en el individuo (A, D) o imágenes superpuestas del canal rojo y el canal azul (C, F). No se detectaron señales fluorescentes azules específicas en el embrión con control de inyección del vehículo (B, E). Las imágenes en (A-C) muestran la región de cola de pescado encajonada como en la Figura 1A. Las imágenes en (D-F) son vistas ampliadas de las áreas en caja en (A-C). Escalar las barras en (A-C) a 200 m y en (D-F) a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Colocación de células rojas fluorescentes de HeLa y nanopartículas fluorescentes azules en peces cebra. Las colas de peces cebra fueron imágenes tanto en aumento bajo (A-C) y alto (D-F) en el canal rojo y azul. Las señales fluorescentes rojas revelaron células helatásicas (A, D), mientras que las señales fluorescentes azules mostraban las nanopartículas (B, E). Las imágenes superpuestas de los canales rojo y azul (C, F) muestran la colocación de células y nanopartículas de HeLa. Las imágenes se tomaron después de 3,5 h de la inyección con nanopartículas de sílice ultrabright. Las imágenes en (A-C) muestran la región de la cola de peces como encajonada en la Figura 1B. Las imágenes en (D-F) son vistas ampliadas de las áreas en caja en (A-C). Escalar las barras en (A-C) a 100 m y en (D-F) a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Pez cebra inyectado con nanopartículas sin células heLa humanas. Las nanopartículas fluorescentes azules se distribuyeron en el sistema circulatorio de los embriones en el individuo (B, E) y las imágenes superpuestas del canal rojo y azul (C, F). No se vio ninguna fluorescencia roja específica en un aumento bajo o alto (A, D) excepto en alguna fluorescencia de fondo común a los embriones de pez cebra. Las imágenes en (A-C) muestran la región de la cola de peces como encajonada en la Figura 1C. Las imágenes en (D-F) son vistas ampliadas de las áreas en caja en (A-C). Escalar las barras en (A-C) a 100 m y en (D-F) a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito aquí utiliza el pez cebra como un sistema in vivo para probar la capacidad de las nanopartículas para reconocer y atacar las células de cáncer humano metastásicas. Varios factores pueden afectar a la ejecución exitosa de los experimentos. En primer lugar, los embriones deben desarrollarse completamente a 48 cvf. La correcta etapa de desarrollo de los embriones les permite soportar y sobrevivir al trasplante de células cancerosas humanas. Los embriones menores de 48 hpf tienen una tasa de supervivencia significativamente menor en comparación con los embriones más antiguos y desarrollados. En segundo lugar, las células cancerosas deben mantenerse lo más sanas posible asegurándose de que son: 1) en la fase de crecimiento exponencial21, 2) recién cosechadas 30 min-1 h inmediatamente antes del trasplante, y 3) mantenerse calientes en todo momento. En tercer lugar, la aguja no debe estar obstruida. Pipetear las células de HeLa hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces antes de cargar la mezcla celular en la aguja. En cuarto lugar, se deben utilizar diferentes tipos de agujas para el trasplante de células cancerosas humanas y la inyección de nanopartículas. La aguja para el trasplante de células humanas es relativamente ancha, con un ángulo para evitar la obstrucción celular, mientras que la aguja para la inyección de nanopartículas es afilada y delgada. Quinto, la ubicación de la inyección difiere. La ubicación para el trasplante de células humanas es la cavidad de la perivitellina, pero para la inyección de nanopartículas, la aguja debe insertarse detrás del ojo, donde hay capilares enriquecidos. Por último, la habilidad de la persona que realiza asuntos de trasplante. Un individuo experimentado puede inyectar con precisión las células de HeLa en el espacio de la cavidad de la perivitellina, mientras que una persona inexperta a menudo inyecta células tumorales en el área de la yema donde las células tumorales apenas se propagan en el cuerpo del pez. Del mismo modo, la tasa de supervivencia de los embriones es mucho mayor cuando es manejada por un individuo experimentado, con al menos el 50% de los embriones trasplantados con células cancerosas que sobreviven.
Aunque los embriones de pez cebra generalmente se incuban a 28,5 oC, las células cancerosas humanas requieren temperaturas más altas para sobrevivir y migrar22,,23. Para permitir la supervivencia tanto de los embriones de peces como de las células cancerosas humanas, los embriones trasplantados con células cancerosas humanas se incuban a 35,5 oC en su lugar. Aunque puede ser más fácil suministrar células cancerosas en el saco de yema, apenas se propagan al sistema circulatorio. Por lo tanto, es fundamental inyectar las células cancerosas en el área vascularizada debajo de la cavidad de la perivitellina para asegurar la intravasación y la propagación de las células cancerosas. Además, uno debe tener cuidado de no añadir MS222 demasiado o demasiado concentrado al anestesiar los embriones durante la inyección y la toma de imágenes. Para ayudar en la toma de imágenes y visualización de nanopartículas, el pez cebra Casper fue elegido en lugar de peces AB. El pez Casper es un doble mutante para Nacre y Roy que carece de melanocitos e iridoforos, lo que resulta en una mayor transparencia en comparación con ab peces14. La transparencia del pez cebra Casper permite monitorear la propagación de nanopartículas en circulación y la focalización de las nanopartículas a las células cancerosas. El desafío de este protocolo es la tasa de mortalidad relativamente alta de los embriones si un individuo sin experiencia realiza el trasplante de células cancerosas humanas. Curiosamente, la inyección de nanopartículas ligeramente detrás de los ojos es relativamente bien tolerada. Esto es probablemente debido al uso de agujas más delgadas en comparación con las agujas utilizadas para el trasplante de células tumorales. Para evitar dañar las células cancerosas humanas, se deben usar agujas con aberturas anchas, pero pueden provocar daños en los embriones si se manipulan de manera inadecuada.
Este protocolo utiliza el pez cebra Casper para visualizar la focalización de las células cancerosas metastásicas con nanopartículas funcionalizadas in vivo. Una de las principales ventajas de este ensayo es que permite a los investigadores realizar imágenes en tiempo real en el transcurso del desarrollo de peces cebras para monitorear la interacción de las células cancerosas con nanopartículas. De hecho, debido a su alta fecundidad y rápido desarrollo, el pez cebra permite al investigador obtener resultados en sólo unos pocos días18,,19,,20,,24. Además, este ensayo también permite la eliminación de nanopartículas tóxicas de investigaciones adicionales si la mayoría de los embriones mueren después de la inyección de un tipo particular de nanopartícula. Aunque el pez cebra no es un mamífero, facilita la selección de un gran número de nanopartículas de una manera rápida y económica, proporcionando información útil para estudios posteriores en animales grandes y pruebas clínicas. En conjunto, el pez cebra está haciendo un impacto en la nanomedicina y la nanotecnología al ayudar a seleccionar nano sondas adecuadas para la detección temprana y la destrucción potencial de las células cancerosas a través de la focalización específica del cáncer.
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Disclosures
I.S. declara interés en NanoScience Solutions, LLC (receptor de la subvención STTR NIH R41AI142890). Todos los demás autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Sra. Kaylee Smith, a la Sra. Lauren Kwok y al Sr. Alexander Floru por revisar el manuscrito. H.F. reconoce el apoyo otorgado por el NIH (CA134743 y CA215059), la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-17-204 01-TBG) y la Fundación St. Baldrick. F.J.F.L. reconoce una beca del Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S reconoce la ayuda NSF (concesión CBET 1605405) y NIH R41AI142890.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
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