Summary
تعرض المخطوطة عينات في الموقع من أورام الدماغ البشرية مع مرحلة صلبة من الميكروسكشن المتبّرد متبوعة بتشخيطها الكيميائي الحيوي نحو اكتشاف المؤشرات الحيوية.
Abstract
على الرغم من تنوع الأدوات المتاحة لتشخيص السرطان وتصنيفه، لا تزال هناك حاجة إلى طرق تمكن من التوصيف السريع والبسيّر. وفي السنوات الأخيرة، أصبح قياس الطيف الكتلي طريقة مفضلة للتوصيف غير المُهدَّح للمركب التمييزي بوصفه علامات بيولوجية محتملة للمرض. تعتبر الفلورويدات الحيوية بشكل عام مصفوفات مفضلة نظرًا لإمكانية الوصول إليها ومعالجتها بشكل أسهل في حين أن التنميط المباشر للأنسجة يوفر معلومات أكثر انتقائية حول سرطان معين. إعداد الأنسجة للتحليل عن طريق الطرق التقليدية هو أكثر تعقيداً وتستغرق وقتاً طويلاً، وبالتالي، غير مناسب للتحليل السريع في الموقع. يقدم العمل الحالي بروتوكولًا يجمع بين إعداد العينات واستخراج الجزيئات الصغيرة في الموقع مباشرة بعد استئصال الورم. ويمكن إدخال جهاز أخذ العينات، الذي يبلغ حجم إبرة الوخز بالإبر، مباشرة في الأنسجة ثم نقله إلى المختبر القريب لإجراء تحليل فعال. نتائج تحليلات المستقلبومومات والدهون تثبت قدرة النهج لإنشاء الأنماط الظاهرية للأورام المتعلقة بالأصل النسيجي للورم، الخبيثة، والطفرات الوراثية، وكذلك لاختيار المركبات التمييزية أو المؤشرات الحيوية المحتملة. وتسمح الطبيعة غير التدميرية لهذه التقنية بأداء الاختبارات المستخدمة بشكل روتيني، مثل الاختبارات النسيجية، على نفس العينات المستخدمة في تحليل SPME، مما يتيح الحصول على معلومات أكثر شمولاً لدعم التشخيص الشخصي.
Introduction
التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) هما الطريقتان الرئيسيتان المستخدمتان في تحليل آفات الدماغ في الوقت الحقيقي. ويستند تمايز ورم الدماغ عموما على علم الأنسجة مع تلطيخ إضافية وتقنيات متقدمة مناعية. وفقًا للتوجيهات المحدثة حول أورام الدماغ العصبية المركزية الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) في عام 2016 ، تعد الاختبارات الجينية حاسمة لتمايز وتصنيف هذه الأورام1. التمايز وتصنيف الأورام تسمح للأطباء لاختيار العلاج الأكثر فعالية لنوع معين من الورم وبالتالي توسيع العمر المتوقع للمريض. للأسف، على الرغم من توافر هذه الأساليب المتقدمة لمساعدة الأطباء في اختيار العلاج الأمثل لمرضاهم، فإن متوسط العمر المتوقع للمرضى الذين تم تشخيصهم بالورم الأرومي (الورم الدبقي الصف الرابع) هو فقط حوالي 15-16 شهرا2. حتى مع تطور وزيادة دقة التصوير وقال وأساليب علم النسيج كأدوات التشخيص، لا تزال هناك حاجة كبيرة لتقنيات جديدة قادرة على تقديم معلومات تكميلية لمساعدة الأطباء في القرارات المتعلقة مسار العلاج. على مدى السنوات الماضية، وقد اقترح العديد من النهج الجديدة على أساس القياس الطيفي الشامل لتحليل داخل العملية من السرطان3،4. وقد تم بالفعل إثبات إمكانات الطور الصلب microextraction (SPME)، الطريقة المعروضة هنا، كأداة تحليل سريعة في الموقع، في مجموعة متنوعة من الدراسات5. تُظهر المخطوطة الحالية أحد التطبيقات السريرية للطريقة، وهي الأيض غير المستهدفة وومنومات الدهون لأورام الدماغ البشرية. 10- تمثل التحقيقات غير المستهدفة نقطة انطلاق هامة في اكتشاف المؤشرات البيولوجية المحتملة. وبمجرد إنشاء هذه المؤشرات الحيوية، يمكن استخدامها كمراجع تشخيصية للتمييز بين الأورام باستخدام نفس التكنولوجيا إلى جانب الأجهزة في الموقع.
SPME هو تقنية إعداد العينة القائمة على التوازن التي تستخرج جزيئات صغيرة من مصفوفات العينات مع استخدام كميات صغيرة من مرحلة الاستخراج. في تكوين SPME الأكثر تقليدية من الجهاز (مسبار) ، والألياف المغلفة مع مرحلة الاستخراج المناسبة وشل على دعم الصلبة أي ، سلك معدني5،6. 30- وتتيح الطلاءات والأجهزة التي يمكن تحقيقها من التجانس الحيوي (المجسات) الاستخراج مباشرة من المصفوفات البيولوجية المعقدة دون المعالجة المسبقة للعينات، مثل التجانس والترشيح. ومن خلال عملية الاستخراج، يتم تقسيم التحليلات بين مرحلة الاستخراج ومصفوفة العينة بما يتناسب مع تركيزاتها الأولية. إذا تم استخراج لفترة طويلة بما فيه الكفاية، ثم يتحقق التوازن. وبينما يوفر الاستخراج عند التوازن أعلى درجة من الحساسية وإمكانية التكاثر، فإن الاستخراج قبل التوازن ممكن أيضاً بل ويفضل في بعض الحالات، أي في أخذ العينات الحية، حيث تستلزم قيود الوقت المرتبطة بأخذ العينات في الموقع (مثل غرف التشغيل أو الطوارئ) عمليات استخراج سريعة. ويتأثر ملف تعريف وقت الاستخراج الخاص بعمود التحليلات المُعطى عموماً بالخصائص الفيزيائية الكيميائية للـ"التحليل"، والمصفوفة التي يتم أخذ عينات منها، ونوع المادة الماصة المستخدمة، وعدة حالات استخراج أخرى. مجموعة كبيرة من العوامل التي تحكم حركية استخراجها يجعل من المستحيل عمليا لضمان استخراج التوازن لجميع المركبات عندما يتم إجراء تحليلات غير مستهدفة مثل المستقلبوموم أو الدهون. وللأسباب المذكورة أعلاه، تم تحديد وقت استخراج البروتوكول الحالي بشكل تعسفي لضمان حساسية مرضية وتغطية الأيض من ناحية، ومدى التطبيق العملي للاستخدام في الموقع من ناحية أخرى.
10- وينبغي التأكيد على أن الحجم الصغير جداً للمسبارات المستخدمة لاستخراج العينة من الأنسجة لا يؤدي إلا إلى الحد الأدنى من تلف الأنسجة في حين أن إجراء أخذ العينات نفسه لا يستهلك أي نسيج بل كميات صغيرة جداً من الجزيئات الصغيرة من المنطقة التي تم أخذ عينات منها؛ ولذلك، يمكن استخدام نفس العينة كذلك في الاختبارات الروتينية، أي النسيجية أو الجينية، مما يتيح الحصول على معلومات أساسية ومكملة من نفس العينة. ومن شأن هذه البيانات التكميلية والشاملة أن تمكن من فهم أفضل لبيولوجيا الأورام، ونأمل أن تسهل اكتشاف أهداف علاجية جديدة. كما أن استغلال هذه الطريقة يزيد من إمكانية إجراء تشخيصات داخل الموقع أثناء العمليات عند تحديد المؤشرات الحيوية المستهدفة.
أدناه نقدم بروتوكولات لأخذ العينات من أورام الدماغ في الموقع لتحليلات المستقلب وعلم الدهون ومعالجة البيانات.
Protocol
وقد وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا في كوليجيوم ميديكوم في بيدغوسز في جامعة نيكولاوس كوبرنيكوس في تورون (KB 628/2015) على الدراسة المقدمة هنا. تذكر أن ترتدي دائماً معطف المختبر وأي معدات أخرى للسلامة الشخصية المطلوبة، مثل (على سبيل المثال لا الحصر) قفازات السلامة والنظارات. لا تلمس مرحلة الاستخراج من مسابير الطور الصلب (SPME).
1- إعداد أجهزة SPME
- استخدام مسابير (الألياف) مع وضع مختلط و الطلاء C18 لميولومات ودهونوميوم، على التوالي. جمع مجموعتين من العينات, واحدة لميولوميكس واحدة والدهون.
- ضبط طلاء المسبار إلى طول الأمثل عن طريق تقليم المسبار SPME. في الدراسة الحالية، كان طول الطلاء المحدد 7 ملم. حدد طول الألياف وفقًا لحجم الورم قيد الدراسة ، مما يضمن أن المادة الماصة بأكملها يمكن أن تكون مغمورة في الورم (الشكل 1).
- شرط الطلاء من مسابير عن طريق نقع لهم في الميثانول: الماء 50:50 v/ v خليط لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل إجراء الاستخراج. نقل الألياف إلى موقع أخذ العينات (على سبيل المثال، المستشفى) في قارورة تحتوي على حل تكييف.
2- إجراء جمع العينات
- لا تغسل الورم أو تُجرّه قبل استخراجه.
- بدء أخذ العينات في أقرب وقت ممكن بعد إزالة الورم (2 دقيقة في الدراسة المقدمة).
ملاحظة: ضبط الوقت حسب الإعداد في الموقع لمرفق معين (مسافة موقع عمل الباحث من جدول التشغيل) والحفاظ على ثابت للدراسة بأكملها. التقليل من الوقت المنقضي بين إزالة الورم وبدء الاستخراج أمر بالغ الأهمية لالتقاط الأيض غير المستقرة التي تتحلل بعد قطع الدورة الدموية من الأنسجة المدروسة. - قم بأخذ العينات في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، ضع العينة على الجليد عندما يتم الاستخراج. في كلتا الحالتين، والحفاظ على نفس الشروط لمجموعة كاملة من العينات.
- أخرج المسبار من القارورة
- اغسل الألياف باستخدام قياس الطيفي اللوني الكتلي السائل (LC/MS) للمياه الصف لمدة 5 s عن طريق غمرها في LC / MS درجة المياه. لا تدع المواد الماصة الجافة قبل إدراج الألياف لضمان إعادة إنتاج جيدة من البيانات.
- أدخل الألياف في أنسجة ورم الدماغ على قدر الإمكان، مما يضمن أن مرحلة الاستخراج بأكملها تقع داخل الورم.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم استخراج في تكرار من أجل تحديد طبيعة غير متجانسة من الورم (الشكل 2). يوصى بثلاثة نسخ متماثلة لكل عينة. - اترك المسبار لمدة 30 دقيقة في الأنسجة (مقاسة مع جهاز توقيت).
- استخدام ضوابط فارغة للقضاء على مصادر الخطأ المتعلقة بوجود القطع الأثرية المنبثقة من مصادر أخرى غير الورم العينة. للحصول على عناصر تحكم فارغة، تخضع الألياف لنفس سير العمل التحليلي، كما هو موضح أعلاه، ولكن دون خطوة أخذ العينات (الإدراج في الأنسجة أو أي عينة/مصفوفة أخرى). في خطوة معالجة البيانات، تجميع التحليلات المستخرجة من هذه الألياف في "قائمة استبعاد" لاستبعاد الإشارات المشتقة من الملوثات الناجمة عن المذيبات أو تصنيع الألياف. من المستحسن استخدام 3 نسخ متماثلة على الأقل من فارغة.
ملاحظة: للتحقق من مخاطر التلوث، من الضروري إجراء أخذ العينات من القفازات أو الجداول أو الأجهزة أو أي أسطح أخرى قد تشكل خطر تلوث. في مثل هذه الحالات، إعداد الألياف، وقت الاستخراج، وبروتوكولات desorption هي نفسها التي للعينات. - أثناء الاستخراج يجري، تسمية قنينات لاستخدامها لتخزين المسابير بعد الاستخراج.
- بعد 30 دقيقة، وإزالة الألياف (ق) من ورم في الدماغ.
- غسل الألياف بالماء لمدة 3 ق عن طريق غمرها في LC / MS درجة المياه لإزالة بقايا الدم أو حطام الخلية من التحقيق حتى استخراج النهائي يحتوي على جزيئات صغيرة فقط. لا ينصح خطوة الغسيل لفترة أطول لأنها قد تؤدي إلى فقدان المركبات القطبية.
- 3. شلّس الألياف في الحاجز قبل الفتح لغطاء القارورة السائل عالي الأداء (HPLC) عن طريق ثقب الحاجز من الأسفل مع الطرف غير المغلف من الألياف.
- وضع الألياف شلت في الغطاء في قارورة HPLC منفصلة ووضعها في حاوية النقل المحدد.
- تنفيذ الخطوات 2.11-2.13 للألياف المخصصة لعناصر تحكم فارغة.
3- النقل والتخزين
ملاحظة: تتوفر عدة خيارات لنقل العينات إلى المختبر. ويوصى باستخدام صندوق ديوار أو البوليسترين النيتروجيني السائل المملوء بالجليد الجاف في النقل؛ بدلا من ذلك، يمكن استخدام حزم الثلج للنقل الفوري والسريع.
- ضع القوارير مع الألياف في حاوية النقل.
- عند وصول المختبر، ضع على الفور قارورة مع ألياف SPME في -80 درجة مئوية أو -30 درجة مئوية الفريزر. لا تخزن الألياف لمدة أطول من 3 سنوات في -30 درجة مئوية أو 5 سنوات في -80 درجة مئوية.
4- إعداد العينة لتحليل الاستقلابات
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة فقط بمجرد أن يتم تجميع كافة العينات لتجربة.
- قبل التحليل الآلي، وإعداد خليط المذيبات desorption: الأسيتونيتريل: الماء 80:20 v/v.
- أخرج القنينات التي تحتوي على ألياف الوضع المختلط من الفريزر. استخدم هذه لتحليل الاستقلاب.
- قنينات التسمية لاستخدامها في إزالة.
- الماصات 300 μL من حل desorption (أعدت في الخطوة 4.1) في إدراج الزجاج وضعت في قوارير 2 مل.
- قم بإجراء desorption من كل ألياف توضع في إدراج منفصل عن طريق غمر الطلاء بالكامل في مذيبات desorption ، ثم تهيجها لمدة 120 دقيقة في 1200 دورة في الدقيقة باستخدام دوامة.
- بعد 120 دقيقة (مرة واحدة يتم الانتهاء من إزالة) إزالة قبعات مع تحقيقات.
- إعداد عينة QC عن طريق خلط 10 ميكرولتر aliquots من كل عينة من مجموعة العينة. حجم مجموعة عينة يعتمد على التصميم التجريبي. من المهم تحليل جميع العينات دفعة واحدة.
- أغلق القنينات بحروف قبعات جديدة.
- ضع القوارير في الختم التلقائي (4 درجات مئوية) من مطياف الكتلة عالية الدقة (LC-HRMS) وينتقل إلى الخطوة 5.
ملاحظة: ترتيب الحقن العشوائي للعينات بما في ذلك الفراغات التحكم. حقن عينة QC بعد كل عينات 8-10 لرصد استقرار الصك.
5- تحليل النواتج الأيضية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة المُعكسة للمرحلة والمطياف الكتلي عالي الاستبانة (تحليل RPLC-HRMS)
- إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين الإيجابي.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع الإيجابي على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 80-1000؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ القرار 000 70؛ تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 1.5 كيلو فولت؛ مستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة: 55٪؛ S-عدسة الجهد: 25 V؛ كاشطات الجهد: 15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية: 300 درجة مئوية؛ غاز غدد: 40 a.u.; aux الغاز: 15 a.u.; aux درجة حرارة سخان الغاز: 300 درجة مئوية. وقد تم تكييف هذه الطريقة الكروماتوغرافية من فوكوفيتش وآخرون7. حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين السالب.
ملاحظة: المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع السلبي: مسح النطاق: م / ز 80-1000؛ القرار 000 70؛ تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 2.5 كيلو فولت؛ مستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة: 55٪؛ S-عدسة الجهد: -25 V؛ الكاشطات الجهد: -15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية: 256 درجة مئوية غاز غدد: 48 a.u; aux الغاز: 11 a.u.; aux درجة حرارة سخان الغاز: 413 درجة مئوية. وقد اعتمد هذا الأسلوب الكروماتوغرافي من فوكوفيتش وآخرون7. حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - معايرة الصك على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم معايرة الجهاز باستخدام المعايرة الخارجية كل 48 ساعة، مما أدى إلى دقة الكتلة <2 جزء في المليون. - ابدأ التحليل بالنقر فوق الزر ابدأ في البرنامج الذي يعمل على تشغيل الأداة.
- عند اكتمال التحليل، استبدل عمود RPLC بعمود HILIC، ثم غيّر مراحل الهاتف المحمول ثم انتقل إلى الخطوة 6.
6- تحليل الأيض باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة التفاعل المائي والمطياف الكتلي عالي الاستبانة (تحليل HILIC-HRMS)
- إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين الإيجابي.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع الإيجابي على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 80-1000؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ القرار 000 70؛ تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 1.5 كيلو فولت؛ مستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة: 55٪؛ S-عدسة الجهد: 25 V؛ كاشطات الجهد: 15 V. غاز غدد: 60 a.u.; aux الغاز: 40 a.u.; aux درجة حرارة سخان الغاز: 425 درجة مئوية؛ الشعيرات الدموية درجة الحرارة: 325 درجة مئوية. تم تكييف الأسلوب الكروماتوغرافي من فوكوفيتش وآخرون7. حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين السالب.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع السلبي على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 80-1000؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 100000000000000000000000000000 القرار 000 70؛ تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 1.3 كيلو فولت؛ S-عدسة الترددات اللاسلكية المستوى: 55٪؛ S-عدسة الجهد: -25 V؛ الكاشطات الجهد: -15 V. الشعيرات الدموية درجة الحرارة: 263 درجة مئوية؛ غاز غدد: 60 a.u.; aux الغاز: 30 a.u.; aux درجة حرارة سخان الغاز: 425 درجة مئوية. تم تكييف الأسلوب الكروماتوغرافي من فوكوفيتش وآخرون7. حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - معايرة الصك على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم معايرة الجهاز باستخدام المعايرة الخارجية كل 48 ساعة، مما أدى إلى دقة الكتلة <2 جزء في المليون. - ابدأ التحليل بالنقر فوق الزر ابدأ في البرنامج الذي يعمل على تشغيل الأداة.
7. إعداد العينة لتحليل الدهون
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة فقط بمجرد أن يتم تجميع كافة العينات للتجربة.
- قبل البدء في التحليل، وإعداد خليط المذيبات desorption: isopropanol: الميثانول 50:50 v/v.
- أخرج القنينات التي تحتوي على ألياف C18 المخصصة لتحليل الدهون من الفريزر.
- قنينات التسمية لاستخدامها في إزالة.
- الماصات 200 μL من حل desorption (أعدت في الخطوة 7.1) لإدراج الزجاج silanized وضعت في قوارير 2 مل.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام المكونات غير المُسَيَنة، ولكن استخدامها قد يؤدي إلى سوء استنساخ المركبات ذات اللولب العالي، لأن هذه المركبات يمكن أن تُلصق على وجه التحديد بالجدران الزجاجية. - قم بإجراء desorption من كل ألياف في إدراج منفصل عن طريق غمر الطلاء بالكامل في مذيبات desorption ، ثم تهيجها لمدة 60 دقيقة في 1200 دورة في الدقيقة باستخدام دوامة.
- بعد 60 دقيقة عندما يتم الانتهاء من إزالة desorption قبعات مع تحقيقات.
- إعداد عينة QC عن طريق خلط 10 ميكرولتر aliquots من كل عينة من مجموعة العينة. حجم مجموعة عينة يعتمد على التصميم التجريبي. من المهم تحليل جميع العينات دفعة واحدة.
- أغلق القنينات بحروف قبعات جديدة.
- ضع القنينات في الختم التلقائي (4 درجة مئوية) من مطياف الكتلة عالية الدقة (LC-HRMS) وانتقل إلى الخطوة 8.
8. تحليل الدهون باستخدام مسار الكروماتوغرافيا السائلة المرحلة عكسي وقياس الطيف الكتلي عالية الاستبانة (تحليل RPLC-HRMS)
- إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين الإيجابي.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع الأيوني الإيجابي على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 100-1000؛ و 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 3.5 كيلو فولت، S-عدسة الترددات اللاسلكية مستوى: 55٪؛ S-عدسة الجهد: 25 V؛ كاشطات الجهد: 15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية 275 درجة مئوية؛ غاز غدد: 30 a.u.; aux الغاز: 10 a.u.; الغاز الاحتياطي: 2 a.u. مسبار سخان درجة الحرارة 300 درجة مئوية. وكانت المعلمات LC المستخدمة: المرحلة A: الميثانول: الماء, 40:60 مع 10 mM خلات الأمونيوم و 1 mM حمض الخليك; المرحلة B: ايزوبروبانول: الميثانول، 90:10 مع خلات الأمونيوم 10m و 1 mM حمض الخليك. التدرج: 0 دقيقة – 20% B; 1.0 دقيقة – 20% B; 1.5 دقيقة – 50% B; 7.5 دقيقة – 70% B; 13.0 دقيقة – 95% B; 17.0 دقيقة – 95% B; 17.1 دقيقة – 95.5 % ب؛ 23.0 دقيقة – إيقاف; عمود C18، 3.5 ميكرومتر، 2.1 مم × 75 مم؛ تدفق: 0.2 مل / دقيقة؛ درجة حرارة الفرن: 55 درجة مئوية؛ حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين السالب.
ملاحظة: كانت البارامترات المستخدمة في الدراسة الحالية على النحو التالي: معلمات نظام إدارة الموارد البشرية لوضع أيونات سالب: نطاق المسح: m/z 100-1000؛ و المعلمات الخاصة بـ 20000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ حقن الوقت إلى C-فخ: السيارات; رذاذ الجهد: 3.5 كيلو فولت، S-عدسة الترددات اللاسلكية مستوى: 55٪؛ S-عدسة الجهد: -25 V؛ الكاشطات الجهد: -15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية 275 درجة مئوية؛ غاز غدد: 30 a.u; aux الغاز: 10 a.u.; الغاز الاحتياطي: 2 a.u; مسبار سخان درجة الحرارة 300 درجة مئوية. طريقة الكروماتوغرافي: نفس في 8.1. - معايرة الصك على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم معايرة الجهاز باستخدام المعايرة الخارجية كل 48 ساعة، مما أدى إلى دقة الكتلة <2 جزء في المليون. - ابدأ التحليل بالنقر على زر ابدأ في البرنامج الذي يعمل على تشغيل الأداة.
- عند اكتمال التحليل، استبدل عمود RPLC بعمود HILIC، ثم غيّر مراحل الهاتف المحمول ثم انتقل إلى الخطوة 9.
9. تحليل الدهون باستخدام التفاعل الهيدروفيلي السائل الكروماتوغرافيا والمطياف كتلة عالية الدقة (HILIC-HRMS تحليل)
- إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين الإيجابي.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع الأيوني الإيجابي على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 100-1000؛ و 100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ رذاذ الجهد: 1.5 كيلو فولت؛ مستوى الترددات اللاسلكية S-عدسة: 55٪؛ S-عدسة الجهد: 25 V؛ كاشطات الجهد: 15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية 325 درجة مئوية؛ غاز غدد: 60 a.u.; aux الغاز: 30 a.u.; الغاز الاحتياطي: 2 a.u. درجة حرارة سخان المسبار 320 درجة مئوية. LC كانت المعلمات المستخدمة: المرحلة A: 5 mM خلات الأمونيوم في الماء; المرحلة B: الأسيتونيتريل؛ التدرج: 0 – 2دقيقة – 4% B; 15.0 - 20٪ باء؛ 15.1 – 4% ب, 21.0 دقيقة – إيقاف; 3 ميكرومتر 100 مم × 2.1 مم عمود؛ تدفق: 0.4 مل / دقيقة؛ درجة حرارة الفرن: 40 درجة مئوية؛ حجم الحقن: 10 ميكرولتر. - إعداد معلمات تحليل LC-HRMS ووضع التأين السالب.
ملاحظة: كانت المعلمات المستخدمة في الدراسة الحالية في الوضع الأيوني السالب على النحو التالي: نطاق المسح: m/z 80-1000؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1000 م؛ و 1 تم إجراء عملية الاستحواذ باستخدام AGC (1,000,000 أيونات)؛ رذاذ الجهد: 1.5 كيلو فولت، S-عدسة الترددات اللاسلكية مستوى: 55٪؛ S-عدسة الجهد: -25 V؛ الكاشطات الجهد: -15 V. درجة حرارة الشعيرات الدموية 320 درجة مئوية؛ غاز غدد: 50 a.u.; الغاز aux: 21 a.u.; الغاز الاحتياطي: 3 a.u. مسبار سخان درجة الحرارة 320 درجة مئوية. وكانت طريقة الكروماتوغرافيا هي نفسها التي وصفت في 9.1. - معايرة الصك على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: في الدراسة الحالية، تم معايرة الجهاز باستخدام المعايرة الخارجية كل 48 ساعة، مما أدى إلى دقة الكتلة <2 جزء في المليون. - ابدأ التحليل بالنقر فوق الزر ابدأ في البرنامج الذي يعمل على تشغيل الأداة.
10 - تجهيز البيانات والتحليل الإحصائي
- معالجة البيانات باستخدام برنامج متوافق مع تنسيق ملفات البيانات الأولية.
- إجراء تحليل إحصائي باستخدام البيانات المعالجة.
ملاحظة: يعتمد نوع الاختبار على الفرضية العلمية وتصميم الدراسة. في الدراسة الحالية، تم استخدام التحليل المكون الرئيسي، التحليل الجزئي-الأقل مربع-Discriminant، و ANOVA في اتجاه واحد.
Representative Results
استغلال الطور الصلبة microextraction كأسلوب إعداد عينة في تركيبة مع الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي عالي الدقة وبرنامج معالجة البيانات المتقدمة سمح لنا بنجاح لتوصيف الأيض والدهون من أورام الدماغ البشرية. والمسبار، الذي يعادل حجمه إبرة الوخز بالإبر، تسبب في الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المدروسة وعدم استهلاك الأنسجة، وبالتالي، مما مكن من زيادة استخدام العينات للدراسات النسيجية أو الوراثية. وتم الحصول على فصل مرضي للمجموعات المختارة لكل من الأعمدة المعكوسة في المرحلة وأعمدة HILIC، ولأساليب التأين في تحليلات المستقلبوموميات ونواتج الدهون. 11- وقد وفر استخدام كل من طرق الفصل ليس فقط في المستقلبوميكس، بل أيضاً في تحليل المواد الدهنية بيانات تكميلية قيمة. يفصل عمود المرحلة المعكوسة الدهون فيما يتعلق بطول سلاسل الكربون الخاصة بها ووجود السندات غير المشبعة ، في حين أن عمود HILIC مفيد في تحديد فئات الدهون ، وخاصة الفوسفاتية8.
ووجد أن استنساخ التحليل الآلي جيد جداً استناداً إلى التجميع الضيق لعينات مراقبة الجودة على مخطط تحليل المكون الرئيسي(الشكل 3A، عينات مراقبة الجودة الثلاث التي حقنت كل ثمانية عينات من المرضى على طول تداخل التسلسل). وعلاوة على ذلك، وجد أن فراغات الاستخراج المستخدمة لتحليل الرقابة السلبية منفصلة بشكل جيد عن العينات الحقيقية. وقد سهلت المجموعة الواسعة من التحليلات المستخرجة من خلال المسابير اكتشاف الأنواع التمثيلية، مما سمح بنجاح بالتمايز بين أورام الدماغ البشرية على أساس أصلها النسيجي، والتشويه، وعوامل أخرى (على سبيل المثال، وراثية). ويبين الشكل 3B بيانات علم الدهون للعينات التي تم جمعها من المرضى الذين يعانون من الأورام الدبقية والوريجية. كان التمايز بين هذه الأورام ، التي تميزت بأصل ثديي مختلف و خبيث ، هدفًا مهمًا للدراسة ، حيث تعتبر الأورام السحائية عمومًا أورامًا حميدة ، في حين أن الأورام الدبقية هي واحدة من أكثر الأورام الخبيثة. بالإضافة إلى ذلك، في الشكل 4 الذي يعرض بيانات المستقلبوميات، تم تقسيم الأورام الدبقية على أساس درجة خبيثتها إلى عالية ومنخفضة. تمت مقارنة هذه المجموعات الفرعية مع النمط الظاهري الجزيئي لأورام السحائية. ولوحظ في كلتا الحالتين الفصل البارز بين المجموعات. في الوقت الحاضر، يعتمد تشخيص الورم الدبقي في المقام الأول على تحديد الطفرات الوراثية المحددة في عينات الورم. ولذلك، تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها ببيانات الـ genotyping. ويعرض الشكل 5 ألف فصل العينات مع الكشف عن الحذف المشترك 1p19q والعينات التي لم يتم فيها ملاحظة الطفرة.
كما يسمح التحليل الإحصائي باختيار المركبات في المجموعات المدروسة. ويمكن اعتبار هذه المركبات مؤشرات بيولوجية محتملة في الحالات التي يتم فيها أخذ عينات من مجموعة كبيرة بشكل مناسب. غير أن هناك حاجة إلى إجراء تحليل أكثر تعمقا، بما في ذلك التأكيد القاطع للمركبات المكتشفة عن طريق التشظي ومقارنة الأنواع المكتشفة بالمعايير التحليلية، وذلك لاستخلاص استنتاجات نهائية ذات طبيعة بيولوجية. وترد أمثلة على هذه الأيضات discriminant في الشكل 3C والشكل 5B. وقد تأكدت هويات هذه المركبات، أي sphingomielyn: SM d36:1 وproline بمقارنة أنماط تجزئة الأيض من العينة والمعايير الأصلية.
الشكل 1: ألياف SPME المعدة لعملية الاستخراج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استخراج ورم السحاري باستخدام مسابير SPME. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: PCA ومربع المؤامرات للورم الدبقي والرما السحايا. الرئيسية مؤامرة تحليل المكون تحتوي على (A) جميع العينات تحليلها بما في ذلك الفراغات، QC استخراج، الفراغات، الأورام السحاية، الأورام الدبقية؛ (B) التي تحتوي على مجموعات درس فقط (بعد استبعاد الفراغات وQCs)؛ (C) مربع شعير مؤامرة لsphingomielyn: SM d36:1 مُميز المريض مع الورم الدبقي والورم السحاري. بيانات علم الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنسولينا ل HGG، LGG والروما السحايا. الرئيسية مؤامرة تحليل المكونات تبين التفريق بين (A) ارتفاع درجة الدبقية (HGG) و المقاومة (MEN)9 و (ب) انخفاض درجة الدبقية (LGG) و 500 000 100 1000 بيانات الاستقلاب التي أعيد طبعها من فيا ميديكا المرجع9 بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: PCA ومربع المؤامرات للورم الدبقي مع وبدون حذف. (أ)أظهرت مؤامرة تحليل المكونات الرئيسية الاختلافات في المرضى الذين يعانون من وبدون الحذف المشترك 1p19q؛ (B) مربع شعيرات المؤامرات للمرضى proline متباينة مع وبدون المشاركة في حذف 1p19q؛ n-بدون حذف، y مع الحذف. بيانات الأيض من فضلك انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وتستخدم عادة المستقلب غير المستهدفة وعلم الدهون في الدراسات التي تركز على تحديد المؤشرات الحيوية الورم. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، يبحث الباحثون عن المركبات التي يمكن استخدامها لفحص المرض. وبالتالي، فإن العينات البيولوجية المفضلة هي الدم أو البول بسبب سهولة الوصول إليها نسبياً. يتم إجراء تحليل أنسجة الورم بشكل رئيسي لفهم الآليات الكامنة وراء المرض ، وتوصيف أنواع الأورام المختلفة ، إلخ. ونادرا ما يتم إجراء التحليل في الموقع من المؤشرات البيولوجية الورم، مثل هذه التطبيقات تتطلب إعداد عينة واسعة النطاق. بدلا من ذلك ، استراتيجيات تقوم على تحليل في الوقت الحقيقي من ملامح الأنسجة دون الاختيار المسبق للعلامات الحيوية محددة وكسب اهتمام المجتمع الطبي3،4. ويقدم الحل المعروض هنا منظورا آخر لمعالجة الأنسجة في الموقع من خلال الكشف عن نوع المعلومات التي يمكن الحصول عليها عن طريق هذه الأساليب.
إن الجمع بين أخذ العينات وإعداد العينات والاستخراج يجعل البرنامج أداة مفيدة جداً للتحليل في الموقع. وعلاوة على ذلك، فإن عدم استهلاك الأنسجة أثناء أخذ العينات يتيح مواصلة استخدام نفس العينات لتحليل العلامات البيولوجية والاختبارات الروتينية (genotyping، التحليل النسيجي)، وبالتالي، إضافة معلومات جديدة إلى نتائج الاختبارات القياسية. جهاز أخذ العينات لديه تصميم بسيط جدا، وتشغيلها من السهل جدا، وليس هناك حاجة إلى تدريب خاص لأداء الاستخراج نفسه. ومع ذلك، تحقيق نتائج موثوقة يتطلب أكثر بكثير من مجرد التعامل السليم مع الأجهزة. لتنفيذ التجربة بشكل صحيح، يحتاج المرء إلى فهم عملية الاستخراج، وطبيعة العينة، وأن يكون على بينة من الأخطاء المحتملة التي يمكن أن تؤثر على البيانات.
من المهم النظر في عدم تجانس الأنسجة السرطانية10; قد تحتوي على عينات من الأورام أجزاء تمر نخر, تكلس, ونقص الأكسجة, وسوف تنعكس كل من هذه العمليات في المستقلب والدهون التي تم التوصل إليها, وبالتالي التأثير على النتائج. لذلك ، يوصى بأن يتم أخذ عينات التحليل المكاني عن طريق إدخال العديد من الألياف في أجزاء مختلفة من الأنسجة السرطانية ، أو بدلاً من ذلك ، أن يتم استخدام طلاء أطول لاختراق الورم بأكمله وذلك للحصول على معلومات متوسطة عن الورم. إذا تم تنفيذ طريقة أخذ العينات التحليل المكاني ، يمكن أن تكون جميع الألياف مُزَلَّة في مذيب واحد للدِّر الامتصاص ؛ وهذا لن يسمح فقط لتحقيق المعلومات الشاملة عن الورم، ولكن أيضا زيادة حساسية التحليل. بدلا من ذلك ، فإن إزالة الألياف الفردية في قوارير منفصلة من شأنه أن تمكن التحقيقات لمعرفة التنوع الداخلي للورم الدماغ ، والذي يتكون من جوهر بنيت من الخلايا السرطانية ، والمنطقة الخارجية ، وهي حدود الأنسجة السليمة. أجزاء أعمق من الورم وعادة ما تكون أكثر تضررا من العمليات المتعلقة بالسرطان11. ومع ذلك، يجب أن نأخذ في الاعتبار المحققين أن هذا الخيار يعرض للخطر حساسية الأسلوب والعدد الإجمالي للمركبات القابلة للكشف. في العمل الحالي، تم استخدام طلاء 7 مم؛ واعتبر هذا الطول الأمثل لمختلف أحجام الأورام المدرجة في الدراسة. اخترقت الطلاءات الأورام ، وبالتالي قدمت دقة غير خاصة ، ولكن متوسط البيانات عبر العينة. بغض النظر عن البروتوكول المحدد، من المهم أن يتم اتباع نفس البروتوكول خلال الدراسة بأكملها، بما في ذلك عدد الألياف المستخدمة لأخذ العينات الفردية، وطول الطلاء، ووقت الاستخراج، وجميع العوامل الأخرى المحددة في هذا العمل.
من المهم التحكم في جودة التحليل. ينبغي إعداد وحدة مراقبة الجودة المجمعة (انظر الخطوتين 4.7 و7.7 في البروتوكول) واستخدامها لمراقبة استقرار الأداة أثناء تشغيل دفعة العينة بأكملها. ويمكن فيما بعد استخدام عناصر التحكم الفارغة (انظر الخطوة 2-8) لإعداد "قائمة استبعاد" لإزالة إشارات الملوثات الناشئة عن المذيبات أو تصنيع الألياف. في المناسبات الخاصة، مثل خطر التلوث، من الضروري إجراء أخذ العينات من القفازات أو الجداول أو الأجهزة أو أي أسطح أخرى قد تشكل خطر تلوث. في مثل هذه الحالات، وإعداد الألياف، والوقت من استخراج وخلع بروتوكولات هي نفسها كما للعينات.
تركز التحليلات الأيضية والدهونية بشكل كامل على الجزيئات الصغيرة (أقل من 1500 د) التي تظهر في كائن حي أو مكونات محددة من الكائن الحي ، مثل أعضاء محددة ، الأنسجة ، السوائل ، الخلايا ، إلخ. تقدم نواتج الأيض والدهون صورة عن التغيرات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الجسم، وفي حالة السرطان، فإنها تدمج المعلومات المتعلقة بالجينوم، وعلم الأنسجة، والتشويه للورم. هذه العلوم omics خلق اتصال بين علم وظائف الأعضاء والنمط الظاهري كما الأيض هي أعلى في السلم الكيميائي الحيوي من البروتينات أو الجينات12. من خلال فهم المستقلب والدهون من الأورام السرطانية، ونحن نقترب من اكتشاف النمط الظاهري بين جميع العلوم -omics كما تقدم هذه الفروع من الدراسة معرفة أكثر عمقا من التغيرات الديناميكية للجزيئات كاستجابة للكائنات الحية لمختلف المحفزات. وكما هو معروض في هذا العمل، فإن البيانات التي تم الحصول عليها في عينة واحدة تتوافق مع الأنسجة السرطانية، ودرجة خبيثته، وتعكس التغيرات التي تحدث على مستوى الجينوم. في الأورام الدبقية ، كنوع من السرطان ذات الاهتمام في هذه الدراسة ، فإن المعلومات المخفية في الجينوم مهمة بشكل خاص ، حيث يتم تطوير علاج شخصي استنادًا إلى نتائج الاختبارات الجينية. الطفرات معينة هي علامات التكهن من نتائج العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي. وكما هو موضح هنا، فإن اختيار المؤشرات البيولوجية التي تعكس طفرة معينة ممكن مع الاستراتيجية المقترحة. يمكن أيضًا استخدام علامات الطفرات ، وكذلك أنواع الواصفات الإضافية مثل تلك التي تشير إلى درجة الورم الخبيث لدعم طرق التشخيص الروتينية.
السابق vivo خزعة كيميائية مع استخدام الألياف الدقيقة المرحلة الصلبة هي الخطوة الأولى في تطبيق الأسلوب لتشخيص داخل العملية. يمكن اعتماد الأسلوب بسهولة لأخذ العينات في الجسم الحي في انتظار إذن من المجالس الأخلاقية المناسبة. وفي هذه الحالات، يجب أن يتم تعقيم أجهزة الـ SPME وفقاً لإجراءات التعقيم المقبولة في المستشفى حيث يتعين إجراء أخذ العينات، أي التعقيم التلقائي أو تعقيم أكسيد الإيثيلين. يجب أن تبقى الألياف المُكيفة والمعقمة مسبقًا في عبوات مختومة تحمل تاريخ انتهاء صلاحية التعقيم. من المهم ملاحظة أنه لا ينبغي تنظيف الألياف باستخدام المواد الراكعة السطحي. ويمكن أن يسبب هذا الإجراء تغييرات غير محددة في تكوين المواد الماصة، مما يؤثر على استخراج التحليلات. في الدراسات الموصوفة هنا، تم استخدام فترة استخراج 30 دقيقة، ولكن تقارير أخرى التحقق من صحة أن أقصر الأوقات يمكن أن تسفر عن نتائج مرضية في دراسات الجسم الحي 13. وقد أظهر Huq et al. أن زمن توازن التحليلات يتحقق بشكل أسرع في الأنسجة، كمصفوفة معقدة، من المصفوفات البسيطة14. ومع ذلك، يمكن أن تتعرض إمكانية استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها للخطر في فترات استخراج أقصر حيث سيتم استخراج المزيد من التحليلات في ظل ظروف ما قبل التوازن؛ لذلك، يجب تطبيق التحكم في الوقت الدقيق.
كل من العلوم omics استغلالها كجزء من هذا العمل لديها إمكانات ممتازة كأدوات اكتشاف العلامات البيولوجية. وبمجرد اختيار المؤشرات الأحيائية أو إنشاء نموذج كيميائي، يمكن تطوير وتنفيذ تشخيصات طبية تستند إلى تحديد نواتج الأيض المستهدفة عن طريق طرق قابلة للتطبيق في التحقيقات في الموقع، مثل نهج SPME الموصوف في هذا العمل، كجزء من التشخيص الروتيني.
يصف البروتوكول المقترح في هذه المخطوطة كيفية إجراء تحليلات مستقلبية ودهية غير مستهدفة للأنسجة السرطانية باستخدام الطور الصلب للميكروس الصغير لفحص المؤشرات الحيوية المحتملة. وهي مصممة لتمكين استخراج المركبات التمثيلية، والتمايز بين الأورام، وتحديد المركبات التمييزية التي تميز سرطان معين، أي المؤشرات البيولوجية المحتملة. تمثل التحليلات غير المستهدفة مع SPME الموصوفة في هذه المقالة نقطة انطلاق في تطوير التشخيص السريع أثناء العملية ، حيث يمكن تحديد مجموعة مختارة من المركبات دون الحاجة إلى فحص جميع المركبات الموجودة في العينة. ولمصلحة النتائج التشخيصية السريعة، يمكن أن تقترن مسابير SPME المستخدمة في الاستخراج في الموقع مباشرة بالأجهزة التحليلية الموجودة في مرفق المستشفى. عمليات الاستخراج البسيطة التي يتم إجراؤها مع إعداد عينة الحد الأدنى متبوعاً بتحليل خلوي من الكروماتوغرافيا سيقلص بشكل كبير الوقت الإجمالي من ساعات إلى بضع دقائق، كما هو موضح بالفعل لمراقبة المخدرات15.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم الدراسة بمنحة هارمونيا 2015/18/M/ST4/00059 من المركز الوطني للعلوم. ويود المؤلفون أن يعترفون بميليبور سيغمما، وهي شركة تجارية من شركة ميرك كغا، دارمشتات، ألمانيا، لتوفيرها أجهزة SPME المستخدمة في هذا العمل. تعمل شركة ميرك في مجال علوم الحياة في الولايات المتحدة وكندا. أيضا، فإن المؤلفين يود أن أشكر ثيرمو فيشر العلمية للوصول إلى الطيف الكتلة المدارية Q-Exactive Focus.
مساهمات المؤلفين: JB: تحسين إعداد العينات والمعلمات LC-MS، أداء تجارب SPME-LC-MS، تحليل البيانات، التحليل الإحصائي وتفسير البيانات وإعداد المخطوطات المتعلقة بجزء من علم الدهون؛ PZG: تنسيق وأداء غالبية العينات في المستشفى، والاستفادة المثلى من المعلمات أخذ العينات وإعداد العينات، وأداء تجارب SPME-LC-MS، وتحليل البيانات، والتحليل الإحصائي وتفسير البيانات، وإعداد المخطوطات المتعلقة جزء المستقلبوميات؛ MG – المساعدة في تحسين إعداد العينة, LC-MS طريقة وتحليل البيانات المتعلقة جزء الدهون; KG: الأداء المشترك لأخذ العينات SPME وتعظيم الاستفادة المثلى من أخذ العينات وإعداد العينات، تحليل SPME-LC-MS المتعلقة جزء المستقلبوميكس؛ KC: أداء العديد من عينات SPME في المستشفى، والمساعدة في تحسين أخذ العينات، وإعداد العينات وتحليل البيانات المتعلقة بجزء المستقلبوميات؛ KJ: أداء العديد من أخذ العينات SPME في المستشفى, المساعدة في تحليل الدهون; DP: إجراء العمليات الجراحية، وتوظيف المرضى؛ JF: أداء العمليات الجراحية، وتوظيف المرضى؛ MH: أداء العمليات الجراحية، وتنسيق الجزء السريري من البحث؛ BB: مفهوم، تنسيق الإشراف على المشروع وإعداد المخطوطات، أداء عدة عينات
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
