Summary
원고는 고체 위상 미세 추출과 인간의 뇌 종양의 현장 샘플링을 제시하고 바이오 마커의 발견을 향해 자신의 생화학 프로파일링 에 이어.
Abstract
암 진단 및 분류에 사용할 수있는 다양한 도구에도 불구하고 종양의 빠르고 간단한 특성화를 가능하게하는 방법은 여전히 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 질량 분광법은 질병의 잠재적 인 바이오 마커로 차별 화합물의 표적 프로파일링을위한 선택의 방법이되고있다. 생체 유체는 일반적으로 접근성과 쉬운 샘플 처리를 고려하여 바람직한 매트릭스로 간주되며 직접 조직 프로파일링은 주어진 암에 대한 보다 선택적 정보를 제공합니다. 전통적인 방법을 통해 분석을 위한 조직의 준비는 훨씬 더 복잡하고 시간이 많이 소요되며, 따라서 빠른 현장 분석에적합하지 않습니다. 현재 작업은 종양 절제술 직후 현장에서 소분자의 샘플 준비 및 추출을 결합하는 프로토콜을 제시합니다. 침술 바늘의 크기인 샘플링 장치는 조직에 직접 삽입한 다음 기악 분석을 위해 인근 실험실로 이송될 수 있습니다. 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석의 결과는 종양, 악성, 유전돌연변이의 조직학적 기원과 관련된 종양의 표현형 의 확립뿐만 아니라 차별화합물 또는 잠재적 바이오마커의 선택을 위한 접근법의 능력을 보여준다. 이 기술의 비파괴적 특성은 SPME 분석에 사용되는 동일한 샘플에서 일상적으로 사용되는 테스트(예: 조직학적 테스트)의 후속 성능을 허용하므로 개인화된 진단을 지원하기 위해 보다 포괄적인 정보를 얻을 수 있습니다.
Introduction
자기 공명 화상 진찰 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)는 두뇌 병변의 실시간 분석에 사용되는 주요 방법입니다. 뇌종양 분화는 일반적으로 추가 염색 및 고급 면역 조직 화학 적 기술을 가진 조직 병리학에 기초한다. 2016년 세계보건기구(WHO)가 발표한 중추 신경뇌종양에 대한 업데이트된 지침에 따르면, 유전자 검사는 이러한 종양1의분화 및 분류에 매우 중요합니다. 종양의 분화 및 분류는 의사가 주어진 유형의 종양에 대한 가장 효과적인 치료를 선택하여 환자의 평균 수명을 확대 할 수 있게합니다. 불행하게도, 그들의 환자를 위한 최적 치료를 선택하는 의사를 돕기 위하여 그러한 진보된 방법의 가용성에도 불구하고, 교모세포종으로 진단된 환자의 평균 수명은 대략 15-16 달2입니다. 진단 도구로 상기 화상 진찰 및 조직학적 방법의 정교함과 증가된 정확도에도 불구하고, 처리 과정에 관하여 결정에 있는 의사를 돕기 위하여 보완적인 정보를 제공할 수 있는 새로운 기술에 대한 아직도 중대한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 질량 분석법을 기반으로 한 몇 가지 새로운 접근법이 암3,4의수술 내 분석을 위해 제안되었습니다. 본 원에 제시된 방법인 고체상 미세추출(SPME)의 잠재력은, 신속한 현장 분석 도구로서, 이미 다양한 연구에서입증되었다5. 현재 원고는 인간의 뇌종양의 방법, 표적되지 않은 메타볼로믹스 및 리피도믹스의 임상 응용 프로그램 중 하나를 보여줍니다. 표적조사가 잠재적바이오마커 발견의 중요한 출발점을 제시합니다. 일단 확립되면, 이러한 바이오마커는 현장 계측에 결합된 동일한 기술을 사용하여 종양 을 구별하기 위한 진단 참조로 사용될 수 있다.
SPME는 소량의 추출 단계를 사용하여 샘플 행렬에서 작은 분자를 추출하는 평형 기반 샘플 준비 기술입니다. SPME의 가장 전통적인 장치 구성(프로브)에서 섬유는 적절한 추출 단계로 코팅되어 고체 지지장치(예: 금속 와이어5,6)에고정된다. 생체 적합성 코팅 및 장치(프로브)는 시료 전처리 없이 복잡한 생물학적 행렬에서 직접 추출할 수 있도록 합니다(예: 균질화 및 여과). 추출 과정을 통해 분석체는 초기 농도에 비례하여 추출 단계와 샘플 매트릭스 사이에 분할됩니다. 추출이 충분히 오래 수행되면 평형이 달성됩니다. 평형에서 추출하면 가능한 가장 높은 감도와 재현성을 제공하지만, 사전 평형 추출은 또한 가능하고 심지어 바람직합니다, 즉, 생체 내 샘플링, 현장 샘플링과 관련된 시간 제한이 있는 곳 (예를 들어, 작동 또는 응급실) 빠른 추출이 필요합니다. 주어진 분석물의 추출 시간 프로파일은 일반적으로 분석물의 물리화학적 특성, 샘플링중인 매트릭스, 사용되는 포도골의 종류 및 기타 여러 추출 조건에 의해 영향을 받습니다. 그들의 추출 운동학을 지배하는 요인의 과다로는 메타볼로믹스 또는 리피도믹스와 같은 표적 분석이 수행될 때 모든 화합물의 평형 추출을 보장하는 것을 실질적으로 불가능하게 합니다. 상기 의결을 위해, 현재 프로토콜의 추출 시간은 한 손에 대사 산물의 만족스러운 감도 및 커버리지를 보장하기 위해 임의로 설정되었으며, 다른 한편으로는 현장 사용을 위한 실용성을 갖는다.
그것은 조직에서 샘플추출에 사용되는 프로브의 매우 작은 크기는 샘플링 절차 자체가 어떤 조직을 소비하지 않지만 샘플링 된 영역에서 작은 분자의 매우 작은 양을 소비하지 않는 동안 최소한의 조직 손상을 일으키는 것을 강조해야한다; 따라서 동일한 샘플은 일상적인 테스트, 즉 조직학적 또는 유전적 검사에 더 사용될 수 있어 동일한 샘플에서 필수 및 보완 정보의 달성을 가능하게 합니다. 이러한 보완적이고 포괄적인 데이터는 종양 생물학에 대한 더 나은 이해를 가능하게 할 것이며, 새로운 치료 표적의 발견을 용이하게 할 것입니다. 이 방법을 악용하면 대상 바이오마커를 결정할 때 현장 수술 내 진단의 가능성이 더욱 높아집니다.
아래에서 우리는 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석 및 데이터 처리를 위한 현장에서 뇌종양의 샘플링을 위한 프로토콜을 제출합니다.
Protocol
본명 소개된 연구 결과는 토루엔에 있는 니콜라우스 코페르니쿠스 대학에 Bydgoszcz에 있는 대학 메디엄의 생물윤리 위원회에 의해 승인되었습니다 (KB 628/2015). 항상 실험실 코트와 안전 장갑과 안경과 같은 기타 필수 개인 안전 장비를 착용해야 합니다. 고체 상 미세 추출(SPME) 프로브의 추출 단계를 만지지 마십시오.
1. SPME 장치 준비
- 메타볼로믹스및리피도믹스에 혼합 모드 및 C18 코팅이 있는 프로브(섬유)를 각각 사용하십시오. 두 세트의 샘플, 하나는 메타볼로믹스용, 리피도믹스용 샘플을 수집합니다.
- SPME 프로브를 트리밍하여 프로브의 코팅을 최적의 길이로 조정합니다. 현재 연구에서는, 선택된 코팅 길이는 7mm였다. 연구 중인 종양의 크기에 따라 섬유의 길이를 선택하여 전체 소벤트가 종양에 침지될 수 있도록한다(도 1).
- 메탄올에 담그어 프로브의 코팅을 조절: 추출 절차 전에 최소 1 시간 동안 물 50:50 v/v 혼합물. 컨디셔닝 용액을 포함하는 유리병에서 샘플링(예: 병원)의 현장으로 섬유를 운반합니다.
2. 샘플 수집 절차
- SPME 추출 전에 종양을 세척하거나 퇴각하지 마십시오.
- 종양 제거 후 가능한 한 빨리 샘플링을 시작합니다 (제시 된 연구에서 2 분).
참고: 지정된 시설(수술대에서 연구원의 작업 현장 거리)에 대한 현장 설정에 따라 시간을 조정하고 전체 연구에 대해 일정하게 유지합니다. 종양 제거와 추출 시작 사이의 경과 된 시간을 최소화하는 것은 혈액 순환 후 저하되는 불안정한 대사 산물을 캡처하는 데 중요합니다. - 실온에서 샘플링을 수행합니다. 또는 추출이 수행될 때 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 두 경우 모두 전체 샘플 집합에 대해 동일한 조건을 유지합니다.
- 유리병에서 프로브를 꺼내.
- LC/MS 급수에 침지하여 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC/MS) 등급의 물로 섬유를 5s로 세척합니다. 데이터의 좋은 재현성을 보장하기 위해 섬유 삽입 전에 소광건조를 하지 마십시오.
- 섬유를 가능한 한 멀리 떨어져 뇌종양 조직에 삽입하여 전체 추출 단계가 종양 내부에 위치하도록 합니다.
참고: 종양의 이질적 특성을 결정하기 위해 복제하여 추출을 수행하는 것이좋습니다(도 2). 샘플당 세 개의 복제를 권장합니다. - 조직에 30 분 동안 프로브를 둡니다 (타이머로 측정).
- 빈 컨트롤을 사용하여 샘플링된 종양 이외의 소스에서 유래한 유물의 존재와 관련된 오류 의 원인을 제거합니다. 빈 컨트롤을 얻으려면, 피험자 섬유는 전술한 바와 같이 동일한 분석 워크플로우로, 그러나 샘플링 단계없이 (조직 또는 다른 샘플 / 매트릭스에 삽입). 데이터 처리 단계에서, 이러한 섬유에서 추출한 분석물을 "제외 목록"으로 컴파일하여 용매 또는 섬유 제조에서 유래한 오염 물질에서 유래된 신호를 제외합니다. 적어도 3개의 빈 복제를 사용하는 것이 좋습니다.
참고: 오염 위험을 확인하려면 장갑, 테이블, 장치 또는 오염 위험을 초래할 수 있는 기타 표면에서 샘플링을 수행해야 합니다. 이러한 경우 섬유 제조, 추출 시간 및 탈착 프로토콜은 샘플의 경우와 동일합니다. - 추출이 수행되는 동안 추출 후 프로브를 보관하는 데 사용할 바이알에 라벨을 지정합니다.
- 30 분 후 뇌종양에서 섬유질을 제거하십시오.
- 최종 추출물은 작은 분자만 을 포함되도록 프로브에서 혈액 이나 세포 파편의 잔류물을 제거하기 위해 LC / MS 등급의 물에 침지하여 3 s에 대한 물로 섬유를 세척합니다. 더 긴 세척 단계는 극성 화합물의 손실로 이어질 수 있으므로 권장되지 않습니다.
- 섬유의 비코팅 단부로 바닥에서 셉타를 관통하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 바이알 캡의 프리 슬릿 패막에서 섬유를 고정한다.
- 뚜껑에 고정된 섬유를 별도의 HPLC 바이알에 넣고 선택한 운송 컨테이너에 넣습니다.
- 빈 컨트롤 전용 섬유에 대해 2.11-2.13 단계를 수행합니다.
3. 운송 및 저장
참고: 샘플을 실험실로 운반하기 위한 몇 가지 옵션을 사용할 수 있습니다. 드라이 아이스로 채워진 액체 질소 드와르 또는 폴리스티렌 상자가 운송에 사용되는 것이 좋습니다. 또는 얼음 팩을 즉각적이고 빠른 운송에 사용할 수 있습니다.
- 운송 컨테이너에 섬유가 있는 바이알을 놓습니다.
- 실험실 도착 시 즉시 SPME 섬유를 -80°C 또는 -30°C 냉동고에 넣습니다. -30°C에서 3년 이상 또는 -80°C에서 5년 이상 섬유를 보관하지 마십시오.
4. 메타볼로믹스 분석을 위한 샘플 준비
참고: 이 단계는 실험에 대한 모든 샘플을 수집한 후에만 수행해야 합니다.
- 기악 분석 전에 탈착 용매 혼합물을 준비하십시오: 아세토닐릴:물 80:20 v/v.
- 냉동고에서 혼합 모드 섬유가 들어 있는 바이알을 꺼내십시오. 메타볼로믹스 분석에 사용합니다.
- 탈취에 사용할 라벨 바이알.
- 2mL 바이알에 배치된 유리 인서트에 탈착 용액(4.1단계에서 준비)의 파이펫 300 μL.
- 탈광 용매에 코팅을 완전히 침전한 다음 소용돌이를 사용하여 1,200 rpm에서 120 분 동안 교반하여 별도의 인서트에 배치 된 각 섬유에서 탈광을 수행합니다.
- 120분 후(탈착이 완료되면) 프로브가 있는 캡을 제거합니다.
- 샘플 세트에서 각 샘플의 10 μL 알리쿼트를 혼합하여 QC 샘플을 준비합니다. 샘플 세트 크기는 실험 설계에 따라 다릅니다. 모든 샘플을 하나의 일괄 처리로 분석하는 것이 중요합니다.
- 새 캡으로 바이알을 닫습니다.
- 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분광계(LC-HRMS)의 자동 샘플러(4°C)에 바이알을 놓고 5단계로 이동한다.
참고: 제어 공백을 포함한 샘플의 주사 순서를 무작위화합니다. 모든 8-10 샘플 후에 QC 샘플을 주입하여 계측기의 안정성을 모니터링합니다.
5. 역상 액체 크로마토그래피 및 고해상도 질량 분광계를 이용한 메타볼로믹스 분석(RPLC-HRMS 분석)
- LC-HRMS 분석 및 양수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 양수 모드에서 현재 스터디에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 80-1000; 해상도 70 000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압 : 1.5 kV; S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: 25 V; 스키머 전압: 15 V; 모세 혈관 온도 : 300 ° C; 칼집 가스: 40 a.u.; 보조 가스: 15a.u.; 보조 가스 히터 온도 : 300 ° C. 이 크로마토그래피 방법은 부코비치 외7로부터적응하였다. 사출 부피: 10 μL. - LC-HRMS 분석 및 음수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 음수 모드에서 현재 스터디에 사용되는 매개 변수: 스캔 범위: m/z 80-1000; 해상도 70 000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압 : 2.5 kV; S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: -25 V; 스키머 전압: -15 V; 모세관 온도 : 256 ° C 칼집 가스 : 48 a.u; 보조 가스: 11au.u.; 보조 가스 히터 온도 : 413 ° C. 이 크로마토그래피 방법은 부코비치 외7로부터채택되었다. 사출 부피: 10 μL. - 제조업체에서 권장하는 대로 계측기를 보정합니다.
참고: 현재 연구에서는 48시간마다 외부 교정을 사용하여 계측기를 보정하여 질량 정확도 및 2 ppm을 생성했습니다. - 계측기를 작동하는 소프트웨어의 시작 단추를 클릭하여 분석을 시작합니다.
- 분석이 완료되면 RPLC 열을 HILIC 열로 바꾸고 모바일 단계를 변경하고 6단계로 이동합니다.
6. 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피 및 고해상도 질량 분광계를 이용한 메타볼로믹스 분석(HILIC-HRMS 분석)
- LC-HRMS 분석 및 양수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 양수 모드에서 현재 스터디에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 80-1000; 해상도 70 000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압 : 1.5 kV; S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: 25 V; 스키머 전압: 15 V; 칼집 가스: 60 a.u.; 보조 가스: 40 a.u.; 보조 가스 히터 온도 : 425 ° C; 모세관 온도 : 325 ° C. 크로마토그래피 방법은 부코비치 외7로부터적응하였다. 사출 부피: 10 μL. - LC-HRMS 분석 및 음수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 음수 모드에서 현재 스터디에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 80-1000; 해상도 70 000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압 : 1.3 kV; S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: -25 V; 스키머 전압: -15 V; 모세관 온도 : 263 °C; 칼집 가스: 60 a.u.; 보조 가스: 30 a.u.; 보조 가스 히터 온도 : 425 ° C. 크로마토그래피 방법은 부코비치 외7로부터적응하였다. 사출 부피: 10 μL. - 제조업체에서 권장하는 대로 계측기를 보정합니다.
참고: 현재 연구에서는 48시간마다 외부 교정을 사용하여 계측기를 보정하여 질량 정확도 및 2 ppm을 생성했습니다. - 계측기를 작동하는 소프트웨어의 시작 단추를 클릭하여 분석을 시작합니다.
7. 리피도믹스 분석을 위한 샘플 준비
참고: 이 단계는 실험에 대한 모든 샘플이 수집된 후에만 수행해야 합니다.
- 분석을 시작하기 전에 탈착 용매 혼합물을 준비하십시오: isopropanol:메탄올 50:50 v/v.
- 냉동고에서 리피도믹스 분석을 위한 C18 섬유를 함유한 바이알을 꺼내십시오.
- 탈취에 사용할 라벨 바이알.
- 2mL 바이알에 배치된 실란화 유리 인서트에 탈착 용액(단계 7.1에서 제조)의 파이펫 200 μL.
참고: 비사란화 된 인서트도 사용할 수 있지만, 이러한 화합물은 유리 벽에 비구체적으로 부착 할 수 있기 때문에, 높은 로그를 가진 화합물의 독성이 좋지 발생할 수 있습니다. - 탈광 용매에 코팅을 완전히 침전한 다음 소용돌이를 사용하여 1,200 rpm에서 60 분 동안 교반하여 별도의 인서트에서 각 섬유에서 탈광을 수행합니다.
- 탈취가 완료되면 60분 후에 프로브가 있는 캡을 제거합니다.
- 샘플 세트에서 각 샘플의 10 μL 알리쿼트를 혼합하여 QC 샘플을 준비합니다. 샘플 세트 크기는 실험 설계에 따라 다릅니다. 모든 샘플을 하나의 일괄 처리로 분석하는 것이 중요합니다.
- 새 캡으로 바이알을 닫습니다.
- 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분광계(LC-HRMS)의 자동 샘플러(4°C)에 바이알을 놓고 8단계로 이동한다.
8. 반전 된 위상 액체 크로마토그래피 및 고해상도 질량 분석법 (RPLC-HRMS 분석)을 사용하여 리피도믹스 분석
- LC-HRMS 분석 및 양수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 양수 이온 모드에서 현재 연구에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 100-1000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압: 3.5 kV, S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: 25 V; 스키머 전압: 15 V; 모세 혈관 온도 275 °C; 칼집 가스: 30 a.u.; 보조 가스: 오전 10시; 예비 가스: 2 a.u.; 프로브 히터 온도 300 °C. 사용되는 LC 파라미터는 : 단계 A : 메탄올 : 물, 40:60 와 10 mM 암모늄 아세테이트 와 1 mM 아세트산; 단계 B: 이소프로판올:메탄올, 90:10 와 10mM 암모늄 아세테이트 및 1 mM 아세트산.; 그라데이션: 0분 – 20% B; 1.0 분 – 20% B; 1.5 분 – 50% B; 7.5 분 – 70% B; 13.0 분 – 95% B; 17.0 분 – 95% B; 17.1 분 – 95.5 % B; 23.0 분 – 중지; C18 컬럼, 3.5 μm, 2.1 mm x 75mm; 흐름: 0.2 mL/분; 오븐 온도 : 55 °C; 사출 부피: 10 μL. - LC-HRMS 분석 및 음수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 현재 연구에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 음이온 모드에 대한 HRMS 매개변수: 스캔 범위: m/z 100-1000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; C-트랩에 시간을 주입 : 자동; 스프레이 전압: 3.5 kV, S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: -25 V; 스키머 전압: -15 V; 모세 혈관 온도 275 °C; 칼집 가스: 30 a.u; 보조 가스: 오전 10시; 예비 가스: 2 a.u; 프로브 히터 온도 300 °C. 크로마토그래피 방법: 8.1과 동일합니다. - 제조업체에서 권장하는 대로 계측기를 보정합니다.
참고: 현재 연구에서는 48시간마다 외부 교정을 사용하여 계측기를 보정하여 질량 정확도 및 2 ppm을 생성했습니다. - 계측기를 작동하는 소프트웨어의 시작 단추를 클릭하여 분석을 시작합니다.
- 분석이 완료되면 RPLC 열을 HILIC 열로 바꾸고 모바일 단계를 변경하고 9단계로 이동합니다.
9. 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피 및 고해상도 질량 분광계를 이용한 리피도믹스 분석(HILIC-HRMS 분석)
- LC-HRMS 분석 및 양수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 양수 이온 모드에서 현재 연구에 사용된 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 100-1000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; 스프레이 전압 : 1.5 kV; S 렌즈 RF 레벨: 55%; S 렌즈 전압: 25 V; 스키머 전압: 15 V; 모세 혈관 온도 325 °C; 칼집 가스: 60 a.u.; 보조 가스: 30 a.u.; 예비 가스: 2 a.u.; 프로브 히터 온도 320 °C. LC 매개 변수는 다음과 같은 단계 A : 5 mM 암모늄 아세테이트 물; 단계 B: 아세토닐트릴; 그라데이션: 0 – 2분 – 4% B; 15.0 – 20% B; 15.1 – 4% B, 21.0 분 – 중지; 3 μm 100mm x 2.1 mm 기둥; 흐름: 0.4 mL/분; 오븐 온도 : 40 °C; 사출 부피: 10 μL. - LC-HRMS 분석 및 음수 이온화 모드의 매개 변수를 설정합니다.
참고: 음이온 모드에서 현재 연구에서 사용되는 매개 변수는 다음과 같습니다: 스캔 범위: m/z 80-1000; AGC(1,000,000 이온)를 사용하여 수행된 인수; 스프레이 전압 : 1.5 kV, S 렌즈 RF 수준 : 55 %; S 렌즈 전압: -25 V; 스키머 전압: -15 V; 모세 혈관 온도 320 °C; 칼집 가스: 50 a.u.; 보조 가스: 21 a.u.; 예비 가스: 3 a.u.; 프로브 히터 온도 320 °C. 크로마토그래피 방법은 9.1에 기재된 것과 동일하였다. - 제조업체에서 권장하는 대로 계측기를 보정합니다.
참고: 현재 연구에서는 48시간마다 외부 교정을 사용하여 계측기를 보정하여 질량 정확도 및 2 ppm을 생성했습니다. - 계측기를 작동하는 소프트웨어의 시작 단추를 클릭하여 분석을 시작합니다.
10. 데이터 처리 및 통계 분석
- 원시 데이터 파일의 형식과 호환되는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다.
- 처리된 데이터를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
참고: 시험의 모형은 연구 결과의 과학적 가설 및 디자인에 달려 있습니다. 현재 연구에서는 주요 구성 요소 분석, 부분 최소 제곱 차별 분석 및 단방향 ANOVA가 사용되었습니다.
Representative Results
고해상도 질량 분석및 고급 데이터 처리 소프트웨어와 결합된 액체 크로마토그래피와 결합된 샘플 제제 방법으로 고체 위상 미세 추출을 활용하여 인간 뇌종양의 메타볼로메와 리피돔을 성공적으로 특성화할 수 있었습니다. 침술 바늘과 동등한 크기의 프로브는 연구된 조직에 최소한의 손상을 일으켰으며 조직 소비가 없었기 때문에 조직학적 또는 유전 연구를 위한 시료를 추가로 사용할 수 있게 되었습니다. 선택한 그룹의 만족스러운 분리는 반전된 위상 및 HILIC 컬럼 과 메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석에서 이온화 모드를 모두 획득하였다. 두 분리 방법의 사용은 메타볼로믹스뿐만 아니라 리피도믹스 분석에서도 귀중한 보완 데이터를 제공했습니다. 반전 된 상열은 그들의 탄소 사슬 길이 및 불포화 결합의 존재에 대하여 지질을 분리, HILIC 열은 지질 그룹, 특히 인지질8프로파일링에 유용합니다 반면.
기악 분석의 재현성은 주 성분 분석 플롯에 대한 QC 샘플의 단단한 클러스터링에 기초하여 매우 양호한 것으로나타났다(도 3A,3개의 QC 샘플은 시퀀스 중첩을 따라 8명의 환자 샘플마다 주입). 더욱이, 음의 제어 분석에 사용되는 추출 블랭크는 실제 샘플과 잘 분리되는 것으로 나타났다. 프로브에 의해 추출된 광범위한 마취제는 대표적인 종의 발견을 용이하게 하여 조직학적 기원, 악성 종양 및 기타 요인(예를 들어, 유전)에 기초하여 인간 뇌종양 간의 분화를 성공적으로 허용했습니다. 도 3B는 교혈증 및 수막종 환자로부터 수집된 샘플에 대한 리피도믹스 데이터를 나타낸다. 다른 조직학적 기원과 악성 종양을 특징으로 하는 이 종양 간의 분화를 가능하게 하는 것은 수막종이 일반적으로 양성 종양으로 간주되기 때문에, 신경교종은 가장 악성 중 하나이기 때문에 연구 결과의 중요한 목표였습니다. 또한, 도 4에서 메타볼로믹스 데이터를 제시하면서, 글리오마는 악성종양의 정도를 높고 낮게 나누어 주었다. 이 하위 단은 수막종의 분자 표현형과 비교되었습니다. 두 경우 모두 클러스터의 눈에 띄는 분리가 관찰되었습니다. 요즘, 신경 교종의 진단은 주로 종양 견본에 있는 특정 유전 돌연변이를 결정에 의지합니다. 따라서, 얻어진 결과는 유전화 데이터와 비교하였다. 도 5A는 돌연변이가 관찰되지 않은 검출된 배분 1p19q 및 샘플로 시료의 분리를 제시한다.
통계 분석은 또한 연구된 단에 있는 화합물의 선택을 허용합니다. 이 화합물은 적당히 큰 코호트가 샘플링되는 경우에 잠재적인 biomarkers로 간주될 수 있습니다. 그러나, 분석 기준을 가진 검출된 종의 단편화 및 비교에 의하여 검출된 화합물의 결정적인 확인을 포함하여 보다 심층적인 분석이 요구되고, 생물학적 성질의 확실한 결론을 도출하기 위하여 요구된다. 이러한 차별대사산물의 예는 도 3C 및 도 5B로제시된다. 이러한 화합물의 정체성, 즉 스핑고미에린: SM d36:1 및 프롤라인은 샘플 및 정통 표준으로부터 대사산물의 단편화 패턴을 비교하여 확인되었다.
그림 1: 추출 공정을 위해 준비된 SPME 섬유. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SPME 프로브를 사용하여 수막종 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신경종 및 수막종에 대한 PCA 및 상자 플롯. 주요 성분 분석 플롯 포함(A)공백을 포함 하는 모든 분석 된 샘플, 추출 QC, 공백, 수막 종, 교종; (B)연구된 그룹만 포함 (공백 및 QC제외 후); (C)sphingomielyn에 대한 상자 수염 플롯 : SM d36:1 신경종 및 수막종환자를 분화. 리피도믹스 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HGG, LGG 및 수막종용 PCA. (A)고급 교향종(HGG) 및 수막종(MEN)9 및(B)저급 교향모(LGG) 및 수막종 사이의 분화를 나타내는 주요 성분 분석 플롯. 비아 메디카 심판9에서 무단 전재된 메타볼로믹스 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 삭제 유무에 관계없이 신경교종에 대한 PCA 및 상자 플롯. (A)주요 성분 분석 플롯은 1p19q의 연동 및 유무에 관계없이 환자의 차이를 보였다. (B)1p19q의 배분 및 유무에 관계없이 프라인 분화 환자를 위한 박스 수염 플롯; n-삭제 없이, 삭제와 y-와. Metabolomics 데이터이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
표적화된 메타볼로믹스와 리피도혈은 종양 바이오마커를 식별하는 데 초점을 맞춘 연구에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 대부분의 경우에, 연구원은 질병의 검열을 위해 이용될 수 있는 화합물을 찾아합니다. 따라서, 바람직한 생물학적 샘플은 상대적으로 쉽게 접근하기 때문에 혈액 또는 소변이다. 종양 조직의 분석은 주로 질병의 뒤에 있는 기계장치를 이해하기 위하여 수행되고, 다른 종양 모형 을 특성화합니다, 등등. 종양 바이오마커의 현장 분석은 거의 수행되지 않으며, 이러한 응용 분야는 광범위한 샘플 준비를 필요로 하기 때문에. 대안적으로, 특정 바이오마커의 사전 선택 없이 조직 프로파일의 실시간 분석을 기반으로 한 전략은 의료계3,4의관심을 얻고 있다. 본 명세서에 제시된 용액은 이러한 방법을 통해 얻을 수 있는 정보의 유형을 공개함으로써 현장에서 조직 처리에 대한 또 다른 관점을 제공한다.
샘플링, 샘플 준비 및 추출의 조합은 SPME를 현장 분석에 매우 유용한 도구로 렌더링합니다. 더욱이, 샘플링 하는 동안 조직 소비의 부족 바이오 마커 분석 및 일상적인 테스트 (genotyping, 조직 분석)에 대 한 동일한 샘플을 추가 사용 수 있습니다., 따라서 표준 테스트의 결과에 새로운 정보를 추가. 샘플링 장치는 매우 간단한 설계를 가지고 있으며, 그 조작은 매우 쉽고 추출 자체를 수행하기 위해 특별한 훈련이 필요하지 않습니다. 그러나 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 장치를 적절히 처리하는 것 이상이 필요합니다. 실험을 제대로 수행하려면 추출 프로세스, 샘플의 특성을 이해하고 데이터에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 실수를 인식해야 합니다.
암 조직의 이질성을 고려하는 것이중요하다(10) 샘플링된 종양은 괴사, 석회화 및 저산소증을 겪고 있는 부품을 포함할 수 있으며, 이들 각각의 공정은 달성된 메타볼로메및 립피돔에 반영되어 결과에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 공간 분해능 샘플링은 암 조직의 상이한 부분에 여러 섬유를 삽입하여 수행되거나, 또는 대안적으로, 종양에 대한 평균 정보를 얻기 위해 종양 전체를 관통하기 위해 더 긴 코팅을 사용하는 것이 좋습니다. 공간 분해능 샘플링 방법이 수행되는 경우, 섬유는 모두 하나의 탈착 용매로 탈광될 수 있다; 이것은 종양에 대한 전반적인 정보의 달성을 허용할뿐만 아니라 분석의 감도를 증가시킬 것입니다. 대안적으로, 개별 섬유를 별도의 바이알로 탈착하면 암 세포로 지어진 코어와 건강한 조직의 경계인 외부 영역으로 구성된 뇌종양의 내부 다양성을 파악할 수 있습니다. 종양의 깊은 부분은 일반적으로 암(11)과관련된 과정에 의해 더 손상된다. 그러나, 조사관은이 옵션은 메서드 감도 및 검출 가능한 화합물의 전반적인 수를 손상 하는 명심 해야 합니다. 현재 작업에서, 7mm 코팅이 사용되었다; 이 길이는 연구에 포함된 다양한 종양 크기에 최적으로 간주되었다. 코팅은 종양에 침투하여 비특수 해상도를 제공했지만 샘플 전반에 걸쳐 평균 데이터를 제공했습니다. 선택된 프로토콜에 관계없이 개별 샘플링에 사용되는 섬유 수, 코팅 의 길이, 추출 시간 및 이 작업에서 묘사된 기타 모든 요소를 포함하여 전체 연구 중에 동일한 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다.
분석 품질을 제어하는 것이 중요합니다. 풀이 풀린 QC(프로토콜의 단계 4.7 및 7.7 참조)를 준비하고 전체 샘플 배치를 실행하는 동안 계측기 안정성을 모니터링하는 데 사용해야 합니다. 빈 컨트롤(단계 2.8 참조)은 나중에 용매 또는 섬유 제조에서 발생하는 오염물질의 신호를 제거하기 위해 "제외 목록"을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 오염 의 위험과 같은 특별한 경우, 오염 위험을 초래할 수있는 장갑, 테이블, 장치 또는 기타 표면에서 샘플링을 수행해야합니다. 이러한 경우 섬유 제조, 추출 시간 및 탈착 프로토콜은 샘플과 동일합니다.
메타볼로믹 및 리피도믹 분석은 유기체또는 특정 장기, 조직, 유체, 세포 등과 같은 유기체 또는 특정 구성 요소에 나타나는 소분자(1,500D 미만)에 전적으로 초점을 맞추고 있습니다. 혈올로믹과 리피도믹스는 신체에서 발생하는 생화학적 변화의 스냅샷을 제공하며, 암의 경우 종양의 게놈, 히스토리학 및 악성과 관련된 정보를 통합합니다. 이러한 omics 과학은 대사 산물이 단백질 또는유전자(12)보다생화학적 사다리에서 더 높기 때문에 생리학과 표현형 사이의 연결을 생성한다. 암 종양의 metabolome 및 lipidome를 이해함으로써, 우리는 연구의 이 분기가 다양한 자극에 살아있는 유기체의 반응으로 분자의 동적 변화에 대한 더 심층적인 지식을 제공하기 때문에 모든 omics 과학 중 표현형을 발견하는 데 더 가까워졌습니다. 이 작품에서 제시된 바와 같이, 한 샘플링에서 얻은 데이터는 암의 히스토로지, 악성종양의 정도에 해당하며, 게놈 수준에서 발생하는 변화를 반영한다. gliomas에서, 이 연구 결과에 있는 관심의 암의 모형으로, 게놈에 숨겨진 정보는 유전 시험의 결과에 근거를 둔 개인화한 처리가 발전하기 때문에, 특히 중요합니다. 특정 돌연변이는 화학 요법 또는 방사선 요법의 결과의 예후 마커입니다. 여기서 입증된 바와 같이, 제안된 전략으로 주어진 돌연변이를 반영하는 바이오마커의 선택이 가능하다. 돌연변이 마커뿐만 아니라 종양의 악성 정도를 나타내는 것과 같은 추가 설명자 유형은 일상적인 진단 방법을 지원하는 데 사용될 수 있다.
고체 상 미세 추출 섬유를 이용한 Ex vivo 화학생검은 수술 내 진단 에 대한 방법의 적용에 있어서 첫 번째 단계이다. 이 방법은 적절한 윤리 위원회의 허가를 보류 중인 생체 내 샘플링에 대해 쉽게 채택할 수 있습니다. 이러한 경우, SPME 장치의 살균은 샘플링이 수행되어야 하는 병원의 허용된 살균 절차에 따라 수행되어야 하며, 즉 오토클레이브 또는 에틸렌 산화물 살균이 수행되어야 한다. 사전 조절 및 살균된 섬유는 멸균 만료 날짜로 표시된 밀봉된 패키지에 보관해야 합니다. 계면 활성제를 사용하여 섬유를 세척해서는 안 됩니다. 이러한 절차는 소벤트 조성에 특이하지 않은 변화를 일으킬 수 있으므로 분석물의 추출에 영향을 줄 수 있습니다. 본 명세서에서 설명한 연구에서는 30분 추출 기간이 사용되었지만, 다른 보고서는 생체 내 연구에서 만족스러운 결과를 얻을 수 있는 짧은 시간이13일 에서 만족스러운 결과를 얻을 수 있음을 검증한다. Huq et al.은 분석평형 시간이 단순한행렬(14)보다복잡한 매트릭스로서 조직에서 더 빨리 달성되는 것으로 나타났다. 그러나, 얻어진 결과의 재현성은 더 많은 분석체가 사전 평형 조건 하에서 추출될 것이기 때문에 더 짧은 추출 기간 하에서 손상될 수 있다; 따라서 정확한 시간 제어를 구현해야 합니다.
이 작업의 일환으로 악용된 두 omics 과학은 바이오마커 발견 도구로서 우수한 잠재력을 가지고 있습니다. 바이오마커를 선택하거나 화학모델이 확립되면, 이 작업에 기재된 SPME 접근법과 같은 현장 조사에 적용할 수 있는 방법을 통해 표적 대사산물의 결정에 기초한 의료진단은 일상적인 진단의 일환으로 개발 및 구현될 수 있다.
본 원고에서 제안된 프로토콜은 잠재적인 바이오마커의 검열을 위한 고체 상 미세추출을 사용하여 암 조직의 표적화된 메타볼로믹 및 리피도믹 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 대표적인 화합물의 추출, 종양의 분화, 주어진 암, 잠재적 바이오마커를 특징으로 하는 차별 화합물의 식별을 가능하게 하도록 설계되었습니다. 본 문서에 설명된 SPME를 통한 표적 분석은 샘플에 존재하는 모든 화합물의 스크리닝을 위한 필요 없이 선택된 화합물 패널을 결정할 수 있는 빠른 수술 내 진단 개발의 출발점을 나타낸다. 빠른 진단 결과를 위해 현장 추출에 사용되는 SPME 프로브는 병원 시설에 위치한 분석 기기와 직접 결합될 수 있습니다. 크롬토그래피없는 분석 뒤에 최소 샘플 준비로 수행 된 간단한 추출은 약물 모니터링15에대해 이미 설명된 바와 같이 시간에서 몇 분으로 전체 시간을 크게 단축할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 과학 센터에서 2015/18/M/ST4/00059교교하모니아에 의해 지원되었습니다. 저자는 이 작품에 사용되는 SPME 장치를 제공한 독일 의 머크 KGaA, 다름슈타트의 사업인 밀리포레시그마(MilliporeSigma)를 인정하고자 합니다. 머크의 생명 과학 사업은 미국과 캐나다의 밀리포레시그마로 운영되고 있습니다. 또한, 저자는 Q-Exactive 포커스 궤도 랩 질량 분광계에 대한 액세스 에 대한 Thermo 피셔 과학감사하고 싶습니다.
저자의 기여: JB: 샘플 준비 및 LC-MS 매개 변수의 최적화, SPME-LC-MS 실험의 성능, 데이터 분석, 통계 분석 및 데이터 해석 및 리피도믹스 부품과 관련된 원고 준비; PZG: 병원에서 대부분의 샘플링의 조정 및 성능, 샘플링 및 샘플 준비 매개 변수의 최적화, SPME-LC-MS 실험의 성능, 데이터 분석, 통계 분석 및 데이터 해석, 메타볼로믹스 부품과 관련된 원고 준비; MG – 시료 제제의 최적화 지원, LC-MS 방법 및 리피도믹스 부품과 관련된 데이터 분석; KG: 샘플링 및 샘플 제제의 SPME 샘플링 의 공동 성능, 메타볼로믹스 부품과 관련된 SPME-LC-MS 분석; KC: 병원에서 여러 SPME 샘플링의 성능, 샘플링의 최적화 지원, 샘플 준비 및 메타볼로믹스 부품과 관련된 데이터 분석; KJ: 병원에서 여러 SPME 샘플링의 성능, 리피도믹스 분석에 대한 지원; DP: 외과 적 절차의 성능, 환자의 모집; JF: 외과 적 절차의 성능, 환자의 모집; MH: 외과 적 절차의 성능, 연구의 임상 부분의 조정; BB: 개념, 프로젝트의 조정 감독 및 원고 준비, 여러 샘플링의 성능
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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