Summary
Manuskriptet presenterar på plats provtagning av mänskliga hjärntumörer med fast fas mikroextraktion följt av deras biokemiska profilering mot upptäckten av biomarkörer.
Abstract
Trots de olika verktyg som finns tillgängliga för cancerdiagnos och klassificering, metoder som möjliggör snabb och enkel karakterisering av tumörer är fortfarande i behov. Under de senaste åren har masspektrometri blivit en metod för val för oriktad profilering av diskriminerande förening som potentiella biomarkörer för en sjukdom. Biofluider anses i allmänhet som att föredra matriser med tanke på deras tillgänglighet och enklare provbearbetning medan direkt vävnadsprofilering ger mer selektiv information om en viss cancer. Beredning av vävnader för analysen via traditionella metoder är mycket mer komplex och tidskrävande, och därför inte lämplig för snabb analys på plats. Det nuvarande arbetet presenterar ett protokoll som kombinerar prov beredning och extraktion av små molekyler på plats, omedelbart efter tumör samband. Provtagningsanordningen, som är av storleken på en akupunkturnål, kan sättas in direkt i vävnaden och sedan transporteras till det närliggande laboratoriet för instrumental analys. Resultaten av metabolomik och lipidomics analyser visar förmåga av tillvägagångssättet för inrättandet av fenotyper av tumörer relaterade till histologiska ursprunget av tumör, malignitet och genetiska mutationer, samt för urval av diskriminerande föreningar eller potentiella biomarkörer. Teknikens icke-förstörande karaktär tillåter efterföljande prestanda hos rutinmässigt använda tester t.ex.
Introduction
Magnetic Resonance Imaging (MRI) och datortomografi (CT) är de huvudsakliga metoder som används för den verkliga tidsanalysen av hjärnlesioner. Hjärntumör differentiering är i allmänhet baserat på histopatologi med ytterligare färgning och avancerade immunohistochemical tekniker. Enligt den uppdaterade vägledningen om centrala nervösa hjärntumörer som utfärdats av Världshälsoorganisationen (WHO) i 2016, genetiska tester är avgörande för differentiering och klassificering av dessa tumörer1. Differentiering och klassificering av tumörer tillåter läkare att välja den mest effektiva behandlingen för en given typ av tumör därigenom utöka den förväntade livslängden för patienten. Tyvärr, trots tillgången på sådana avancerade metoder för att hjälpa läkare att välja en optimal behandling för sina patienter, den förväntade livslängden för patienter som diagnostiserats med glioblastom (IV grad gliom) är bara ca 15-16 månader2. Även med förfining och ökad noggrannhet av nämnda bildbehandling och histologiska metoder som diagnostiska verktyg, finns det fortfarande ett stort behov av nya tekniker som kan erbjuda kompletterande information för att hjälpa läkare i beslut om behandlingskurs. Under de senaste åren har flera nya tillvägagångssätt baserade på masspektrometri föreslagits för intraoperativ analys av cancer3,4. Potentialen för solid fas mikroextraktion (SPME), den metod som presenteras häri, som en snabb på plats analysverktyg, har redan visats i en mängd olika studier5. Det nuvarande manuskriptet visar en av de kliniska tillämpningar av metoden, oriktade metabolomik och lipidomics av mänskliga hjärntumörer. Oriktade utredningar presenterar en viktig utgångspunkt vid upptäckten av potentiella biomarkörer. När sådana biomarkörer har etablerats kan de sedan användas som diagnostiska referenser för att skilja mellan tumörer med samma teknik som är kopplade till instrumentering på plats.
SPME är en jämviktsbaserad provberedningsteknik som extraherar små molekyler från provmatriser med användning av små mängder extraktionsfas. I SPME: s mest traditionella konfiguration av enheten (sond), är en fiber belagd med en lämplig extraktionsfas och immobiliseras på ett fast stöd dvs, en metalltråd5,6. Biokompatibla beläggningar och anordningar (sonder) möjliggör extraktion direkt från komplexa biologiska matriser utan provförbehandling t.ex. Genom extraktionsprocessen är analyter partitionerade mellan extraktionsfasen och provmatrisen i proportion till deras ursprungliga koncentrationer. Om extraktion utförs tillräckligt länge, då jämvikt uppnås. Medan utvinning vid jämvikt ger högsta möjliga känslighet och reproducerbarhet, är utvinning i förväg också möjlig och till och med att föredra i vissa fall dvs. Extraktionstidsprofilen för en given analyt påverkas i allmänhet av de fysikaliska kemiska egenskaperna hos analyten, den matris som provbeskar, vilken typ av sorbent som används, och flera andra extraktionsförhållanden. Den uppsjö av faktorer som styr deras utvinning kinetik gör det praktiskt omöjligt att säkerställa jämviktsutsug av alla föreningar när oriktade analyser såsom metabolomik eller lipidomics utförs. Av ovan nämnda skäl fastställdes utvinningstiden för det nuvarande protokollet godtyckligt för att garantera tillfredsställande känslighet och täckning av metaboliter å ena sidan, och praktiskhet för användning på plats å andra sidan.
Det bör betonas att den mycket lilla storleken på sonder som används för extraktion av prov från vävnader endast orsakar minsta vävnadsskada medan själva provtagningsförfarandet inte förbrukar någon vävnad men mycket små mängder av små molekyler från det provsmakade området; därför kan samma prov användas ytterligare för rutintester dvs, histologiska eller genetiska, vilket möjliggör uppnåendet av väsentlig och kompletterande information från samma prov. Sådana kompletterande, omfattande data skulle möjliggöra en bättre förståelse av tumörbiologi, förhoppningsvis underlätta upptäckten av nya behandlingsmål. Om du utnyttjar denna metod ökar ytterligare möjligheten till intraoperativ diagnostik på plats när målbiomarkörer fastställs.
Nedan presenterar vi protokoll för provtagning av hjärntumörer på plats för metabolomik och lipidomics analyser och databehandling.
Protocol
Studien som presenteras häri godkändes av Bioethics Committee of Collegium Medicum i Bydgoszcz vid Nicolaus Copernicus-universitetet i Toruń (KB 628/2015). Kom ihåg att alltid bära en labbrock och alla andra erforderliga personlig säkerhetsutrustning, såsom (men inte begränsat till) säkerhetshandskar och glasögon. Rör inte extraktionsfasen av de solida fasmikroextraktionsproberna (SPME).
1. Beredning av SPME-apparaterna
- Använd prober (fibrer) med mixed-mode och C18 beläggningar för metabolomik respektive lipidomics. Samla in två uppsättningar prover, en för metabolomik och en för lipidomics.
- Justera beläggningen av sonden till en optimal längd genom att trimma SPME-sonden. I den aktuella studien var den valda beläggningslängden 7 mm. Välj längden på fibern enligt storleken på tumören under studie, se till att hela sorbenten kan sänkas ned i tumören (Figur 1).
- Villkora sondernas beläggningar genom blötläggning av dem i metanol: vatten 50:50 v/v blandning under en minsta period av 1 h före extraktionsförfarandet. Transportera fibrer till provtagningsstället (t.ex. sjukhus) i en injektionsflaska som innehåller konditioneringslösningen.
2. Förfarandet för provinsamling
- Tvätta eller förförtäta inte tumören på något sätt före SPME-utsug.
- Starta provtagningen så snart som möjligt efter tumörborttagningen (2 min i den presenterade studien).
OBS: Justera tiden beroende på uppläggningen på plats för en given anläggning (avstånd för forskares arbetsställe från operationsbordet) och håll den konstant för hela studien. Att minimera den förflutna tiden mellan tumörborttagning och start av extraktionen är avgörande för avskiljning av instabila metaboliter som bryts ned efter att blodcirkulationen är avskuren från den studerade vävnaden. - Utför provtagning i rumstemperatur. Alternativt, placera provet på is när extraktionen utförs. I båda fallen, upprätthålla samma villkor för hela uppsättningen av prover.
- Ta ut sonden från injektionsflaskan.
- Tvätta fibrer med flytande kromatografi-masspektrometri (LC/MS) kvalitet vatten för 5 s genom att fördjupa dem i LC/MS-grad vatten. Låt inte sorbenten torka före fiberinfogningen för att säkerställa god reproducerbarhet av data.
- Sätt in fibrerna i hjärntumörvävnaden så långt ifrån varandra som möjligt, vilket säkerställer att hela extraktionsfasen är belägen inuti tumören.
OBS: Det rekommenderas att extraktioner utförs i replikat för att bestämma tumörens heterogena natur (Figur 2). Tre replikat per prov rekommenderas. - Låt sonden vara kvar i 30 min i vävnaden (mätt med en timer).
- Använd tomma kontroller för att eliminera felkällor relaterade till förekomsten av artefakter som härrör från andra källor än den samplade tumören. För att erhålla blankkontroller, ämnesfibrer till samma analytiska arbetsflöde, som beskrivs ovan, men utan provtagningssteget (insättning i vävnaden eller något annat prov/matris). I databehandlingssteget, sammanställa analytes extraheras från dessa fibrer i en "uteslutningslista" för att utesluta signaler som härrör från föroreningar som härrör från lösningsmedel eller fibertillverkning. Det rekommenderas att minst 3 replikat av blank används.
OBS: För att kontrollera risken för kontaminering är det nödvändigt att utföra provtagning från handskar, bord, apparatur eller andra ytor som kan utgöra en kontaminationsrisk. I sådana fall är fiberpreparering, tiden för extraktion, och desorptionsprotokoll samma som för proverna. - Medan extraktion utförs, märk de injektionsflaska som ska användas för lagring av sonderna efter extraktion.
- Efter 30 min, ta bort fiber (s) från hjärntumören.
- Tvätta fibrer med vatten för 3 s genom att puttra dem i LC/MS-gradigt vatten för att avlägsna rester av blod eller cellskräp från sonden så det slutliga extraktet innehåller endast små molekyler. Ett längre tvättsteg rekommenderas inte eftersom det kan leda till förlust av polära föreningar.
- Immobilisera fibrerna i pre-slit septa av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) injektionsflaska mössa genom piercing septa från botten med den icke-belagda änden av fibern.
- Lägg fibrerna immobiliserade i locket i separata HPLC-injektionsflaska och placera dem i den valda transportbehållaren.
- Utför steg 2.11-2.13 för fibrer som är dedikerade till tomma kontroller.
3. Transport och lagring
OBS: Flera alternativ finns för att transportera prover till laboratoriet. Det rekommenderas att en flytande kväve Dewar eller polystyren låda fylld med torris användas för transport; alternativt kan isförpackningar användas för omedelbar och snabb transport.
- Placera injektionsflaskan med fibrer i transportbehållaren.
- Vid laboratorium ankomst, omedelbart placera injektionsflaska med SPME fibrer i en -80 °C eller -30 °C frys. Förvara inte fibrer längre än 3 år vid -30 °C eller 5 år vid -80 °C.
4. Provpreparat för metabolomicsanalys
OBS: Detta steg bör endast utföras när alla prover för ett experiment har samlats in.
- Före instrumental analys, förbereda desorption lösningsmedel blandning: acetonitril:vatten 80:20 v / v.
- Ta ut injektionsflaskan som innehåller fibrer med blandat läge från frysen. Använd dessa för metabolomics analys.
- Etikett injektionsflaska som ska användas för desorption.
- Pipett 300 μL av desorptionslösningen (beredd i steg 4.1) till glasinlägg som placerats i 2 mL-injektionsflaskor.
- Utför desorption från varje fiber placeras i en separat insats genom att helt fördjupa beläggningen i desorption lösningsmedlet, sedan agitera den för 120 min vid 1.200 rpm med hjälp av vortex.
- Efter 120 min (när desorption är avslutad) ta bort lock med sonder.
- Förbered QC-prov genom att blanda 10 μL alikvoter av varje prov från provmängden. Provmängdens storlek beror på den experimentella designen. Det är viktigt att analysera alla prover som en sats.
- Stäng injektionsflaskan med nya lock.
- Placera injektionsflaskan i autosampler (4 °C) för den vätskekromatografi högupplösta masspektrometern (LC-HRMS) och flytta till steg 5.
OBS: Randomisera injektioner ordning av proverna inklusive kontroll ämnen. Injicera QC-prov efter varje 8-10 prov för att övervaka instrumentets stabilitet.
5. Metabolomikanalys med hjälp av omvänd fasvätentkromatografi och högupplöst masspektrometer (RPLC-HRMS-analys)
- Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och positivt joniseringsläge.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i positivt läge var följande: scan-intervall: m/z 80-1000; resolution 70 000, förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; sprayspänning: 1,5 kV; S-objektiv RF-nivå: 55%; S-lins spänning: 25 V; skimmerspänning: 15 V; kapillärtemperatur: 300 °C; lja gas: 40 a.u.; aux gas: 15 a.u.; AUX gasvärmare temperatur: 300 °C. Denna kromatografiska metod anpassades från Vuckovic et al.7. Injektionsvolym: 10 μL. - Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och läget för negativ jonisering.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i negativt läge: scan-intervall: m/z 80-1000; resolution 70 000, förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; sprayspänning: 2,5 kV; S-objektiv RF-nivå: 55%; S-objektiv spänning: -25 V; skimmerspänning: -15 V; kapillärtemperatur: 256 °C-ördgas: 48 a.u; aux gas: 11 a.u.; gasvärmaren AUX-temperatur: 413 °C. Denna kromatografiska metod antogs från Vuckovic et al.7. Injektionsvolym: 10 μL. - Kalibrera instrumentet enligt tillverkarens rekommendation.
OBS: I den aktuella studien kalibrerades instrumentet med hjälp av extern kalibrering var 48 h, vilket resulterade i en massanoggrannhet <2 ppm. - Starta analysen genom att klicka på Start-knappen i den programvara som driver instrumentet.
- När analysen är klar, byt ut RPLC-kolumnen med HILIC-kolumnen, ändra de mobila faserna och gå till steg 6.
6. Metabolomik analys med hjälp av hydrofil interaktion vätskekromatografi och högupplöst masspektrometer (HILIC-HRMS analys)
- Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och positivt joniseringsläge.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i positivt läge var följande: scan-intervall: m/z 80-1000; resolution 70 000, förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; sprayspänning: 1,5 kV; S-objektiv RF-nivå: 55%; S-lins spänning: 25 V; skimmerspänning: 15 V; örtgas: 60 a.u.; aux gasar: 40 a.u.; aux gasvärmare temperatur: 425 °C; kapillärtemperatur: 325 °C. Kromatografisk metod anpassades från Vuckovic et al.7. Injektionsvolym: 10 μL. - Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och läget för negativ jonisering.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i negativt läge var följande: scan intervall: m/z 80-1000; resolution 70 000, förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; spray spänning: 1,3 kV; S-objektiv RF-nivå: 55%.; S-objektiv spänning: -25 V; skimmerspänning: -15 V; kapillärtemperatur: 263 °C; örtgas: 60 a.u.; aux gas: 30 a.u.; aux gasvärmare temperatur: 425 °C. Kromatografisk metod anpassades från Vuckovic et al.7. Injektionsvolym: 10 μL. - Kalibrera instrumentet enligt tillverkarens rekommendation.
OBS: I den aktuella studien kalibrerades instrumentet med hjälp av extern kalibrering var 48 h, vilket resulterade i en massanoggrannhet <2 ppm. - Starta analysen genom att klicka på Start-knappen i den programvara som driver instrumentet.
7. Provberedning för lipidomics-analys
OBS: Detta steg bör endast utföras när alla prover för experimentet har samlats in.
- Innan analysen påbörjas, bered desorptionsmedelsblandning: isopropanol:metanol 50:50 v/v.
- Ta ut injektionsflaskan som innehåller de C18-fibrer som är avsedda för lipidomics-analys från frysen.
- Etikett injektionsflaska som ska användas för desorption.
- Pipett 200 μL av desorptionslösningen (beredd i steg 7.1) till silaniserade glasinsatser placerade i 2 mL-injektionsflaskor.
OBS: Icke-silaniserade skär kan också användas, men deras användning kan resultera i dålig reproducerbarhet av föreningar med hög logP, som sådana föreningar kan icke-specifikt fästa på glasväggar. - Utför desorption från varje fiber i en separat insats genom att helt fördjupa beläggningen i desorptionslösningsmedlet, sedan agiterar den i 60 min vid 1 200 rpm med hjälp av vortex.
- Efter 60 min när desorption är avslutad ta bort lock med sonder.
- Förbered QC-prov genom att blanda 10 μL alikvoter av varje prov från provmängden. Provmängdens storlek beror på den experimentella designen. Det är viktigt att analysera alla prover som en sats.
- Stäng injektionsflaskan med nya lock.
- Placera injektionsflaskan i autosampler (4 °C) för den vätskekromatografi högupplösta masspektrometern (LC-HRMS) och flytta till steg 8.
8. Lipidomics-analys med hjälp av omvänd fasvätskekromatografi och högupplöst masspektrometri (RPLC-HRMS-analys)
- Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och positivt joniseringsläge.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i positivt jonläge var följande: scan-intervall: m/z 100-1000; förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; spray spänning: 3,5 kV, S-objektiv RF-nivå: 55%; S-lins spänning: 25 V; skimmerspänning: 15 V; kapillärtemperatur 275 °C, örtgas: 30 a.u.; aux gas: 10 a.u.; reservgas: 2 a.u.; sondvärmarens temperatur 300 °C. LC-parametrar som användes var: fas A: metanol:vatten, 40:60 med 10 mM ammoniumacetat och 1 mM ättiksyra ; fas B: isopropanol:metanol, 90:10 med 10mM ammoniumacetat och 1 mM ättiksyra.; lutningen: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7.5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17.0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23.0 min – STOPP; C18 Kolonn, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; flöde: 0,2 mL/min; ugnstemperatur: 55 °C; injektionsvolym: 10 μL. - Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och läget för negativ jonisering.
OBS: De parametrar som användes i den aktuella studien var följande: HRMS-parametrar för negativt jonläge: scan-intervall: m/z 100-1000; förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); injicera tid till C-trap: auto; spray spänning: 3,5 kV, S-objektiv RF-nivå: 55%; S-objektiv spänning: -25 V; skimmerspänning: -15 V; kapillärtemperatur 275 °C, lja gas: 30 a.u; aux gas: 10 a.u.; reservgas: 2 a.u; sondvärmarens temperatur 300 °C. Kromatografisk metod: samma som i 8.1. - Kalibrera instrumentet enligt tillverkarens rekommendation.
OBS: I den aktuella studien kalibrerades instrumentet med hjälp av extern kalibrering var 48 h, vilket resulterade i en massanoggrannhet <2 ppm. - Starta analysen genom att klicka på Start-knappen i den programvara som använder ditt instrument.
- När analysen är klar, byt ut RPLC-kolumnen med HILIC-kolumnen, ändra de mobila faserna och gå till steg 9.
9. Lipidomics analys med hjälp av hydrofil interaktion vätskekromatografi och högupplöst masspektrometer (HILIC-HRMS analys)
- Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och positivt joniseringsläge.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i positivt jonläge var följande: scan-intervall: m/z 100-1000; förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); sprayspänning: 1,5 kV; S-objektiv RF-nivå: 55%; S-lins spänning: 25 V; skimmerspänning: 15 V; kapillärtemperatur 325 °C, örtgas: 60 a.u.; aux gas: 30 a.u.; reservgas: 2 a.u.; sondvärmarens temperatur 320 °C. LC-parametrar som användes var: fas A: 5 mM ammoniumacetat i vatten; fas B: acetonitril; lutningen: 0 – 2min – 4% B; 15.0 – 20% B; 15.1 – 4% B, 21.0 min – STOPP; 3 μm 100 mm x 2,1 mm pelare; flöde: 0,4 mL/min; ugnstemperatur: 40 °C; injektionsvolym: 10 μL. - Ställ in parametrarna för LC-HRMS-analysen och läget för negativ jonisering.
OBS: De parametrar som används i den aktuella studien i negativt jonläge var följande: scan-intervall: m/z 80-1000; förvärv som utförts med hjälp av AGC (1 000 000 joner); spray spänning: 1,5 kV, S-objektiv RF-nivå: 55%; S-objektiv spänning: -25 V; skimmerspänning: -15 V; kapillärtemperatur 320 °C, örtgas: 50 a.u.; aux gas: 21 a.u.; reservgas: 3 a.u.; sondvärmarens temperatur 320 °C. Den kromatografiska metoden var densamma som beskrivs i 9.1. - Kalibrera instrumentet enligt tillverkarens rekommendation.
OBS: I den aktuella studien kalibrerades instrumentet med hjälp av extern kalibrering var 48 h, vilket resulterade i en massanoggrannhet <2 ppm. - Starta analysen genom att klicka på Start-knappen i den programvara som driver instrumentet.
10. Databehandling och statistisk analys
- Bearbeta data med hjälp av programvara som är kompatibel med formatet på de obehandlade datafilerna.
- Utför statistisk analys med hjälp av de bearbetade uppgifterna.
OBS: Typen av test beror på den vetenskapliga hypotesen och utformningen av studien. I den aktuella studien användes Principal Component Analysis, Partial-Least Square-Discriminant Analysis och enkelriktad ANOVA.
Representative Results
Utnyttja fast fas mikroextraktion som ett prov beredningsmetod i kombination med flytande kromatografi kopplade till högupplösta masspektrometri och en avancerad databehandling programvara tillät oss att framgångsrikt karakterisera metabolom och lipidome av mänskliga hjärntumörer. Sonden, vars storlek var likvärdig med en akupunktur nål, orsakade minsta skada på den studerade vävnaden och ingen vävnad konsumtion, därför, möjliggör ytterligare användning av prover för histologiska eller genetiska studier. Tillfredsställande separation av de valda grupperna erhölls för både omvänd fas och HILIC kolumner, och för både jonisering lägen i metabolomik och lipidomics analyser. Användningen av båda separationsmetoderna inte bara i metabolomik, men också i lipidomics analys som värdefulla kompletterande data. Den omvända faskolonnen separerar lipider med avseende på deras kolkedjors längd och förekomsten av omättade bindningar, medan HILIC-kolonnen är användbar för profilering av lipidgrupper, särskilt fosfolipider8.
Reproducerbarheten av den instrumentella analysen befanns vara mycket bra baserat på den snäva klustring av QC prover på den huvudsakliga komponent analys plot (Figur 3A, de tre QC prover injiceras var åttonde patienternas prover längs sekvensen överlappning). Dessutom konstaterades extraktionsstom som användes för negativ kontrollanalys för att skilja väl från verkliga prover. Det breda utbudet av analyter som extraherades av sonderna underlättade upptäckten av representativa arter, vilket på ett framgångsrikt sätt möjliggör differentiering mellan mänskliga hjärntumörer baserat på deras histologiska ursprung, malignitet och andra faktorer (t.ex. genetisk). Figur 3B visar lipidomicsdata för prover som samlats in från patienter med gliom och meningiomas. Möjliggöra differentiering mellan dessa tumörer, som kännetecknades av olika histologiska ursprung och malignitet, var ett viktigt mål för studien, som meningiomas anses allmänt som godartade tumörer, medan gliomas är en av de mest maligna. Dessutom, i figur 4 presenterar metabolomik data, gliom delades baserat på deras grad av malignitet i hög och låg. Dessa undergrupper jämfördes med den molekylära fenotypen av meningiomas. I båda fallen observerades framstående separation av kluster. Numera är diagnostik av gliom främst bygger på att fastställa specifika genetiska mutationer i tumörprover. Därför jämfördes erhållna resultat med genotypningsdata. Figur 5A presenterar separation av proverna med detekterade co-deletion 1p19q och prover där mutationen inte observerades.
Statistisk analys tillåter också val av föreningar i de studerade grupperna. Dessa föreningar kan betraktas som potentiella biomarkörer i de fall där en lämpligt stor kohort prov tas i prov. Mer djupgående analys, inklusive avgörande bekräftelse av påvisade föreningar genom fragmentering och jämförelse av upptäckta arter med analysnormer, krävs dock för att dra definitiva slutsatser av biologisk karaktär. Exempel på sådana diskriminanta metaboliter presenteras i figur 3C och figur 5B. Dessa föreningars identiteter, dvs, sphingomielyn: SM d36:1 och proline bekräftades genom att jämföra fragmenteringsmönster hos metaboliterna från provet och autentiska standarder.
Bild 1: SPME-fibrer förberedda för extraktionsprocessen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Extraktion av meningiom med hjälp av SPME-sonder. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: PCA och lådtomter för gliom och meningeom. Huvudkomponentanalys plot som innehåller (A) alla analyserade prover inklusive ämnen, extraktion QC, ämnen, meningiomas, gliom; (B) som endast innehåller studerade grupper (efter uteslutning av ämnen och QC). (C) låda morrhår tomt för sphingomielyn: SM d36:1 differentierande patient med gliom och meningiom. Lipidomics data. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: PCA för HGG, LGG och meningiom. Huvudkomponentanalys plot som visar differentiering mellan (A) höggradig gliom (HGG) och meningiomas (MEN)9 och (B) låggradig gliom (LGG) och meningiomas. Metabolomics data omtryckt från Via Medica ref9 med tillstånd. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: PCA och lådtomer för gliom med och utan radering. (A) Huvudkomponentanalys plot visade skillnader hos patienter med och utan samradering 1p19q; (B) låda morrhår tomter för proline differentierade patienter med och utan samborttagning 1p19q; n-utan borttagning, y-med borttagning. Metabolomik data Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Oriktade metabolomik och lipidomics används ofta i studier inriktade på att identifiera tumör biomarkörer. Emellertid, i de flesta fall, forskare leta efter föreningar som kan användas för screening av sjukdomen. Följaktligen är de föredragna biologiska proverna blod eller urin på grund av deras relativt enkel åtkomst. Analys av tumörvävnad utförs främst för att förstå mekanismerna bakom sjukdomen, karakterisera olika tumörtyper etc. Analys på plats av tumörbiomarkörer utförs sällan, eftersom sådana tillämpningar kräver omfattande provberedning. Alternativt, strategier baserade på realtidsanalys av vävnadsprofiler utan förval av specifika biomarkörer tjänar uppmärksamhet av det medicinska samfundet3,4. Lösningen som presenteras häri ger ett annat perspektiv på vävnadsbearbetning på plats genom att avtäcka den typ av information som kan erhållas via sådana metoder.
Kombinationen av provtagning, provberedning och extraktion gör SPME som ett mycket användbart verktyg för analys på plats. Dessutom möjliggör bristande vävnadskonsumtion under provtagningen ytterligare användning av samma prover för biomarköranalys och rutintester (genotypning, histologisk analys), därför, vilket lägger till ny information till resultaten av standardtestning. Provtagningsanordningen har en mycket enkel design, dess funktion är mycket lätt, och ingen särskild utbildning krävs för att utföra extraktionen själv. Men att uppnå tillförlitliga resultat kräver mycket mer än bara korrekt hantering av enheter. För att korrekt utföra experimentet måste man förstå extraktionsprocessen, provets natur och vara medveten om potentiella misstag som kan påverka data.
Det är viktigt att överväga heterogeniteten i cancervävnad10; proverade tumörer kan innehålla delar som genomgår nekros, förkalkning och hypoxi, och var och en av dessa processer kommer att återspeglas i metabolom och lipidome uppnås, vilket påverkar resultat. Därför rekommenderas att rumslig upplösningsprovtagning utförs genom insättning av flera fibrer i olika delar av cancervävnaden, eller alternativt, att en längre beläggning ska användas för att penetrera hela tumören så att man får genomsnittlig information om tumören. Om den rumsliga upplösningens provtagningsmetod utförs, kan fibrer alla desorberas till ett desorptionslösningsmedel; detta skulle inte bara möjliggöra uppnåendet av övergripande information om tumören, men också öka känsligheten i analysen. Alternativt skulle desorption av enskilda fibrer i separata injektionsflaska göra det möjligt för undersökningar att räkna ut den inre mångfalden av hjärntumören, som består av kärnan byggd av cancerceller, och den yttre zonen, som är gränsen för frisk vävnad. Djupare delar av tumören är oftast mer skadade av de processer som rör cancer11. Emellertid, utredare måste tänka på att detta alternativ äventyrar metod känslighet och det totala antalet detekterbara föreningar. I det aktuella arbetet användes en 7 mm beläggning; denna längd ansågs vara optimal för olika storlekar av tumörer som ingår i studien. Beläggningarna trängde in i tumörerna, och gav därmed icke-speciell upplösning, men i genomsnitt data över provet. Oavsett vilket protokoll som valts är det viktigt att samma protokoll följs under hela studien, inklusive antalet fibrer som används för individuell provtagning, längden på beläggningen, extraktionstid, och alla andra faktorer som avgränsas i detta arbete.
Det är viktigt att kontrollera analysens kvalitet. Den poolade QC (se steg 4.7 och 7.7 i protokollet) bör förberedas och användas för övervakning av instrumentstabilitet under körningen av hela provbaten. De tomma kontrollerna (se steg 2.8) kan senare användas för att förbereda en "undantagslista" för att eliminera signaler av föroreningar som härrör från lösningsmedel eller fibertillverkning. Vid speciella tillfällen, såsom en risk för kontaminering, är det nödvändigt att utföra provtagning från handskar, bord, apparatur eller andra ytor som kan utgöra en kontaminationsrisk. I sådana fall är fiberpreparering, tidpunkt för extraktion och desorptionsprotokoll samma som för proverna.
Metabolomiska och lipidomiska analyser är helt inriktade på små molekyler (mindre än 1 500 Da) som förekommer i en organism eller specifika komponenter i organismen, såsom specifika organ, vävnad, vätskor, celler etc. Metabolomic och lipidomics erbjuder en ögonblicksbild av biokemiska förändringar som sker i kroppen, och när det gäller cancer, integrerar de information som rör genomet, histologi och malignitet av tumören. Dessa omikvetenskaper skapar en koppling mellan fysiologi och fenotyp då metaboliter är högre upp i den biokemiska stegen än proteiner eller gener12. Genom att förstå metabolom och lipidome av cancertumörer, kommer vi närmare att upptäcka fenotyp bland alla -omics vetenskaper som dessa grenar av studien erbjuder mer djupgående kunskap om dynamiska förändringar av molekyler som ett svar av levande organismer till olika stimuli. Som presenteras i detta arbete, de uppgifter som erhållits i ett urval motsvarar histologi av cancer, dess grad av malignitet, och det återspeglar förändringar som sker på genomet nivå. I gliomas, som den typ av cancer av intresse i denna studie, den information som döljer i arvsmassan är särskilt viktigt, som en personlig behandling utvecklas baserat på resultaten av genetiska tester. Särskilda mutationer är prognostiska markörer för resultaten av cellgifter- eller strålbehandling. Som visat här, är valet av biomarkörer som återspeglar en given mutation möjlig med den föreslagna strategin. Mutation markörer, liksom ytterligare deskriptorer typer som de som anger graden av malignitet av tumören kan också användas för att stödja rutinmässiga diagnostiska metoder.
Ex vivo kemisk biopsi med användning av fast fas mikroextraktion fibrer är det första steget i tillämpningen av metoden till intraoperativ diagnostik. Metoden kan enkelt antas för in vivo-provtagning i väntan på tillstånd från lämpliga Etiska nämnder. I sådana fall måste sterilisering av SPME-apparater utföras enligt de accepterade steriliseringsförfarandena på det sjukhus där provtagning ska genomföras, dvs. De förbetingade och steriliserade fibrerna måste förvaras i förseglade förpackningar märkta med ett steriliserings utgångsdatum. Det är viktigt att notera att fibrer inte bör rengöras med användning av ytaktiva ämnen. Ett sådant förfarande kan orsaka ospecifika förändringar i sorbentsammansättning, vilket påverkar extraktionen av analyter. I de studier som beskrivs här användes en utvinningsperiod på 30 min, men andra rapporter bekräftar att kortare tider kan ge tillfredsställande resultat i in vivo-studierna 13. Huq et al. visade att analyt jämviktstid uppnås snabbare i vävnad, som en komplex matris, än i enkla matriser14. Reproducerbarheten av de erhållna resultaten kan dock äventyras under kortare extraktionsperioder eftersom fler analyter kommer att utvinnas under förutjämviktsförhållanden; därför måste exakt tidskontroll genomföras.
Båda omikvetenskaper som utnyttjas som en del av detta arbete har utmärkt potential som biomarkör upptäckt verktyg. När biomarkörer valts eller en kemometrisk modell är etablerad kan medicinsk diagnostik som bygger på bestämning av målmetaboliter via metoder som gäller för undersökningar på plats, såsom den SPME-metod som beskrivs i detta arbete, utvecklas och implementeras som en del av rutindiagnostik.
Protokollet som föreslås i det aktuella manuskriptet beskriver hur man utför oriktade metabolomic och lipidomic analyser av cancer vävnad med hjälp av fasta fas mikroextraktion för screening av potentiella biomarkörer. Den är utformad för att möjliggöra utvinning av representativa föreningar, differentiering av tumörer, och identifiering av diskriminerande föreningar som karakteriserar en viss cancer, dvs. De oriktade analyser med SPME som beskrivs i denna artikel utgör en utgångspunkt i utvecklingen av snabb intraoperativ diagnostik, där en utvald panel av föreningar kan bestämmas utan nödvändighet för screening av alla föreningar som finns i provet. Av intresse för snabba diagnostiska resultat skulle SPME-sonder som används för utvinning på plats kunna kopplas direkt till analytisk instrumentering som finns i sjukhusanläggningen. Enkla extraktioner som utförs med minsta provberedning följt av kromatografifri analys skulle avsevärt förkorta den totala tiden från timmar till några minuter, som redan beskrivits för läkemedelsövervakning15.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien fick stöd av grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 från National Science Centre. Författarna vill erkänna MilliporeSigma, ett företag av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, för att tillhandahålla SPME-enheter som används i detta arbete. Life science-verksamheten i Merck fungerar som MilliporeSigma i USA och Kanada. Dessutom vill författarna tacka Thermo Fisher Scientific för tillgång till Q-Exactive Focus orbitrap masspektrometer.
Författarnas bidrag: JB: optimering av provberedning och LC-MS-parametrar, prestanda hos SPME-LC-MS-experiment, dataanalys, statistisk analys och datatolkning och manuskriptberedning som rör lipidomics-delen; PZG: samordning och prestanda av majoriteten av provtagningar på sjukhus, optimering av provtagnings- och provberedningsparametrar, prestanda hos SPME-LC-MS-experiment, dataanalys, statistisk analys och datatolkning, manuskriptberedning som relaterar till metabolomikdel; MG – hjälp vid optimering av provberedning, LC-MS-metod och dataanalys som rör lipidomicsdel; KG: co-performance av SPME-provtagningar och optimering av provtagning och provberedning, SPME-LC-MS-analys relaterad till metabolomikdel; KC: prestanda av flera SPME provtagningar på sjukhus, hjälp vid optimering av provtagning, provberedning och dataanalys relaterad till metabolomikdel; KJ: prestanda av flera SPME provtagningar på sjukhus, hjälp i lipidomics analys; DP: prestanda av kirurgiska ingrepp, rekrytering av patienterna; JF: prestanda av kirurgiska ingrepp, rekrytering av patienterna; MH: prestanda av kirurgiska ingrepp, samordning av klinisk del av forskningen; BB: koncept, samordningstillsyn av projektet och manuskriptberedning, utförande av flera provtagningar
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
