Summary
पांडुलिपि ठोस चरण माइक्रोएक्सट्राक्शन के साथ मानव ब्रेन ट्यूमर के ऑन-साइट नमूना प्रस्तुत करती है जिसके बाद बायोमार्कर की खोज की दिशा में उनकी जैव रासायनिक प्रोफाइलिंग होती है।
Abstract
कैंसर निदान और वर्गीकरण के लिए उपलब्ध उपकरणों की विविधता के बावजूद, ट्यूमर के तेज और सरल लक्षण वर्णन को सक्षम करने वाले तरीकों की अभी भी आवश्यकता है। हाल के वर्षों में, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री एक बीमारी के संभावित बायोमार्कर के रूप में भेदभावपूर्ण यौगिक की अलक्षित प्रोफाइलिंग के लिए पसंद की एक विधि बन गया है । बायोफ्लुइड को आम तौर पर उनकी पहुंच और आसान नमूना प्रसंस्करण को देखते हुए बेहतर मैट्रिस माना जाता है जबकि प्रत्यक्ष ऊतक प्रोफाइलिंग किसी दिए गए कैंसर के बारे में अधिक चयनात्मक जानकारी प्रदान करता है। पारंपरिक तरीकों के माध्यम से विश्लेषण के लिए ऊतकों की तैयारी बहुत अधिक जटिल और समय लेने वाली है, और इसलिए, तेजी से साइट पर विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। वर्तमान काम एक नमूना तैयारी और साइट पर छोटे अणुओं की निकासी के संयोजन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, तुरंत बाद ट्यूमर resection । नमूना उपकरण, जो एक्यूपंक्चर सुई के आकार का है, सीधे ऊतक में डाला जा सकता है और फिर वाद्य विश्लेषण के लिए पास की प्रयोगशाला में ले जाया जा सकता है । मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स विश्लेषण के परिणाम ट्यूमर, द्रोह और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की हिस्टोलॉजिकल उत्पत्ति से संबंधित ट्यूमर के फेनोटाइप की स्थापना के साथ-साथ भेदभाव यौगिकों या संभावित बायोमार्कर के चयन के लिए दृष्टिकोण की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं। तकनीक की गैर-विनाशकारी प्रकृति नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले परीक्षणों के बाद के प्रदर्शन की अनुमति देती है जैसे, हिस्टोलॉजिकल परीक्षण, एसपीएमई विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों पर, इस प्रकार व्यक्तिगत निदान का समर्थन करने के लिए अधिक व्यापक जानकारी की प्राप्ति को सक्षम करता है।
Introduction
चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और गणना टोमोग्राफी (सीटी) मस्तिष्क घावों के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल मुख्य तरीके हैं। ब्रेन ट्यूमर भेदभाव आम तौर पर अतिरिक्त धुंधला और उन्नत इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकों के साथ हिस्टोपैथोलॉजी पर आधारित है। २०१६ में विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा जारी केंद्रीय तंत्रिका ब्रेन ट्यूमर पर अद्यतन मार्गदर्शन के अनुसार, आनुवंशिक परीक्षण इन ट्यूमर1के भेदभाव और वर्गीकरण के लिए महत्वपूर्ण हैं । ट्यूमर का भेदभाव और वर्गीकरण चिकित्सकों को किसी दिए गए प्रकार के ट्यूमर के लिए सबसे प्रभावी उपचार चुनने की अनुमति देता है जिससे रोगी की जीवन प्रत्याशा का विस्तार होता है। दुर्भाग्य से, अपने रोगियों के लिए एक इष्टतम चिकित्सा का चयन करने में चिकित्सकों की सहायता करने के लिए इस तरह के उन्नत तरीकों की उपलब्धता के बावजूद, ग्लियोब्लास्टोमा (चतुर्थ ग्रेड ग्लियोमा) के साथ निदान रोगियों की जीवन प्रत्याशा केवल 15-16 महीने2के बारे में है । यहां तक कि परिष्कार और नैदानिक उपकरणों के रूप में कहा इमेजिंग और हिस्टोलॉजिकल तरीकों की वृद्धि की सटीकता के साथ, वहां अभी भी नई पूरक जानकारी की पेशकश करने के लिए उपचार के पाठ्यक्रम के बारे में निर्णय में चिकित्सकों सहायता करने में सक्षम तकनीकों के लिए एक महान की जरूरत है । पिछले वर्षों में, कैंसर3,4के इंट्राऑपरेटिव विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित कई नए दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं। ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैकक्शन (एसपीएमई) की क्षमता, यहां प्रस्तुत विधि, तेजी से ऑन-साइट विश्लेषण उपकरण के रूप में, पहले से ही विभिन्न अध्ययनों में प्रदर्शित की गई है5। वर्तमान पांडुलिपि विधि के नैदानिक अनुप्रयोगों में से एक, मानव मस्तिष्क ट्यूमर के अलक्षित मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स दिखाती है। अप्रारक जांच संभावित बायोमार्कर की खोज में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु पेश करते हैं । एक बार स्थापित होने के बाद, इस तरह के बायोमार्कर का उपयोग उसी तकनीक का उपयोग करके ट्यूमर के बीच अंतर करने के लिए नैदानिक संदर्भ के रूप में किया जा सकता है।
एसपीएमई एक संतुलन आधारित नमूना तैयारी तकनीक है जो नमूना मैट्रिस से छोटे अणुओं को निष्कर्षण चरण की छोटी मात्रा के उपयोग के साथ निकालती है। डिवाइस (प्रोब) के एसपीएमई के सबसे पारंपरिक विन्यास में, एक फाइबर को उचित निष्कर्षण चरण के साथ लेपित किया जाता है और ठोस समर्थन यानी धातु के तार5, 6पर स्थिर कियाजाताहै। बायोसंपांसिबल कोटिंग्स और डिवाइस (जांच) नमूना प्रीट्रीटमेंट जैसे, होमोजेनाइजेशन और निस्पंदन के बिना जटिल जैविक मैट्रिस से सीधे निष्कर्षण को सक्षम करते हैं। निष्कर्षण प्रक्रिया के माध्यम से, विश्लेषण को उनकी प्रारंभिक सांद्रता के अनुपात में निष्कर्षण चरण और नमूना मैट्रिक्स के बीच विभाजित किया जाता है। यदि निष्कर्षण काफी लंबा किया जाता है, तो संतुलन हासिल किया जाता है। जबकि संतुलन में निष्कर्षण उच्चतम संभव संवेदनशीलता और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, पूर्व संतुलन निष्कर्षण भी संभव है और यहां तक कि कुछ मामलों में बेहतर है यानी, वीवो नमूना में, जहां समय पर साइट नमूना (जैसे, ऑपरेटिंग या आपातकालीन कमरे) के साथ जुड़े प्रतिबंध तेजी से निष्कर्षण की आवश्यकता है । किसी दिए गए एनालिटे का निष्कर्षण समय प्रोफ़ाइल आम तौर पर विश्लेषण के भौतिक गुणों से प्रभावित होता है, मैट्रिक्स का नमूना लिया जा रहा है, शर्बत के प्रकार का उपयोग किया जाता है, और कई अन्य निष्कर्षण स्थितियों से प्रभावित होता है। उनके निष्कर्षण काइनेटिक्स को नियंत्रित करने वाले कारकों की अधिकता से सभी यौगिकों का संतुलन निष्कर्षण सुनिश्चित करना व्यावहारिक रूप से असंभव हो जाता है जब मेटाबोलोमिक्स या लिपिडोमिक्स जैसे अलक्षित विश्लेषण किए जाते हैं। उपर्युक्त कारणों के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल का निष्कर्षण समय मनमाने ढंग से निर्धारित किया गया था ताकि एक तरफ मेटाबोलाइट्स की संतोषजनक संवेदनशीलता और कवरेज सुनिश्चित किया जा सके, और दूसरी ओर साइट पर उपयोग के लिए व्यावहारिकता।
इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि ऊतकों से नमूने की निकासी के लिए उपयोग की जाने वाली जांच का बहुत छोटा आकार केवल न्यूनतम ऊतक क्षति का कारण बनता है जबकि नमूना प्रक्रिया स्वयं किसी भी ऊतक का उपभोग नहीं करती है लेकिन नमूना क्षेत्र से छोटे अणुओं की बहुत कम मात्रा; इसलिए, एक ही नमूने को आगे नियमित परीक्षण यानी हिस्टोलॉजिकल या जेनेटिक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे एक ही नमूने से आवश्यक और पूरक जानकारी की प्राप्ति हो सकती है। इस तरह के पूरक, व्यापक डेटा ट्यूमर जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ सक्षम होगा, उंमीद है कि नए उपचार के लक्ष्यों की खोज की सुविधा । इस विधि का शोषण करने से लक्ष्य बायोमार्कर का निर्धारण करते समय ऑन-साइट इंट्राऑपरेटिव डायग्नोस्टिक्स की संभावना और बढ़ जाती है।
नीचे हम मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स विश्लेषण और डेटा प्रसंस्करण के लिए साइट पर ब्रेन ट्यूमर के नमूने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Protocol
यहां प्रस्तुत अध्ययन को टोरुन (केबी 628/2015) में निकोलस कोपरनिकस विश्वविद्यालय में बायडगोज़्ज़ में कोलेजियम मेडिडम की बायोएथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और किसी भी अन्य आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना याद रखें, जैसे (लेकिन सीमित नहीं) सुरक्षा दस्ताने और चश्मा। ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन (एसपीएमई) जांच के निष्कर्षण चरण को न छुएं।
1. एसपीएमई उपकरणों की तैयारी
- मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स के लिए मिश्रित मोड और C18 कोटिंग्स के साथ जांच (फाइबर) का उपयोग करें। नमूनों के दो सेट, मेटाबोलोमिक्स के लिए एक और लिपिडोमिक्स के लिए एक एकत्र करें।
- एसपीएमई जांच को ट्रिम करके जांच की कोटिंग को इष्टतम लंबाई में समायोजित करें। वर्तमान अध्ययन में, चयनित कोटिंग की लंबाई 7 मिमी थी। अध्ययन के तहत ट्यूमर के आकार के अनुसार फाइबर की लंबाई का चयन करें, यह सुनिश्चित करना है कि पूरे शर्बत ट्यूमर(चित्रा 1)में डूबे जा सकते हैं ।
- उन्हें मेथनॉल में भिगोने से जांच के कोटिंग्स की स्थिति: निकासी प्रक्रिया से पहले 1 घंटे की न्यूनतम अवधि के लिए पानी 50:50 v/v मिश्रण। कंडीशनिंग समाधान युक्त शीशी में नमूना (उदाहरण के लिए, अस्पताल) की साइट पर फाइबर परिवहन।
2. नमूना संग्रह प्रक्रिया
- एसपीएमई निष्कर्षण से पहले किसी भी तरह से ट्यूमर को धोएं या प्रीट्रीट न करें।
- ट्यूमर हटाने (प्रस्तुत अध्ययन में 2 मिनट) के बाद जितनी जल्दी हो सके नमूना शुरू करें।
नोट: किसी दी गई सुविधा (ऑपरेटिंग टेबल से शोधकर्ता के काम करने की साइट की दूरी) के लिए ऑन-साइट सेट-अप के आधार पर समय को समायोजित करें और इसे पूरे अध्ययन के लिए स्थिर रखें। ट्यूमर हटाने और निष्कर्षण की शुरुआत के बीच बीता समय को कम करना अस्थिर मेटाबोलाइट्स को पकड़ने के लिए महत्वपूर्ण है जो रक्त परिसंचरण के अध्ययन ऊतक से कट जाने के बाद नीचा दिखाते हैं। - कमरे के तापमान पर नमूना प्रदर्शन करें। वैकल्पिक रूप से, जब निष्कर्षण किया जाता है तो नमूना बर्फ पर रखें। किसी भी मामले में, नमूनों के पूरे सेट के लिए एक ही शर्तों को बनाए रखें।
- शीशी से जांच निकाल लें।
- तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस) ग्रेड पानी के साथ फाइबर को एलसी/एमएस ग्रेड पानी में डुबोकर 5 एस के लिए धोएं । डेटा की अच्छी प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए फाइबर प्रविष्टि से पहले शर्बत को सूखने न दें।
- जहां तक संभव हो, मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक में फाइबर डालें, यह सुनिश्चित करना है कि पूरे निष्कर्षण चरण ट्यूमर के अंदर स्थित है।
नोट: यह सिफारिश की जाती है कि ट्यूमर की विषम प्रकृति(चित्रा 2)को निर्धारित करने के लिए निष्कर्षण को दोहराने में किया जाए। प्रति नमूने तीन प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है। - ऊतक में 30 मिनट के लिए जांच छोड़ दें (एक टाइमर के साथ मापा) ।
- नमूना ट्यूमर के अलावा अन्य स्रोतों से उपजी कलाकृतियों की उपस्थिति से संबंधित त्रुटि के स्रोतों को खत्म करने के लिए खाली नियंत्रण का उपयोग करें। खाली नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, एक ही विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह के लिए विषय फाइबर, जैसा कि ऊपर वर्णित है, लेकिन नमूना चरण के बिना (ऊतक या किसी अन्य नमूना/मैट्रिक्स में प्रविष्टि)। डेटा प्रोसेसिंग चरण में, इन फाइबर से निकाले गए विश्लेषणों को "अपवर्जन सूची" में संकलित करें ताकि सॉल्वैंट्स या फाइबर विनिर्माण से उपजी संदूषकों से प्राप्त संकेतों को बाहर किया जा सके। यह सिफारिश की जाती है कि खाली की कम से कम 3 प्रतिकृति का उपयोग किया जाता है।
नोट: संदूषण के जोखिम की जांच करने के लिए, दस्ताने, टेबल, उपकरण या किसी अन्य सतहों से नमूना लेना आवश्यक है जो संदूषण जोखिम पैदा कर सकता है। ऐसे मामलों में, फाइबर तैयार करना, निष्कर्षण का समय, और अवशोषण प्रोटोकॉल नमूनों के लिए समान हैं। - जबकि निष्कर्षण किया जा रहा है, निष्कर्षण के बाद जांच के भंडारण के लिए उपयोग की जाने वाली शीशियों को लेबल करें।
- 30 मिनट के बाद, ब्रेन ट्यूमर से फाइबर (ओं) को हटा दें।
- जांच से रक्त या कोशिका मलबे के अवशेषों को हटाने के लिए उन्हें एलसी/एमएस ग्रेड पानी में डुबोकर 3 एस के लिए पानी के साथ फाइबर धोएं ताकि अंतिम अर्क में केवल छोटे अणु होते हैं । एक लंबा धोने के कदम की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि इससे ध्रुवीय यौगिकों का नुकसान हो सकता है।
- फाइबर के गैर-लेपित अंत के साथ नीचे से सेप्टा को छेदकर उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) शीशी कैप के पूर्व-स्लिट सेप्टा में फाइबर को स्थिर करें।
- अलग एचपीएलसी शीशियों में टोपी में स्थिर फाइबर रखो और उन्हें चयनित परिवहन कंटेनर में जगह है।
- खाली नियंत्रण के लिए समर्पित फाइबर के लिए चरण 2.11-2.13 प्रदर्शन करें।
3. परिवहन और भंडारण
नोट: प्रयोगशाला में नमूनों के परिवहन के लिए कई विकल्प उपलब्ध हैं। यह सिफारिश की जाती है कि परिवहन के लिए सूखी बर्फ से भरे तरल नाइट्रोजन देवर या पॉलीस्टीरिन बॉक्स का उपयोग किया जाए; वैकल्पिक रूप से, तत्काल और त्वरित परिवहन के लिए आइस पैक का उपयोग किया जा सकता है।
- परिवहन कंटेनर में फाइबर के साथ शीशियों रखें।
- प्रयोगशाला आगमन पर, तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस या -30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एसपीएमई फाइबर के साथ शीशियों को रखें। -30 डिग्री सेल्सियस या 5 साल में -80 डिग्री सेल्सियस पर 3 साल से अधिक फाइबर स्टोर न करें।
4. मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
नोट: यह चरण केवल एक बार किया जाना चाहिए एक प्रयोग के लिए सभी नमूनों को एकत्र किया गया है ।
- वाद्य विश्लेषण से पहले, डिसोर्टेपेशन सॉल्वेंट मिश्रण तैयार करें: एसीटोनिट्रिल: पानी 80:20 v/v।
- फ्रीजर से मिश्रित मोड फाइबर युक्त शीशियों को बाहर निकालें। मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण के लिए इनका उपयोग करें।
- डिऑर्गन के लिए लेबल शीशियों का उपयोग किया जाएगा।
- 2 एमएल शीशियों में रखे ग्लास आवेषण में डिसोरप्शन सॉल्यूशन (स्टेप 4.1 में तैयार) के पिपेट 300 माइक्रोन।
- डिऑर्क्रिप्शन सॉल्वेंट में कोटिंग को पूरी तरह से डुबोकर एक अलग डालने में रखे प्रत्येक फाइबर से अवशोषण करें, फिर भंवर का उपयोग करके 1,200 आरपीएम पर 120 मिनट के लिए आंदोलन करें।
- 120 मिनट के बाद (एक बार अवशोषण पूरा हो गया है) जांच के साथ टोपियां हटा दें।
- नमूना सेट से प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोन एलिकोट मिलाकर क्यूसी नमूना तैयार करें। नमूना सेट आकार प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है। सभी नमूनों को एक बैच के रूप में विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।
- नई टोपियां के साथ शीशियों को बंद करें।
- शीशियों को लिक्विड क्रोमेटोग्राफी हाई रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर (एलसी-एचआरएमएस) के ऑटोसंप्लर (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें और स्टेप 5 पर जाएं ।
नोट: नियंत्रण रिक्त स्थान सहित नमूनों के यादृच्छिक इंजेक्शन आदेश। उपकरण की स्थिरता की निगरानी के लिए हर 8-10 नमूनों के बाद क्यूसी नमूना इंजेक्ट करें।
5. उलट चरण तरल क्रोमेटोग्राफी और उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर (आरपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण) का उपयोग करके मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण
- एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और सकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को स्थापित करें।
नोट: सकारात्मक मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 80-1000; संकल्प 70 000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 1.5 केवी; एस लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस लेंस वोल्टेज: 25 वी; स्कीमर वोल्टेज: 15 वी; केशिका तापमान: 300 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: ४० a.u.; ऑक्स गैस: 15 a.u.; ऑक्स गैस हीटर तापमान: 300 डिग्री सेल्सियस। इस क्रोमेटोग्राफिक विधि को वुकोविक एट अल7से अनुकूलित किया गया था। इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और नकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को निर्धारित करें।
नोट: नकारात्मक मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर: स्कैन रेंज: m/z 80-1000; संकल्प 70 000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 2.5 केवी; एस लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस-लेंस वोल्टेज: -25 V; स्कीमर वोल्टेज: -15 वी; केशिका तापमान: 256 डिग्री सेल्सियस म्यान गैस: 48 एयू; ऑक्स गैस: 11 a.u.; ऑक्स गैस हीटर तापमान: 413 डिग्री सेल्सियस। इस क्रोमेटोग्राफिक विधि को वाकोविक एट अल7से अपनाया गया था। इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - निर्माता द्वारा अनुशंसित उपकरण को कैलिब्रेट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, उपकरण को हर 48 घंटे में बाहरी अंशांकन का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर सटीकता और एलटी;2 पीपीएम होता है। - उपकरण संचालित सॉफ्टवेयर में स्टार्ट बटन पर क्लिक करके विश्लेषण शुरू करें।
- विश्लेषण पूरा होने पर, आरपीएलसी कॉलम को एचआईएलआईसी कॉलम से बदलें, मोबाइल चरणों को बदलें और चरण 6 पर जाएं।
6. हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी और हाई-रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर (एचआईएलआईसी-एचआरएमएस विश्लेषण) का उपयोग करके मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण
- एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और सकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को स्थापित करें।
नोट: सकारात्मक मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 80-1000; संकल्प 70 000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 1.5 केवी; एस लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस लेंस वोल्टेज: 25 वी; स्कीमर वोल्टेज: 15 वी; म्यान गैस: ६० a.u.; ऑक्स गैस: 40 a.u.; ऑक्स गैस हीटर तापमान: 425 डिग्री सेल्सियस; केशिका तापमान: 325 डिग्री सेल्सियस। क्रोमेटोग्राफिक विधि को वुकोविक एट अल7से अनुकूलित किया गया था। इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और नकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को निर्धारित करें।
नोट: नकारात्मक मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 80-1000; संकल्प 70 000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 1.3 केवी; एस लेंस आरएफ स्तर: 55%;; एस-लेंस वोल्टेज: -25 V; स्कीमर वोल्टेज: -15 वी; केशिका तापमान: 263 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: ६० a.u.; ऑक्स गैस: 30 a.u.; ऑक्स गैस हीटर तापमान: 425 डिग्री सेल्सियस। क्रोमेटोग्राफिक विधि को वुकोविक एट अल7से अनुकूलित किया गया था। इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - निर्माता द्वारा अनुशंसित उपकरण को कैलिब्रेट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, उपकरण को हर 48 घंटे में बाहरी अंशांकन का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर सटीकता और एलटी;2 पीपीएम होता है। - उपकरण संचालित सॉफ्टवेयर में स्टार्ट बटन पर क्लिक करके विश्लेषण शुरू करें।
7. लिपिडोमिक्स विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
नोट: यह चरण केवल एक बार प्रयोग के लिए सभी नमूनों को एकत्र किया गया है किया जाना चाहिए ।
- विश्लेषण शुरू करने से पहले, डिसोरशन सॉल्वेंट मिश्रण तैयार करें: आइसोप्रोपेनॉल: मेथनॉल 50:50 v/v।
- फ्रीजर से लिपिडोमिक्स विश्लेषण के लिए समर्पित C18 फाइबर युक्त शीशियों को बाहर निकालें।
- डिऑर्गन के लिए लेबल शीशियों का उपयोग किया जाएगा।
- 2 एमएल शीशियों में रखे गए सिलनाइज्ड ग्लास आवेषण के लिए डिसोरप्शन सॉल्यूशन (स्टेप 7.1 में तैयार) के पिपेट 200 माइक्रोन।
नोट: गैर-सीलनीकृत आवेषण का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उनके उपयोग के परिणामस्वरूप उच्च लॉगप वाले यौगिकों की खराब प्रजनन क्षमता हो सकती है, क्योंकि ऐसे यौगिक विशेष रूप से कांच की दीवारों से जुड़ सकते हैं। - डिजायरपंप सॉल्वेंट में कोटिंग को पूरी तरह से डुबोकर एक अलग डालने में प्रत्येक फाइबर से अवशोषण करें, फिर भंवर का उपयोग करके 1,200 आरपीएम पर 60 मिनट के लिए आंदोलन करें।
- 60 मिनट के बाद जब अवशोषण पूरा हो जाता है जांच के साथ टोपियां हटा दें।
- नमूना सेट से प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोन एलिकोट मिलाकर क्यूसी नमूना तैयार करें। नमूना सेट आकार प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है। सभी नमूनों को एक बैच के रूप में विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।
- नई टोपियां के साथ शीशियों को बंद करें।
- शीशियों को लिक्विड क्रोमेटोग्राफी हाई रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर (एलसी-एचआरएमएस) के ऑटोसंप्लर (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें और स्टेप 8 पर जाएं ।
8. रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आरपीएलसी-एचआरएमएस विश्लेषण) का उपयोग करके लिपिडोमिक्स विश्लेषण
- एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और सकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को स्थापित करें।
नोट: सकारात्मक आयन मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 100-1000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 3.5 केवी, एस-लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस लेंस वोल्टेज: 25 वी; स्कीमर वोल्टेज: 15 वी; केशिका का तापमान 275 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: 30 a.u.; ऑक्स गैस: 10 a.u.; अतिरिक्त गैस: 2 a.u.; जांच हीटर तापमान 300 डिग्री सेल्सियस। एलसी पैरामीटर का उपयोग किया गया था: चरण एक: मेथनॉल: पानी, 40:60 10 mm अमोनियम एसीटेट और 1 m एसिटिक एसिड के साथ; चरण बी: आइसोप्रोपैनॉल: मेथनॉल, 90:10 10 एमएम अमोनियम एसीटेट और 1 एमएम एसिटिक एसिड के साथ।; ढाल: 0 मिनट - 20% बी; 1.0 मिनट - 20% बी; 1.5 मिनट - 50% बी; 7.5 मिनट - 70% बी; 13.0 मिनट - 95% बी; 17.0 मिनट - 95% बी; 17.1 मिनट - 95.5% बी; 23.0 मिनट - बंद करो; C18 कॉलम, 3.5 माइक्रोन, 2.1 मिमी x 75 मिमी; प्रवाह: 0.2 एमएल/न्यूनतम; ओवन तापमान: 55 डिग्री सेल्सियस; इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और नकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को निर्धारित करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: नकारात्मक आयन मोड के लिए एचआरएमएस पैरामीटर: स्कैन रेंज: m/z 100-1000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; सी-ट्रैप के लिए समय इंजेक्ट करें: ऑटो; स्प्रे वोल्टेज: 3.5 केवी, एस-लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस-लेंस वोल्टेज: -25 V; स्कीमर वोल्टेज: -15 वी; केशिका का तापमान 275 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: 30 a.u; ऑक्स गैस: 10 a.u.; अतिरिक्त गैस: 2 यू; जांच हीटर तापमान 300 डिग्री सेल्सियस। क्रोमेग्राफिक विधि: 8.1 के समान। - निर्माता द्वारा अनुशंसित उपकरण को कैलिब्रेट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, उपकरण को हर 48 घंटे में बाहरी अंशांकन का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर सटीकता और एलटी;2 पीपीएम होता है। - अपने इंस्ट्रूमेंट को ऑपरेट करने वाले सॉफ्टवेयर में स्टार्ट बटन पर क्लिक करके एनालिसिस शुरू करें।
- विश्लेषण पूरा होने पर, आरपीएलसी कॉलम को एचआईएलआईसी कॉलम से बदलें, मोबाइल चरणों को बदलें और चरण 9 पर जाएं।
9. हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी और हाई-रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर (एचआईएलआईसी-एचआरएमएस विश्लेषण) का उपयोग करके लिपिडोमिक्स विश्लेषण
- एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और सकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को स्थापित करें।
नोट: सकारात्मक आयन मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 100-1000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; स्प्रे वोल्टेज: 1.5 केवी; एस लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस लेंस वोल्टेज: 25 वी; स्कीमर वोल्टेज: 15 वी; केशिका का तापमान 325 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: ६० a.u.; ऑक्स गैस: 30 a.u.; अतिरिक्त गैस: 2 a.u.; जांच हीटर तापमान 320 डिग्री सेल्सियस. एलसी पैरामीटर का उपयोग किया गया: चरण एक: पानी में 5 मिमी अमोनियम एसीटेट; चरण बी: एसीटोनीट्रिल; ढाल: 0 - 2मिनट - 4% बी; 15.0 - 20% बी; 15.1 - 4% बी, 21.0 मिनट - स्टॉप; 3 माइक्रोन 100 मिमी x 2.1 मिमी कॉलम; प्रवाह: 0.4 एमएल/न्यूनतम; ओवन तापमान: 40 डिग्री सेल्सियस; इंजेक्शन की मात्रा: 10 माइक्रोल। - एलसी-एचआरएमएस विश्लेषण और नकारात्मक आयनीकरण मोड के मापदंडों को निर्धारित करें।
नोट: नकारात्मक आयन मोड में वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर इस प्रकार थे: स्कैन रेंज: m/z 80-1000; एजीसी (1,000,000 आयनों) का उपयोग करके किया गया अधिग्रहण; स्प्रे वोल्टेज: 1.5 केवी, एस-लेंस आरएफ स्तर: 55%; एस-लेंस वोल्टेज: -25 V; स्कीमर वोल्टेज: -15 वी; केशिका का तापमान 320 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस: ५० a.u.; ऑक्स गैस: 21 a.u.; अतिरिक्त गैस: 3 a.u.; जांच हीटर का तापमान 320 डिग्री सेल्सियस। क्रोमेग्राफिक विधि 9.1 में वर्णित थी। - निर्माता द्वारा अनुशंसित उपकरण को कैलिब्रेट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, उपकरण को हर 48 घंटे में बाहरी अंशांकन का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर सटीकता और एलटी;2 पीपीएम होता है। - उपकरण संचालित सॉफ्टवेयर में स्टार्ट बटन पर क्लिक करके विश्लेषण शुरू करें।
10. डेटा प्रोसेसिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण
- कच्चे डेटा फ़ाइलों के प्रारूप के साथ संगत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा की प्रक्रिया।
- प्रसंस्कृत डेटा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
नोट: परीक्षण का प्रकार वैज्ञानिक परिकल्पना और अध्ययन के डिजाइन पर निर्भर करता है । वर्तमान अध्ययन में, प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस, आंशिक-कम स्क्वायर-डिस्क्रिमिनेंट एनालिसिस और वन-वे एनोवा का इस्तेमाल किया गया ।
Representative Results
तरल क्रोमेटोग्राफी के साथ संयोजन में एक नमूना तैयारी विधि के रूप में ठोस चरण माइक्रोएक्सट्राक्शन का शोषण उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक उन्नत डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ने हमें मानव ब्रेन ट्यूमर के मेटाबोलोम और लिपिडोम को सफलतापूर्वक चित्रित करने की अनुमति दी। जांच, जिसका आकार एक्यूपंक्चर सुई के बराबर था, अध्ययन ऊतक को ंयूनतम नुकसान का कारण बना और कोई ऊतक की खपत, इसलिए, हिस्टोलॉजिकल या आनुवंशिक अध्ययन के लिए नमूनों के आगे उपयोग को सक्षम करने । चयनित समूहों का संतोषजनक पृथक्करण उलट चरण और हिलिक कॉलम दोनों के लिए प्राप्त किया गया था, और मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स विश्लेषण में आयनीकरण मोड दोनों के लिए। दोनों जुदाई विधियों का उपयोग न केवल मेटाबोलोमिक्स में, बल्कि लिपिडोमिक्स विश्लेषण में भी मूल्यवान पूरक डेटा प्रदान करता है। उलट चरण कॉलम उनकी कार्बन चेन की लंबाई और असंतृप्त बांड की उपस्थिति के संबंध में लिपिड अलग-अलग है, जबकि हिलिक कॉलम लिपिड समूहों, विशेष रूप से फॉस्फोलिपिड8की प्रोफाइलिंग के लिए उपयोगी है।
मुख्य घटक विश्लेषण भूखंड(चित्रा 3 ए,तीन क्यूसी नमूनों अनुक्रम ओवरलैप के साथ हर आठ रोगियों के नमूनों को इंजेक्ट करने वाले तीन क्यूसी नमूनों) पर क्यूसी नमूनों के तंग क्लस्टरिंग के आधार पर वाद्य विश्लेषण की प्रजनन क्षमता बहुत अच्छी पाई गई थी। इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले निष्कर्षण रिक्त स्थान वास्तविक नमूनों से अच्छी तरह से अलग पाए गए। जांच द्वारा निकाले गए विश्लेषण की विस्तृत श्रृंखला ने प्रतिनिधि प्रजातियों की खोज को सुगम बनाया, इस प्रकार सफलतापूर्वक मानव मस्तिष्क ट्यूमर के बीच भेदभाव के लिए उनके हिस्टोलॉजिकल उत्पत्ति, द्रोह और अन्य कारकों (जैसे, आनुवंशिक) के आधार पर अनुमति दी। चित्रा 3B ग्लियोमा और मेनिंगोमास के साथ रोगियों से एकत्र नमूनों के लिए लिपिडोमिक्स डेटा दिखाता है । इन ट्यूमर, जो विभिन्न हिस्टोलॉजिकल मूल और द्रोह की विशेषता थे के बीच भेदभाव को सक्षम करना, अध्ययन का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य था, क्योंकि मेनिंगोमा को आम तौर पर सौम्य ट्यूमर माना जाता है, जबकि ग्लियोमास सबसे घातक में से एक हैं। इसके अतिरिक्त, चित्रा 4 में मेटाबोलोमिक्स डेटा पेश करते हुए, ग्लियोमा को उनकी द्रोह की डिग्री के आधार पर उच्च और निम्न में विभाजित किया गया था। इन उप-समूहों की तुलना मेनिंगिओमा के आणविक फेनोटाइप से की गई थी। दोनों ही मामलों में, समूहों का प्रमुख पृथक्करण देखा गया। आजकल, ग्लियोमा के निदान मुख्य रूप से ट्यूमर के नमूनों में विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तन का निर्धारण करने पर निर्भर करता है। इसलिए, प्राप्त परिणामों की तुलना जेनोटीपिंग डेटा से की गई थी। चित्रा 5A का पता चला सह विलोपन 1p19q और नमूनों जहां उत्परिवर्तन नहीं देखा गया था के साथ नमूनों के जुदाई प्रस्तुत करता है ।
सांख्यिकीय विश्लेषण भी अध्ययन समूहों में यौगिकों के चयन की अनुमति देता है । इन यौगिकों को संभावित बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है, जहां उचित रूप से बड़े पलटन का नमूना लिया जाता है। हालांकि, अधिक गहराई से विश्लेषण, विखंडन और विश्लेषणात्मक मानकों के साथ पता लगाया प्रजातियों की तुलना द्वारा पता लगाया यौगिकों की निर्णायक पुष्टि सहित, एक जैविक प्रकृति के निश्चित निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए आवश्यक है । इस तरह के विभेदक मेटाबोलाइट्स के उदाहरण चित्र 3सी और चित्रा 5Bमें प्रस्तुत किए जाते हैं । इन यौगिकों की पहचान, यानी, sphingomielyn: एसएम d36:1 और प्रोलाइन नमूना और प्रामाणिक मानकों से मेटाबोलाइट्स के विखंडन पैटर्न की तुलना करके पुष्टि की गई ।
चित्रा 1: निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए तैयार एसपीएमई फाइबर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एसपीएमई जांच का उपयोग करके मेनिंगोमा का निष्कर्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: ग्लियोमा और मेनिंगियोमा के लिए पीसीए और बॉक्स प्लॉट। प्रमुख घटक विश्लेषण प्लॉट जिसमें(ए)सभी ने रिक्त स्थान, निष्कर्षण क्यूसी, रिक्त स्थान, मेनिंगोमा, ग्लियोमा सहित नमूनों का विश्लेषण किया; (ख)जिसमें केवल अध्ययन किए गए समूह (रिक्त स्थान और क्यूसी के बहिष्कार के बाद); (ग)sphingomielyn के लिए बॉक्स मूंछ साजिश: एसएम d36:1 ग्लियोमा और मेनिंगियोमा के साथ रोगी अंतर । लिपिडोमिक्स डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एचजीजी, एलजीजी और मेनिंगियोमा के लिए पीसीए। प्रमुख घटक विश्लेषण साजिश(ए)उच्च ग्रेड ग्लियोमास (एचजीजी) और मेनिंगियोमा (पुरुष)9 और(बी)निम्न ग्रेड ग्लियोमास (एलजीजी) और मेनिंगियोमा के बीच भेदभाव दिखाता है। मेटाबोलोमिक्स डेटा अनुमति के साथ वाया मेडिका रेफरी9 से फिर से मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: पीसीए और ग्लियोमा के लिए बॉक्स भूखंडों के साथ और बिना हटाने के। (ए)प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस प्लॉट ने सह-विलोपन 1p19q के साथ और बिना रोगियों में मतभेद दिखाए; (ख)के साथ और सह हटाने 1p19q के बिना और बिना प्रोलाइन विभेदित रोगियों के लिए बॉक्स मूंछ भूखंड; n-बिना हटाने, वाई-विद विलोपन। मेटाबोलोमिक्स डेटा कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
ट्यूमर बायोमार्कर की पहचान करने पर केंद्रित अध्ययनों में अलक्षकित मेटाबोलोमिक्स और लिपिडोमिक्स का उपयोग आमतौर पर किया जाता है। हालांकि, ज्यादातर मामलों में, शोधकर्ताओं ने यौगिकों कि रोग की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए देखो । नतीजतन, पसंदीदा जैविक नमूने उनके अपेक्षाकृत आसान पहुंच के कारण रक्त या मूत्र हैं । ट्यूमर ऊतक का विश्लेषण मुख्य रूप से रोग के पीछे तंत्र को समझने के लिए किया जाता है, विभिन्न ट्यूमर प्रकारों की विशेषता है, आदि। ट्यूमर बायोमार्कर का ऑन-साइट विश्लेषण शायद ही कभी किया जाता है, क्योंकि इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए व्यापक नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट बायोमार्कर के पूर्व चयन के बिना ऊतक प्रोफाइल के वास्तविक समय विश्लेषण के आधार पर रणनीतियां चिकित्सा समुदाय3,4का ध्यान आकर्षित कर रही हैं। इसमें प्रस्तुत समाधान इस तरह के तरीकों के माध्यम से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी के प्रकार का अनावरण करके साइट पर ऊतक प्रसंस्करण पर एक और परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है।
नमूना, नमूना तैयारी और निष्कर्षण का संयोजन एसपीएमई को ऑन-साइट विश्लेषण के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण के रूप में प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, नमूने के दौरान ऊतक की खपत की कमी बायोमार्कर विश्लेषण और नियमित परीक्षणों (जीनोटाइपिंग, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण) के लिए एक ही नमूनों का और उपयोग करने में सक्षम बनाती है, इसलिए, मानक परीक्षण के परिणामों में नई जानकारी जोड़ना। नमूना उपकरण एक बहुत ही सरल डिजाइन किया है, इसका संचालन बहुत आसान है, और निष्कर्षण ही प्रदर्शन करने के लिए कोई विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है। हालांकि, विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए उपकरणों की सिर्फ उचित हैंडलिंग की तुलना में बहुत अधिक की आवश्यकता है । प्रयोग को ठीक से करने के लिए, किसी को निष्कर्षण प्रक्रिया, नमूने की प्रकृति को समझने और डेटा को प्रभावित करने वाली संभावित गलतियों के बारे में पता होना चाहिए।
कैंसर के ऊतकों की विषमता पर विचार करना महत्वपूर्ण है10. नमूना ट्यूमर में परिगलन, कैल्सिफिकेशन और हाइपोक्सिया से गुजर रहे हिस्से हो सकते हैं, और इनमें से प्रत्येक प्रक्रिया मेटाबोलोम और लिपिडोम में परिलक्षित होगी, इस प्रकार परिणामों को प्रभावित करेगी। इसलिए, यह सिफारिश की जाती है कि स्थानिक संकल्प नमूना कैंसर ऊतक के विभिन्न भागों में कई फाइबर के सम्मिलन द्वारा किया जाए, या वैकल्पिक रूप से, कि ट्यूमर के पूरे हिस्से में प्रवेश करने के लिए एक लंबी कोटिंग का उपयोग किया जाए ताकि ट्यूमर पर औसत जानकारी प्राप्त की जा सके। यदि स्थानिक संकल्प नमूना विधि की जाती है, तो फाइबर को एक अवशोषण सॉल्वेंट में सभी को अवशोषित किया जा सकता है; यह न केवल ट्यूमर पर समग्र जानकारी की प्राप्ति के लिए अनुमति देगा, बल्कि विश्लेषण की संवेदनशीलता को भी बढ़ाएगा। वैकल्पिक रूप से, अलग शीशियों में व्यक्तिगत फाइबर के अवशोषण जांच मस्तिष्क ट्यूमर है, जो कैंसर कोशिकाओं से निर्मित कोर के होते हैं, और बाहरी क्षेत्र है, जो स्वस्थ ऊतक की सीमा है की आंतरिक विविधता का पता लगाने के लिए सक्षम हो जाएगा । ट्यूमर के गहरे हिस्से आमतौर पर कैंसर से संबंधित प्रक्रियाओं से अधिक क्षतिग्रस्त होते हैं11. हालांकि, जांचकर्ताओं को ध्यान में रखना चाहिए कि यह विकल्प विधि संवेदनशीलता और पता लगाने योग्य यौगिकों की कुल संख्या से समझौता करता है । वर्तमान कार्य में, 7 मिमी कोटिंग का उपयोग किया गया था; इस लंबाई को अध्ययन में शामिल ट्यूमर के विभिन्न आकारों के लिए इष्टतम माना जाता था। कोटिंग्स ट्यूमर में प्रवेश किया, और इस तरह गैर विशेष संकल्प प्रदान की है, लेकिन नमूना भर में औसत डेटा । चयनित प्रोटोकॉल के बावजूद, यह महत्वपूर्ण है कि पूरे अध्ययन के दौरान एक ही प्रोटोकॉल का पालन किया जाए, जिसमें व्यक्तिगत नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले फाइबर की संख्या, कोटिंग की लंबाई, निष्कर्षण समय और इस काम में चित्रित अन्य सभी कारक शामिल हैं।
विश्लेषण की गुणवत्ता को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। पूल किए गए क्यूसी (प्रोटोकॉल में चरण 4.7 और 7.7 देखें) को तैयार किया जाना चाहिए और पूरे नमूना बैच के संचालन के दौरान उपकरण स्थिरता की निगरानी के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। खाली नियंत्रण (चरण 2.8 देखें) का उपयोग बाद में सॉल्वैंट्स या फाइबर विनिर्माण से निकलने वाले संदूषकों के संकेतों को खत्म करने के लिए "अपवर्जन सूची" तैयार करने के लिए किया जा सकता है। विशेष अवसरों पर, जैसे कि संदूषण का खतरा, दस्ताने, टेबल, उपकरण या किसी अन्य सतहों से नमूना लेना आवश्यक है जो प्रदूषण का खतरा पैदा कर सकता है। ऐसे मामलों में, फाइबर तैयार करना, निष्कर्षण का समय और अवशोषण प्रोटोकॉल नमूनों के समान हैं।
मेटाबोलॉमिक और लिपिडोमिक विश्लेषण पूरी तरह से किसी जीव या जीव के विशिष्ट घटकों, जैसे विशिष्ट अंगों, ऊतक, तरल पदार्थ, कोशिकाओं आदि में दिखाई देने वाले छोटे अणुओं (1,500 डीए से कम) पर केंद्रित होते हैं। मेटाबोलॉमिक और लिपिडोमिक्स शरीर में होने वाले जैव रासायनिक परिवर्तनों का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, और कैंसर के मामले में, वे जीनोम, हिस्टोलॉजी और ट्यूमर के द्रोह से संबंधित जानकारी को एकीकृत करते हैं। ये ओमिक्स विज्ञान शरीर विज्ञान और फेनोटाइप के बीच संबंध बनाते हैं क्योंकि मेटाबोलाइट्स प्रोटीन या जीन12की तुलना में जैव रासायनिक सीढ़ी में अधिक होते हैं । कैंसर ट्यूमर के मेटाबोलोम और लिपिडोम को समझकर, हम सभी-ओमिक्स विज्ञानों के बीच फेनोटाइप की खोज के करीब आते हैं क्योंकि अध्ययन की ये शाखाएं विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए जीवित जीवों की प्रतिक्रिया के रूप में अणुओं के गतिशील परिवर्तनों का अधिक गहराई से ज्ञान प्रदान करती हैं। जैसा कि इस काम में प्रस्तुत किया गया है, एक नमूने में प्राप्त डेटा कैंसर की हिज़्टीसीोलॉजी, इसकी द्रोह की डिग्री से मेल खाती है, और यह जीनोम स्तर पर होने वाले परिवर्तनों को दर्शाता है। ग्लियोमास में, इस अध्ययन में रुचि के कैंसर के प्रकार के रूप में, जीनोम में छिपी जानकारी विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि आनुवंशिक परीक्षणों के परिणामों के आधार पर एक व्यक्तिगत उपचार विकसित किया जाता है। विशेष उत्परिवर्तन कीमो या रेडियोथेरेपी के परिणामों के शकुन मार्कर हैं। जैसा कि यहां प्रदर्शित किया गया है, प्रस्तावित रणनीति के साथ दिए गए उत्परिवर्तन को दर्शाती बायोमार्कर का चयन संभव है। उत्परिवर्तन मार्कर, साथ ही अतिरिक्त वर्णनकर्ता प्रकार जैसे कि ट्यूमर के द्रोह की डिग्री का संकेत देते हैं, इसका उपयोग नियमित नैदानिक विधियों का समर्थन करने के लिए भी किया जा सकता है।
ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैकेशन फाइबर के उपयोग के साथ पूर्व वीवो रासायनिक बायोप्सी इंट्राऑपरेटिव डायग्नोस्टिक्स के लिए विधि के आवेदन में पहला कदम है। उचित नैतिक बोर्डों से अनुमति लंबित वीवो सैंपलिंग में विधि आसानी से अपनाई जा सकती है। ऐसे मामलों में, एसपीएमई उपकरणों की नसबंदी अस्पताल की स्वीकृत नसबंदी प्रक्रियाओं के अनुसार की जानी चाहिए, जहां नमूना लिया जाना है, यानी ऑटोक्लेविंग या एथिलीन ऑक्साइड नसबंदी। पूर्व वातानुकूलित और निष्फल फाइबर को नसबंदी समाप्ति तिथि के साथ लेबल किए गए सीलबंद पैकेजों में रखा जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फाइबर को सर्फेक्टेंट के उपयोग से साफ नहीं किया जाना चाहिए। इस तरह की प्रक्रिया शर्बत संरचना में अविशिष्ट परिवर्तन का कारण बन सकती है, इस प्रकार विश्लेषण की निकासी को प्रभावित कर सकती है। यहां वर्णित अध्ययनों में, 30 मिनट की निष्कर्षण अवधि का उपयोग किया गया था, लेकिन अन्य रिपोर्टें मान्य करती हैं कि कम समय में वीवो अध्ययन13में संतोषजनक परिणाम मिल सकते हैं। Huq एट अल. से पता चला है कि एनालिटे संतुलन समय ऊतक में तेजी से प्राप्त किया जाता है, एक जटिल मैट्रिक्स के रूप में, सरल मैट्रिस14की तुलना में । हालांकि, प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता को कम निष्कर्षण अवधियों के तहत समझौता किया जा सकता है क्योंकि पूर्व-संतुलन स्थितियों के तहत अधिक विश्लेषण निकाला जाएगा; इसलिए, सटीक समय नियंत्रण लागू किया जाना चाहिए ।
इस काम के हिस्से के रूप में शोषित दोनों ओमिक्स विज्ञान में बायोमार्कर डिस्कवरी टूल के रूप में उत्कृष्ट क्षमता है। एक बार बायोमार्कर का चयन हो जाने या एक केममेट्रिक मॉडल स्थापित हो जाता है, तो ऑन-साइट जांच के लिए लागू तरीकों के माध्यम से लक्ष्य मेटाबोलाइट्स के निर्धारण के आधार पर चिकित्सा निदान, जैसे कि इस काम में वर्णित एसपीएमई दृष्टिकोण, को नियमित निदान के हिस्से के रूप में विकसित और लागू किया जा सकता है।
वर्तमान पांडुलिपि में प्रस्तावित प्रोटोकॉल में बताया गया है कि संभावित बायोमार्कर की स्क्रीनिंग के लिए ठोस चरण माइक्रोएक्सट्रैक्शन का उपयोग करके कैंसर ऊतकों के अक्षकीकृत मेटाबोलॉमिक और लिपिडोमिक विश्लेषण कैसे करें। यह प्रतिनिधि यौगिकों के निष्कर्षण, ट्यूमर के भेदभाव, और भेदभावपूर्ण यौगिकों की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो किसी दिए गए कैंसर यानी संभावित बायोमार्कर की विशेषता है। इस लेख में वर्णित एसपीएमई के साथ अलक्षित विश्लेषण त्वरित इंट्राऑपरेटिव डायग्नोस्टिक्स के विकास में एक प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां नमूने में मौजूद सभी यौगिकों की स्क्रीनिंग की आवश्यकता के बिना यौगिकों का एक चयनित पैनल निर्धारित किया जा सकता है। तेजी से नैदानिक परिणामों के हित में, साइट पर निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली एसपीएमई जांच को सीधे अस्पताल की सुविधा में स्थित विश्लेषणात्मक इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ युग्मित किया जा सकता है। क्रोमेटोग्राफी-मुक्त विश्लेषण के बाद न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ किए गए सरल निष्कर्षकंरने वाले घंटों से कुछ मिनटों तक समग्र समय को काफी छोटा कर देंगे, जैसा कि पहले से ही दवा निगरानी15के लिए वर्णित है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को नेशनल साइंस सेंटर से ग्रांट हारमोनिया 2015/18/एम/एसटी4/00059 ने सपोर्ट किया । लेखक इस काम में उपयोग किए जाने वाले एसपीएमई उपकरणों को प्रदान करने के लिए मर्क केगा, डार्मस्टेड, जर्मनी के व्यवसाय मिलिपोरसिग्मा को स्वीकार करना चाहते हैं। मर्क का जीवन विज्ञान व्यवसाय अमेरिका और कनाडा में मिलिपोरसिग्मा के रूप में संचालित होता है। इसके अलावा, लेखकों को क्यू-Exactive फोकस ऑर्बिटरप मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयोग के लिए थर्मो फिशर वैज्ञानिक शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
लेखकों के योगदान: जेबी: नमूना तैयारी और एलसी-एमएस मापदंडों का अनुकूलन, एसपीएमई-एलसी-एमएस प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा विश्लेषण, सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा व्याख्या और लिपिडोमिक्स भाग से संबंधित पांडुलिपि तैयारी; पीजेडजी: अस्पताल में अधिकांश नमूने का समन्वय और प्रदर्शन, नमूना और नमूना तैयारी मापदंडों का अनुकूलन, एसपीएमई-एलसी-एमएस प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा विश्लेषण, सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा व्याख्या, मेटाबोलोमिक्स भाग से संबंधित पांडुलिपि तैयारी; एमजी - नमूना तैयारी, एलसी-एमएस विधि और लिपिडोमिक्स भाग से संबंधित डेटा विश्लेषण के अनुकूलन में सहायता; केजी: एसपीएमई नमूने का सह-प्रदर्शन और नमूना और नमूना तैयारी का अनुकूलन, मेटाबोलोमिक्स भाग से संबंधित एसपीएमई-एलसी-एमएस विश्लेषण; केसी: अस्पताल में कई एसपीएमई नमूने का प्रदर्शन, नमूने के अनुकूलन में सहायता, नमूना तैयार करना और मेटाबोलोमिक्स भाग से संबंधित डेटा विश्लेषण; केजे: अस्पताल में कई एसपीएमई नमूने का प्रदर्शन, लिपिडोमिक्स विश्लेषण में सहायता; डीपी: सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, रोगियों की भर्ती; JF: शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, रोगियों की भर्ती; एमएच: शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, अनुसंधान के नैदानिक भाग का समन्वय; बी बी: अवधारणा, परियोजना और पांडुलिपि तैयारी के समन्वय पर्यवेक्षण, कई नमूने के प्रदर्शन
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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