Summary
Manuskriptet præsenterer på stedet prøveudtagning af menneskelige hjernetumorer med solid fase mikroudtræk efterfulgt af deres biokemiske profilering mod opdagelsen af biomarkører.
Abstract
På trods af de mange forskellige værktøjer til rådighed for kræft diagnose og klassificering, metoder, der muliggør hurtig og enkel karakterisering af tumorer er stadig i nød. I de senere år er massespektrometri blevet en metode til valg for ikke-målrettet profilering af diskriminerende sammensatte som potentielle biomarkører for en sygdom. Biofluider anses generelt for at foretrække matricer på grund af deres tilgængelighed og lettere prøvebehandling, mens direkte vævsprofilering giver mere selektive oplysninger om en given kræftform. Fremstilling af væv til analyse ved hjælp af traditionelle metoder er langt mere kompleks og tidskrævende og derfor ikke egnet til hurtig analyse på stedet. Det nuværende arbejde præsenterer en protokol, der kombinerer prøveforberedelse og udvinding af små molekyler på stedet, umiddelbart efter tumorresektion. Prøvetagningsanordningen, som er på størrelse med en akupunkturnål, kan indsættes direkte i vævet og derefter transporteres til det nærliggende laboratorium til instrumental analyse. Resultaterne af metabolomics og lipidomics analyser viser evnen af tilgangen til etablering af fænotyper af tumorer relateret til den histologiske oprindelse af tumoren, malignitet, og genetiske mutationer, samt for udvælgelse af diskriminerende forbindelser eller potentielle biomarkører. Teknikkens ikke-destruktive karakter gør det muligt efterfølgende at udføre rutinemæssigt anvendte test, f.eks.
Introduction
Magnetic Resonance Imaging (MR) og Computertomografi (CT) er de vigtigste metoder, der anvendes til realtidsanalyse af hjernelæsioner. Brain tumor differentiering er generelt baseret på histopatologi med yderligere farvning og avancerede immunhisemiske teknikker. Ifølge den opdaterede vejledning om centralnerve hjernetumorer udstedt af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i 2016, genetiske tests er afgørende for differentiering og klassificering af disse tumorer1. Differentiering og klassificering af tumorer giver læger mulighed for at vælge den mest effektive behandling for en given type tumor og dermed udvide den forventede levetid for patienten. Desværre, på trods af tilgængeligheden af sådanne avancerede metoder til at hjælpe læger med at vælge en optimal behandling for deres patienter, den forventede levetid for patienter diagnosticeret med glioblastom (IV grade gliom) er kun omkring 15-16 måneder2. Selv med raffinement og øget nøjagtighed af de nævnte billeddannelse og histologiske metoder som diagnostiske værktøjer, er der stadig et stort behov for nye teknikker i stand til at tilbyde supplerende oplysninger til støtte læger i beslutninger om behandlingsforløb. I løbet af de seneste år er der foreslået flere nye tilgange baseret på massespektrometri til intraoperativ analyse af kræft3,4. Potentialet i fast fase mikroekstræk (SPME), den metode, der præsenteres heri, som en hurtig on-site analyse værktøj, er allerede blevet påvist i en række undersøgelser5. Det nuværende manuskript viser en af de kliniske anvendelser af metoden, ikke-målrettede metabolomics og lipidomics af menneskelige hjernetumorer. Ikke-målrettede undersøgelser udgør et vigtigt udgangspunkt for opdagelsen af potentielle biomarkører. Når det er etableret, sådanne biomarkører kan derefter bruges som diagnostiske referencer til at differentiere blandt tumorer ved hjælp af den samme teknologi koblet til on-site instrumentering.
SPME er en ligevægtsbaseret prøveforberedelsesteknik, der udtrækker små molekyler fra prøvemaskræces med anvendelse af små mængder ekstraktionsfase. I SPME's mest traditionelle konfiguration af enheden (sonde), en fiber er belagt med en passende ekstraktion fase og immobiliseret på en solid støtte, dvs en metaltråd5,6. Biokomplicible belægninger og anordninger (sonder) muliggør ekstraktion direkte fra komplekse biologiske matricer uden prøveforbehandling, f.eks. Gennem ekstraktionsprocessen opdeles analytter mellem ekstraktionsfasen og prøvematrixen i forhold til deres oprindelige koncentrationer. Hvis ekstraktionen udføres længe nok, opnås ligevægten. Mens udvinding ved ligevægt giver den højest mulige følsomhed og reproducerbarhed, er det også muligt at foretage forligevægtsekstraktion og endda i nogle tilfælde at foretrække, dvs. Ekstraktionstidsprofilen for en given analysand påvirkes generelt af analysandens fysisk-kemiske egenskaber, den matrix, der udtages prøver af, den anvendte type sorbent og flere andre ekstraktionsbetingelser. Den overflod af faktorer, der styrer deres ekstraktion kinetik gør det praktisk umuligt at sikre ligevægt ekstraktion af alle forbindelser, når ikke-målrettede analyser såsom metabolomik eller lipidomics udføres. Af ovennævnte grunde blev udvindingstiden for den nuværende protokol fastsat vilkårligt for at sikre tilfredsstillende følsomhed og dækning af metabolitter på den ene side og praktisk anvendelighed på stedet på den anden side.
Det skal understreges, at den meget lille størrelse af sonder, der anvendes til ekstraktion af prøver fra væv, kun forårsager minimale vævsskader, mens prøveudtagningsproceduren i sig selv ikke indtager væv, men meget små mængder små molekyler fra det afprøvede område; Den samme prøve kan derfor anvendes yderligere til rutinemæssige test, dvs. Sådanne komplementære, omfattende data vil muliggøre en bedre forståelse af tumor biologi, forhåbentlig lette opdagelsen af nye behandlingsmål. Udnyttelse af denne metode øger yderligere muligheden for intraoperativ diagnostik på stedet ved bestemmelse af målbiomarkører.
Nedenfor præsenterer vi protokoller for prøveudtagning af hjernetumorer på stedet for metabolomics og lipidomics analyser og databehandling.
Protocol
Undersøgelsen, der præsenteres heri, blev godkendt af Bioethics Committee of Collegium Medicum i Bydgoszcz ved Nicolaus Copernicus University i Toruń (KB 628/2015). Husk altid at bære en laboratoriekittel og andet nødvendigt personligt sikkerhedsudstyr, såsom (men ikke begrænset til) sikkerhedshandsker og briller. Rør ikke ved ekstraktionsfasen af spme-sonderne (solid phase microextraction).
1. Klargøring af SPME-anordningerne
- Brug sonder (fibre) med blandet tilstand og C18 belægninger til metabolomik og lipidomics, henholdsvis. Indsamle to sæt prøver, en for metabolomics og en for lipidomics.
- Juster sondens belægning optimalt ved at trimme SPME-sonden. I den aktuelle undersøgelse var den valgte belægningslængde 7 mm. Vælg længden af fiberen i henhold til størrelsen af den tumor, der undersøges, og sørg for, at hele sorbent kan nedsænkes i tumoren (Figur 1).
- Tilstand belægninger af sonderne ved iblødsætning dem i methanol: vand 50:50 v/v blanding i en periode på mindst 1 h før ekstraktionsproceduren. Transportfibre til prøveudtagningsstedet (f.eks. hospital) i et hætteglas, der indeholder konditioneringsopløsningen.
2. Procedure for indsamling af prøver
- Tumoren må ikke vaskes eller forbehandles på nogen måde før SPME-ekstraktion.
- Start prøveudtagningen så hurtigt som muligt efter tumorfjernelsen (2 min i den præsenterede undersøgelse).
BEMÆRK: Juster tiden afhængigt af opsætningen på stedet for en given facilitet (afstand mellem forskerens arbejdsplads fra operationsbordet), og hold den konstant for hele undersøgelsen. Minimering af den forløbne tid mellem tumor fjernelse og starten af ekstraktionen er afgørende for tilfangetagelsen af ustabile metabolitter, der nedbrydes efter blodcirkulationen er afskåret fra det undersøgte væv. - Udtagning prøveudtagning ved stuetemperatur. Alternativt anbringes prøven på is, når udvindingen udføres. I begge tilfælde opretholdes de samme betingelser for hele prøvesættet.
- Tag sonden ud af hætteglasset.
- Vask fibre med flydende kromatografi-massespektrometri (LC / MS) grade vand i 5 s ved nedsænkning dem i LC / MS grade vand. Lad ikke sorbent tørre før fiberindsættelse for at sikre god reproducerbarhed af data.
- Indsæt fibrene i hjernetumorvævet så langt fra hinanden som muligt, hvilket sikrer, at hele ekstraktionsfasen er placeret inde i tumoren.
BEMÆRK: Det anbefales, at ekstraktioner udføres i replikat for at bestemme den heterogene karakter af tumoren (Figur 2). Der anbefales tre replikater pr. prøve. - Lad sonden være i 30 minutter i vævet (målt med en timer).
- Brug tomme kontroller til at fjerne fejlkilder relateret til tilstedeværelsen af artefakter stammer fra andre kilder end den samplede tumor. For at opnå blind kontrol, emne fibre til samme analytiske arbejdsgang, som beskrevet ovenfor, men uden prøveudtagning trin (indsættelse i vævet eller enhver anden prøve / matrix). I databehandlingstrinnet skal analysanderne, der udvindes af disse fibre, samles i en "udelukkelsesliste" for at udelukke signaler, der stammer fra forurenende stoffer, der stammer fra opløsningsmidler eller fiberproduktion. Det anbefales, at der anvendes mindst 3 replikerer blank.
BEMÆRK: For at kontrollere risikoen for kontaminering er det nødvendigt at udtage prøver fra handsker, borde, apparater eller andre overflader, der kan udgøre en kontamineringsrisiko. I sådanne tilfælde fiber forberedelse, tidspunktet for ekstraktion, og desorption protokoller er de samme som for prøverne. - Mens der udføres ekstraktion, skal hætteglassene mærkes til opbevaring af sonderne efter ekstraktion.
- Efter 30 min, fjerne fibre (e) fra hjernetumor.
- Vask fibre med vand i 3 s ved at nedsænke dem i LC / MS grade vand for at fjerne rester af blod eller celle affald fra sonden, så det endelige ekstrakt indeholder kun små molekyler. En længere vask trin anbefales ikke, da det kan føre til tab af polære forbindelser.
- Immobilisere fibrene i den pre-slids septa af højtydende flydende kromatografi (HPLC) hætte ved piercing septa fra bunden med den ikke-belagte ende af fiberen.
- Læg fibrene immobiliseret i hætten i separate HPLC hætteglas og læg dem i den valgte transportbeholder.
- Udfør trin 2.11-2.13 for fibre dedikeret til tomme kontroller.
3. Transport og opbevaring
BEMÆRK: Der er flere muligheder for transport af prøver til laboratoriet. Det anbefales, at der anvendes en flydende nitrogen dewar eller polystyrenkasse fyldt med tøris til transport; Alternativt kan isposer bruges til øjeblikkelig og hurtig transport.
- Læg hætteglassene med fibre i transportbeholderen.
- Ved laboratorieankomst skal hætteglas med SPME-fibre straks i en -80 °C eller -30 °C fryser. Fibre må ikke opbevares længere end 3 år ved -30 °C eller 5 år ved -80 °C.
4. Prøvepræparat til metabolomikanalyse
BEMÆRK: Dette trin bør først udføres, når alle prøver til et eksperiment er blevet indsamlet.
- Før instrumental analyse, forberede desorption opløsningsmiddel blanding: acetonitrile:vand 80:20 v/v.
- Tag hætteglassene ud, der indeholder fibre i blandet tilstand fra fryseren. Brug disse til metabolomik analyse.
- Etikethætteglas, der skal anvendes til desorption.
- Pipette 300 μL af desorptionsopløsningen (fremstillet i trin 4.1) i glasindsatser, der er anbragt i 2 ml hætteglas.
- Udfør desorption fra hver fiber placeret i en separat indsats ved fuldt nedsænkning belægningen i desorption opløsningsmiddel, derefter omgitere det i 120 min ved 1.200 rpm ved hjælp af vortex.
- Efter 120 min (når desorption er afsluttet) fjerne hætter med sonder.
- QC-prøven tilberedes ved at blande 10 μL-prøver af hver prøve fra prøvesættet. Stikprøvens størrelse afhænger af det eksperimentelle design. Det er vigtigt at analysere alle prøver som et parti.
- Luk hætteglassene med nye hætter.
- Hætteglassene i autosampleren (4 °C) i væskekromatografien massespektrometer (LC-HRMS) og gå til trin 5.
BEMÆRK: Randomisere injektioner rækkefølge af prøverne, herunder kontrol emner. Injicer QC-prøven efter hver 8-10 prøver for at overvåge instrumentets stabilitet.
5. Metabolomics analyse ved hjælp af omvendt fase flydende kromatografi og høj opløsning massespektrometer (RPLC-HRMS analyse)
- Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den positive ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i positiv tilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 80-1000; beslutning 70 000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 1,5 kV; S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: 25 V; skimmer spænding: 15 V; kapillær temperatur: 300 °C; kappesgas: 40 a.u. aux gas: 15 a.u. aux gasvarmer temperatur: 300 °C. Denne kromatografiske metode blev tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injektionsvolumen: 10 μL. - Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den negative ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der anvendes i den aktuelle undersøgelse i negativ tilstand: scanningsområde: m/z 80-1000; beslutning 70 000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 2,5 kV; S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: -25 V; skummerspænding: -15 V; kapillær temperatur: 256 °C kappegas: 48 a.u; aux gas: 11 a.u. aux gasvarmer temperatur: 413 °C. Denne kromatografiske metode blev vedtaget fra Vuckovic et al.7. Injektionsvolumen: 10 μL. - Kalibrer instrumentet som anbefalet af producenten.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev instrumentet kalibreret ved hjælp af ekstern kalibrering hver 48 timer, hvilket resulterede i en massenøjagtighed <2 ppm. - Start analysen ved at klikke på knappen Start i den software, der driver instrumentet.
- Når analysen er færdig, skal du erstatte kolonnen RPLC med HILIC-kolonnen, ændre de mobile faser og gå til trin 6.
6. Metabolomics analyse ved hjælp af hydrofile interaktion flydende kromatografi og høj opløsning massespektrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den positive ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i positiv tilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 80-1000; beslutning 70 000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 1,5 kV; S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: 25 V; skimmer spænding: 15 V; kappesgas: 60 a.u. aux gas: 40 a.u. aux gasvarmer temperatur: 425 °C; kapillær temperatur: 325 °C. Kromatografisk metode blev tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injektionsvolumen: 10 μL. - Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den negative ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i negativ tilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 80-1000; beslutning 70 000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 1,3 kV; S-linse RF-niveau: 55%.; S-linse spænding: -25 V; skummerspænding: -15 V; kapillær temperatur: 263 °C; kappesgas: 60 a.u. aux gas: 30 a.u. aux gasvarmer temperatur: 425 °C. Kromatografisk metode blev tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injektionsvolumen: 10 μL. - Kalibrer instrumentet som anbefalet af producenten.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev instrumentet kalibreret ved hjælp af ekstern kalibrering hver 48 timer, hvilket resulterede i en massenøjagtighed <2 ppm. - Start analysen ved at klikke på knappen Start i den software, der driver instrumentet.
7. Prøvepræparat til lipidomics-analyse
BEMÆRK: Dette trin bør først udføres, når alle prøver til forsøget er indsamlet.
- Før analysen påbegyndes, skal desorptionsopløsningsopløsningsblandingen forberedes: isopropanol:methanol 50:50 v/v.
- Tag hætteglassene med C18 fibre dedikeret til lipidomics analyse fra fryseren.
- Etikethætteglas, der skal anvendes til desorption.
- Der pipettes 200 μL af desorptionsopløsningen (fremstillet i trin 7.1) til silaniserede glasindsatser, der er anbragt i 2 ml hætteglas.
BEMÆRK: Ikke-silaniserede skær kan også anvendes, men deres anvendelse kan resultere i dårlig reproducerbarhed af forbindelser med høj logP, da sådanne forbindelser ikke specifikt kan knytte til glasvægge. - Udfør desorption fra hver fiber i et separat skær ved fuldt nedsænkning belægningen i desorption opløsningsmiddel, derefter omgitere det i 60 min ved 1.200 rpm ved hjælp af vortex.
- Efter 60 min, når desorption er afsluttet fjerne hætter med sonder.
- QC-prøven tilberedes ved at blande 10 μL-prøver af hver prøve fra prøvesættet. Stikprøvens størrelse afhænger af det eksperimentelle design. Det er vigtigt at analysere alle prøver som et parti.
- Luk hætteglassene med nye hætter.
- Hætteglassene i autosampleren (4 °C) i væskekromatografien massespektrometer med høj opløsning (LC-HRMS) og gå til trin 8.
8. Lipidomics analyse ved hjælp af omvendt fase flydende kromatografi og høj opløsning massespektrometri (RPLC-HRMS analyse)
- Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den positive ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i positiv iontilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 100-1000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 3,5 kV, S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: 25 V; skimmer spænding: 15 V; kapillær temperatur 275 °C kappesgas: 30 a.u. aux gas: 10 a.u. ekstra gas: 2 a.u. sondevarmeren temperatur 300 °C. De anvendte LC-parametre var: fase A: methanol:vand, 40:60 med 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddikesyre; fase B: isopropanol:methanol, 90:10 med 10mM ammoniumacetat og 1 mM eddikesyre. hældningen: 0 min – 20% B; 1,0 min - 20% B; 1,5 min - 50% B; 7,5 min - 70% B; 13,0 min - 95% B; 17,0 min - 95% B; 17,1 min - 95,5 % B; 23,0 min – STOP; C18 Kolonne, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; flow: 0,2 ml/min. ovntemperatur: 55 °C; injektionsvolumen: 10 μL. - Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den negative ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse, var som følger: HRMS-parametre for negativ iontilstand: scanningsområde: m/z 100-1000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) indsprøjte tid til C-fælde: auto; sprøjtespænding: 3,5 kV, S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: -25 V; skummerspænding: -15 V; kapillær temperatur 275 °C kappesgas: 30 a.u; aux gas: 10 a.u. ekstra gas: 2 a.u; sondevarmeren temperatur 300 °C. Kromatografisk metode: samme som i 8.1. - Kalibrer instrumentet som anbefalet af producenten.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev instrumentet kalibreret ved hjælp af ekstern kalibrering hver 48 timer, hvilket resulterede i en massenøjagtighed <2 ppm. - Start analysen ved at klikke på knappen Start i den software, der driver dit instrument.
- Når analysen er afsluttet, skal du erstatte kolonnen RPLC med HILIC-kolonnen, ændre de mobile faser og gå til trin 9.
9. Lipidomics analyse ved hjælp af hydrofil interaktion flydende kromatografi og høj opløsning massespektrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den positive ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i positiv iontilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 100-1000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) sprøjtespænding: 1,5 kV; S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: 25 V; skimmer spænding: 15 V; kapillær temperatur 325 °C kappesgas: 60 a.u. aux gas: 30 a.u. ekstra gas: 2 a.u. sondevarmertemperatur 320 °C. anvendte LC-parametre var: fase A: 5 mM ammoniumacetat i vand; fase B: acetonitrile; hældningen: 0 – 2min – 4% B; 15.0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOP; 3 μm 100 mm x 2,1 mm kolonne flow: 0,4 ml/min. ovntemperatur: 40 °C; injektionsvolumen: 10 μL. - Konfigurer parametrene for LC-HRMS-analysen og den negative ioniseringstilstand.
BEMÆRK: De parametre, der blev anvendt i den aktuelle undersøgelse i negativ iontilstand, var som følger: scanningsområde: m/z 80-1000; erhvervelse udført ved hjælp af AGC (1.000.000 ioner) sprøjtespænding: 1,5 kV, S-linse RF-niveau: 55%; S-linse spænding: -25 V; skummerspænding: -15 V; kapillær temperatur 320 °C kappesgas: 50 a.u. aux gas: 21 a.u. ekstra gas: 3 a.u. sondevarmeren temperatur 320 °C. Den kromatografiske metode var den samme som beskrevet i 9.1. - Kalibrer instrumentet som anbefalet af producenten.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev instrumentet kalibreret ved hjælp af ekstern kalibrering hver 48 timer, hvilket resulterede i en massenøjagtighed <2 ppm. - Start analysen ved at klikke på knappen Start i den software, der driver instrumentet.
10. Databehandling og statistisk analyse
- Betak data ved hjælp af software, der er kompatibel med formatet af de rå datafiler.
- Udfør statistisk analyse ved hjælp af de behandlede data.
BEMÆRK: Testtypen afhænger af den videnskabelige hypotese og udformningen af undersøgelsen. I den aktuelle undersøgelse blev der anvendt hovedkomponentanalyse, delvis-mindst kvadratisk diskriminant analyse og envejs ANOVA.
Representative Results
Udnyttelse af fast fase microextraction som en prøve forberedelse metode i kombination med flydende kromatografi koblet til høj opløsning massespektrometri og en avanceret databehandling software tillod os at kunne karakterisere metabolom og lipidome af menneskelige hjernetumorer. Sonden, hvis størrelse svarede til en akupunkturnål, forårsagede minimal skade på det undersøgte væv og intet vævsforbrug, hvilket gjorde det muligt at anvende prøver yderligere til histologiske eller genetiske undersøgelser. Der blev opnået tilfredsstillende adskillelse af de udvalgte grupper for både omvendte fase- og HILIC-kolonner og for både ioniseringstilstande i metabolomics- og lipidomics-analyser. Brugen af begge separationsmetoder ikke kun i metabolomics, men også i lipidomics analyse forudsat værdifulde supplerende data. Den omvendte fase kolonne separate lipider med hensyn til deres kulstofkæder længde og tilstedeværelsen af umættede obligationer, mens HILIC kolonne er nyttig til profilering lipid grupper, især fosfolipider8.
Reproducerbarheden af den instrumentale analyse viste sig at være meget god baseret på den tætte klyngedannelse af QC-prøver på hovedkomponentanalyseplottet (figur 3A, de tre QC-prøver injiceres hver ottende patients prøver langs sekvensoverlapningen). Desuden blev det konstateret, at udvindingsdudsedler, der blev anvendt til negativ kontrolanalyse, adskilte sig godt fra de virkelige prøver. Den brede vifte af analysander udvundet af sonderne lettet opdagelsen af repræsentative arter, således med held giver mulighed for differentiering mellem menneskelige hjernetumorer baseret på deres histologiske oprindelse, malignitet, og andre faktorer (f.eks genetiske). Figur 3B viser lipidomics-data for prøver indsamlet fra patienter med gliomer og meningiomer. Aktivering differentiering mellem disse tumorer, som var karakteriseret ved forskellige histologiske oprindelse og malignitet, var et vigtigt mål i undersøgelsen, som meningiomer er generelt betragtes som godartede tumorer, mens gliomer er en af de mest ondartede. I figur 4, der viser metabolomikdata, blev gliomer desuden opdelt på grundlag af deres malignitetsgrad i høj og lav. Disse undergrupper blev sammenlignet med den molekylære fænotype af meningiomer. I begge tilfælde blev der observeret en fremtrædende adskillelse af klynger. I dag, diagnostik af gliom primært er afhængig af bestemmelse af specifikke genetiske mutationer i tumorprøver. Derfor blev de opnåede resultater sammenlignet med genotypedata. Figur 5A viser adskillelse af prøverne med detekteret samtidig sletning 1p19q og prøver, hvor mutationen ikke blev observeret.
Statistisk analyse gør det også muligt at vælge forbindelser i de undersøgte grupper. Disse forbindelser kan betragtes som potentielle biomarkører i tilfælde, hvor der udtages prøver af en passende stor kohorte. Der kræves imidlertid en mere dybtgående analyse, herunder afgørende bekræftelse af påviste forbindelser ved fragmentering og sammenligning af påviste arter med analytiske standarder, for at drage endelige konklusioner af biologisk art. Eksempler på sådanne diskriminerende metabolitter er præsenteret i figur 3C og figur 5B. Identiteten af disse forbindelser, dvs.
Figur 1: SPME fibre forberedt til ekstraktionsprocessen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udvinding af meningiom ved hjælp af SPME-sonder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: PCA og kasseplots for gliom og meningiom. Analyseområde for hovedkomponent, der indeholder (A) alle analyserede prøver, herunder blindprøver, ekstraktion QC, emner, meningiomer, gliomer; b) kun indeholder undersøgte grupper (efter udelukkelse af emner og QC) (C) box whisker plot for sphingomielyn: SM d36:1 differentiere patienten med gliom og meningiom. Lipidomics data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: PCA for HGG, LGG og meningiom. Analyseområde for hovedkomponenter, der viser differentiering mellem (A) højkvalitets gliomer (HGG) og meningiomer (MEN)9 og (B) gliomer (LGG) og meningiomer af lav kvalitet. Metabolomics data genoptrykt fra Via Medica ref9 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: PCA og kasseområder for gliom med og uden sletning. (A)Hovedkomponentanalyseplottet viste forskelle hos patienter med og uden samtidig sletning 1p19q; b) kasse whisker parceller til proline differentierede patienter med og uden co-sletning 1p19q; n-uden sletning, y-med sletning. Metabolomics data Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Untargeted metabolomics og lipidomics er almindeligt anvendt i undersøgelser fokuseret på at identificere tumor biomarkører. Men, i de fleste tilfælde, forskere kigge efter forbindelser, der kan bruges til screening af sygdommen. Derfor er de foretrukne biologiske prøver blod eller urin på grund af deres relativt let adgang. Analyse af tumorvæv er hovedsageligt udføres for at forstå mekanismerne bag sygdommen, karakterisere forskellige tumortyper, osv. On-site analyse af tumor biomarkører er sjældent udføres, da sådanne anvendelser kræver omfattende prøve forberedelse. Alternativt, strategier baseret på real-time analyse af vævsprofiler uden forudgående udvælgelse af specifikke biomarkører tjener opmærksomhed fra den medicinske samfund3,4. Løsningen præsenteres heri giver et andet perspektiv på vævsbehandling på stedet ved at afsløre den type oplysninger, der kan fås via sådanne metoder.
Kombinationen af prøveudtagning, prøvepræparat og ekstraktion gør SPME til et meget nyttigt redskab til analyse på stedet. Desuden gør manglende vævsforbrug under prøveudtagningen det muligt at anvende de samme prøver yderligere til biomarkøranalyse og rutinetest (genotypebestemmelse, histologisk analyse), hvor der derfor tilføjes nye oplysninger til resultaterne af standardtesten. Prøvetagningsenheden har et meget enkelt design, dens funktion er meget let, og ingen særlig uddannelse er nødvendig for at udføre selve udvindingen. Men at opnå pålidelige resultater kræver meget mere end blot korrekt håndtering af enheder. For at udføre eksperimentet korrekt skal man forstå udvindingsprocessen, prøvens art og være opmærksom på potentielle fejl, der kan påvirke dataene.
Det er vigtigt at overveje heterogeniteten af kræftvæv10; tumorer, der er udtaget prøver af, kan indeholde dele, der gennemgår nekrose, forkalkning og hypoxi, og hver af disse processer vil blive afspejlet i metabolome og lipidome opnået, hvilket påvirker resultaterne. Derfor anbefales det, at rumlig opløsning prøveudtagning udføres ved indsættelse af flere fibre i forskellige dele af kræftvæv, eller alternativt, at en længere belægning skal anvendes til at trænge ind i hele tumoren for at opnå gennemsnitsoplysninger om tumoren. Hvis den rumlige opløsning prøvetagningsmetode udføres, kan fibrene alle desorberes i ét desorptionsopløsningsmiddel; Dette ville ikke kun give mulighed for opnåelse af generelle oplysninger om tumoren, men også øge følsomheden af analysen. Alternativt, desorption af de enkelte fibre i separate hætteglas ville gøre det muligt for undersøgelser at finde ud af den interne mangfoldighed af hjernetumor, som består af kernen bygget af kræftceller, og den ydre zone, som er grænsen for sundt væv. Dybere dele af tumoren er normalt mere beskadiget af de processer, relateret til kræft11. Men, efterforskere skal huske på, at denne mulighed kompromitterer metode følsomhed og det samlede antal påviselige forbindelser. I det nuværende arbejde blev der anvendt en 7 mm belægning; denne længde blev anset for optimal for forskellige størrelser af tumorer inkluderet i undersøgelsen. Belægningerne trængte ind i tumorer, og dermed forudsat ikke-særlig opløsning, men gennemsnit data på tværs af prøven. Uanset den valgte protokol, er det vigtigt, at den samme protokol følges under hele undersøgelsen, herunder antallet af fibre, der anvendes til individuel prøveudtagning, længden af belægningen, udvindingstid, og alle andre faktorer afgrænset i dette arbejde.
Det er vigtigt at kontrollere kvaliteten af analysen. Den samlede QC (se trin 4.7 og 7.7 i protokollen) skal fremstilles og anvendes til overvågning af instrumentets stabilitet under hele prøvebatchen. De tomme kontroller (se trin 2.8) kan senere bruges til at udarbejde en "udelukkelse liste" for at fjerne signaler af forurenende stoffer stammer fra opløsningsmidler eller fiber fremstilling. Ved særlige lejligheder, såsom risiko for kontaminering, er det nødvendigt at udtage prøver fra handsker, borde, apparater eller andre overflader, der kan udgøre en forureningsrisiko. I sådanne tilfælde, fiber forberedelse, tidspunktet for udvinding og desorption protokoller er de samme som for prøverne.
Metabolomic og lipidomic analyser er fokuseret udelukkende på små molekyler (mindre end 1.500 Da) optræder i en organisme eller specifikke komponenter i organismen, såsom specifikke organer, væv, væsker, celler, osv. Metabolomic og lipidomics tilbyder et øjebliksbillede af biokemiske ændringer, der forekommer i kroppen, og i tilfælde af kræft, de integrerer oplysninger relateret til genom, histologi, og malignitet af tumoren. Disse omics videnskaber skabe en sammenhæng mellem fysiologi og fænotype som metabolitter er højere oppe i den biokemiske stigen end proteiner eller gener12. Ved at forstå metabolom og lipidome af kræfttumorer, kommer vi tættere på at opdage fænotype blandt alle-omics videnskaber som disse grene af undersøgelsen tilbyder mere dybtgående viden om dynamiske ændringer af molekyler som en reaktion af levende organismer til forskellige stimuli. Som præsenteret i dette arbejde svarer de data, der er indhentet i en stikprøve, til kræftens histologi, dens grad af malignitet, og den afspejler ændringer, der sker på genomniveau. I gliomer, som den type kræft af interesse i denne undersøgelse, de oplysninger, der er skjult i genomet er særligt vigtigt, som en personlig behandling er udviklet baseret på resultaterne af genetiske tests. Særlige mutationer er prognostiske markører for resultaterne af kemo- eller strålebehandling. Som det fremgår her, er det muligt at vælge biomarkører, der afspejler en given mutation, med den foreslåede strategi. Mutation markører, samt yderligere beskrivelser typer som dem, der angiver graden af malignitet af tumoren kan også bruges til at støtte rutinemæssige diagnostiske metoder.
Ex vivo kemisk biopsi med brug af faste fase mikroekstræk fibre er det første skridt i anvendelsen af metoden til intraoperativ diagnostik. Metoden kan let anvendes til in vivo-prøvetagning, indtil der gives tilladelse fra relevante etiske råd. I sådanne tilfælde skal sterilisering af SPME-anordninger udføres i overensstemmelse med de godkendte sterilisationsprocedurer på det hospital, hvor der skal udtages prøver, dvs. De for konditionerede og steriliserede fibre skal opbevares i forseglede pakninger mærket med en sterilisationsudløbsdato. Det er vigtigt at bemærke, at fibre ikke bør rengøres med brug af overfladeaktive stoffer. En sådan procedure kan forårsage uspecifik ændringer i sorbent sammensætning, hvilket påvirker udvinding af analysand. I de undersøgelser, der er beskrevet heri, blev der anvendt en 30 min ekstraktionsperiode, men andre rapporter validerer, at kortere tider kan give tilfredsstillende resultater i in vivo-undersøgelser 13. Huq et al. viste, at analysand ligevægt tid opnås hurtigere i væv, som en kompleks matrix, end i simple matricer14. Reproducerbarheden af de opnåede resultater kan dog bringes i fare under kortere ekstraktionsperioder, da flere analysander vil blive udvundet under betingelser forud for ligevægten. derfor skal der gennemføres præcis tidskontrol.
Begge omics videnskaber udnyttes som en del af dette arbejde har fremragende potentiale som biomarkør opdagelse værktøjer. Når biomarkører er valgt, eller der er etableret en kemometrisk model, kan medicinsk diagnostik baseret på bestemmelse af målmetabolitter ved hjælp af metoder, der gælder for undersøgelser på stedet, såsom SPME-tilgangen, der er beskrevet i dette arbejde, udvikles og implementeres som en del af rutinemæssig diagnostik.
Den protokol, der foreslås i dette manuskript, beskriver, hvordan man udfører ikke-målrettede metabolomiske og lipidomic analyser af kræftvæv ved hjælp af fast fase mikroekstraktion til screening af potentielle biomarkører. Det er designet til at muliggøre udvinding af repræsentative forbindelser, differentiering af tumorer, og identifikation af diskriminerende forbindelser, der karakteriserer en given kræft, dvs potentielle biomarkører. De ikke-målrettede analyser med SPME, der er beskrevet i denne artikel, udgør et udgangspunkt i udviklingen af hurtig intraoperativ diagnostik, hvor et udvalgt panel af forbindelser kan bestemmes, uden at det er nødvendigt at screene alle forbindelser i prøven. Af hensyn til hurtige diagnostiske resultater kan SPME-sonder, der anvendes til udvinding på stedet, kobles direkte til analytisk instrumentering på hospitalet. Simple ekstraktioner udført med minimal prøvepræparat efterfulgt af kromatografifri analyse vil forkorte den samlede tid betydeligt fra timer til et par minutter, som allerede beskrevet for lægemiddelovervågning15.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af tilskud Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 fra Det Nationale Videnskabscenter. Forfatterne vil gerne anerkende MilliporeSigma, en virksomhed af Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, for at levere SPME-enheder, der anvendes i dette arbejde. Mercks life science-virksomhed fungerer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne vil gerne takke Thermo Fisher Scientific for adgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer.
Forfatternes bidrag: JB: optimering af prøveforberedelses- og LC-MS-parametre, udførelse af SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datafortolkning og forberedelse af manuskripter i forbindelse med lipidomics-del; PZG: koordinering og udførelse af størstedelen af prøverne på hospitalet, optimering af stikprøve- og prøveforberedelsesparametre, udførelse af SPME-LC-MS-forsøg, dataanalyse, statistisk analyse og datafortolkning, manuskriptforberedelse i forbindelse med metaabolomicsdel MG – bistand til optimering af prøveforberedelse, LC-MS-metode og dataanalyse relateret til lipidomics del; KG: sampræst til fælles ydeevne af SPME-prøver og optimering af prøveudtagning og prøvepræparat, SPME-LC-MS-analyse vedrørende metabolomikdel KC: udførelse af flere SPME-prøver på hospitalet, bistand til optimering af prøveudtagning, prøveforberedelse og dataanalyse vedrørende metabolomikdel KJ: udførelse af flere SPME prøver på hospitalet, bistand i lipidomics analyse; DP: udførelse af kirurgiske procedurer, rekruttering af patienter; JF: udførelse af kirurgiske procedurer, rekruttering af patienter; MH: udførelse af kirurgiske procedurer, koordinering af klinisk del af forskningen; BB: koncept, koordineringstilsyn med projektet og forberedelse af manuskripter, udførelse af flere stikprøver
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
