Summary
Le manuscrit présente l’échantillonnage sur place des tumeurs cérébrales humaines avec microextraction de phase solide suivie de leur profilage biochimique vers la découverte de biomarqueurs.
Abstract
Malgré la variété des outils disponibles pour le diagnostic et la classification du cancer, les méthodes qui permettent une caractérisation rapide et simple des tumeurs sont toujours dans le besoin. Ces dernières années, la spectrométrie de masse est devenue une méthode de choix pour le profilage non ciblé des composés discriminatoires en tant que biomarqueurs potentiels d’une maladie. Les biofluides sont généralement considérés comme des matrices préférables étant donné leur accessibilité et leur traitement plus facile de l’échantillon, tandis que le profilage direct des tissus fournit des renseignements plus sélectifs sur un cancer donné. La préparation des tissus pour l’analyse par des méthodes traditionnelles est beaucoup plus complexe et prend beaucoup de temps, et, par conséquent, ne convient pas à une analyse rapide sur place. Les travaux actuels présentent un protocole combinant la préparation d’échantillons et l’extraction de petites molécules sur place, immédiatement après la résection tumorale. Le dispositif d’échantillonnage, qui est de la taille d’une aiguille d’acupuncture, peut être inséré directement dans le tissu, puis transporté au laboratoire voisin pour analyse instrumentale. Les résultats des analyses métabolomiques et lipidomiques démontrent la capacité de l’approche pour l’établissement des phénotypes des tumeurs liées à l’origine histologique de la tumeur, de la malignité, et des mutations génétiques, aussi bien que pour la sélection des composés discriminants ou des biomarqueurs potentiels. La nature non destructive de la technique permet l’exécution ultérieure de tests couramment utilisés, par exemple des tests histologiques, sur les mêmes échantillons utilisés pour l’analyse SPME, permettant ainsi la réalisation d’informations plus complètes à l’appui de diagnostics personnalisés.
Introduction
L’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la tomographie calculée (Tomodensitométrie) sont les principales méthodes utilisées pour l’analyse en temps réel des lésions cérébrales. La différenciation de tumeur de cerveau est généralement basée sur l’histopathologie avec la coloration additionneuse et les techniques immunohistochemical avancées. Selon les directives actualisées sur les tumeurs cérébrales nerveuses centrales publiées par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) en 2016, les tests génétiques sont cruciaux pour la différenciation et la classification de ces tumeurs1. La différenciation et la classification des tumeurs permettent aux médecins de choisir le traitement le plus efficace pour un type donné de tumeur augmentant ainsi l’espérance de vie du patient. Malheureusement, malgré la disponibilité de ces méthodes avancées pour aider les médecins à choisir une thérapie optimale pour leurs patients, l’espérance de vie des patients diagnostiqués avec le glioblastome (gliome de catégorie IV) est seulement d’environ 15-16 mois2. Même avec la sophistication et la précision accrue de la dite imagerie et les méthodes histologiques comme outils de diagnostic, il ya encore un grand besoin de nouvelles techniques capables d’offrir des informations complémentaires pour aider les médecins dans les décisions concernant le cours du traitement. Au cours des dernières années, plusieurs nouvelles approches basées sur la spectrométrie de masse ont été proposées pour l’analyse peropératoire du cancer3,4. Le potentiel de microextraction de phase solide (SPME), la méthode présentée ci-après, comme un outil rapide d’analyse sur place, a déjà été démontré dans une variété d’études5. Le manuscrit actuel montre l’une des applications cliniques de la méthode, métabolomique non ciblé et lipidomics des tumeurs cérébrales humaines. Les enquêtes non menées présentent un point de départ important dans la découverte de biomarqueurs potentiels. Une fois établis, ces biomarqueurs peuvent ensuite être utilisés comme références diagnostiques pour différencier entre les tumeurs en utilisant la même technologie couplée à l’instrumentation sur place.
SPME est une technique de préparation d’échantillons basée sur l’équilibre qui extrait de petites molécules de matrices d’échantillons avec l’utilisation de petites quantités de phase d’extraction. Dans la configuration la plus traditionnelle de l’appareil (sonde) du SPME, une fibre est recouverte d’une phase d’extraction appropriée et immobilisée sur un support solide, c’est-à-dire un filmétallique 5,6. Les revêtements et dispositifs biocompatibles (sondes) permettent l’extraction directement à partir de matrices biologiques complexes sans prétraitement d’échantillons, par exemple l’homogénéisation et la filtration. Par le processus d’extraction, les analytes sont divisés entre la phase d’extraction et la matrice de l’échantillon en proportion de leurs concentrations initiales. Si l’extraction est effectuée assez longtemps, alors l’équilibre est atteint. Bien que l’extraction à l’équilibre offre la sensibilité et la reproductibilité les plus élevées possibles, l’extraction pré-équilibre est également possible et même préférable dans certains cas, c’est-à-dire l’échantillonnage in vivo, où les restrictions de temps associées à l’échantillonnage sur place (p. ex., salles d’opération ou d’urgence) nécessitent des extractions rapides. Le profil de temps d’extraction d’un analyte donné est généralement influencé par les propriétés physicochimiques de l’analyte, la matrice échantillonnée, le type de sorbent utilisé et plusieurs autres conditions d’extraction. La pléthore de facteurs régissant leur cinétique d’extraction rend pratiquement impossible d’assurer l’extraction d’équilibre de tous les composés lorsque des analyses non ciblécombres telles que la métabolomique ou la lipidomique sont effectuées. Pour les raisons susmentionnées, le temps d’extraction du protocole actuel a été fixé arbitrairement afin d’assurer une sensibilité et une couverture satisfaisantes des métabolites d’une part, et la praticité de l’utilisation sur place d’autre part.
Il convient de souligner que la très petite taille des sondes utilisées pour l’extraction de l’échantillon à partir de tissus ne cause qu’un minimum de lésions tissulaires alors que la procédure d’échantillonnage elle-même ne consomme aucun tissu mais de très petites quantités de petites molécules de la zone échantillonnée; par conséquent, le même échantillon peut être utilisé pour des tests de routine, c’est-à-dire histologiques ou génétiques, permettant la réalisation d’informations essentielles et complémentaires à partir d’un même échantillon. De telles données complémentaires et complètes permettraient une meilleure compréhension de la biologie tumorale, ce qui, espérons-le, faciliterait la découverte de nouvelles cibles de traitement. L’exploitation de cette méthode augmente encore la possibilité de diagnostics peropératoires sur place lors de la détermination des biomarqueurs cibles.
Ci-dessous nous présentons des protocoles pour l’échantillonnage des tumeurs cérébrales sur place pour les analyses métabolomiques et lipidomiques et le traitement des données.
Protocol
L’étude présentée ci-dessous a été approuvée par le Comité de bioéthique du Collegium Medicum à Bydgoszcz à l’Université Nicolaus Copernicus de Toruń (KB 628/2015). N’oubliez pas de toujours porter un manteau de laboratoire et tout autre équipement de sécurité personnelle requis, comme (sans s’y limiter) des gants et des lunettes de sécurité. Ne touchez pas à la phase d’extraction des sondes de microextraction de phase solide (SPME).
1. Préparation des dispositifs SPME
- Utilisez des sondes (fibres) avec des revêtements en mode mixte et C18 pour la métabolomique et la lipidomique, respectivement. Recueillir deux ensembles d’échantillons, l’un pour la métabolomique et l’autre pour la lipidomique.
- Ajustez le revêtement de la sonde à une longueur optimale en coupant la sonde SPME. Dans l’étude actuelle, la longueur de revêtement sélectionnée était de 7 mm. Sélectionnez la longueur de la fibre en fonction de la taille de la tumeur à l’étude, en veillant à ce que l’ensemble du sorbent puisse être immergé dans la tumeur (Figure 1).
- Conditionner les revêtements des sondes en les trempant dans du méthanol : eau 50:50 v/v mélange pour une période minimale de 1 h avant la procédure d’extraction. Transporter les fibres jusqu’au site d’échantillonnage (p. ex., l’hôpital) dans un flacon contenant la solution de conditionnement.
2. Procédure de collecte d’échantillons
- Ne pas laver ou prétratre la tumeur de quelque façon que ce soit avant l’extraction du SPME.
- Commencez l’échantillonnage dès que possible après l’ablation de tumeur (2 min dans l’étude présentée).
REMARQUE : Ajustez le temps en fonction de la mise en place sur place d’une installation donnée (distance du site de travail du chercheur par rapport à la table d’opération) et gardez-le constant pour l’ensemble de l’étude. Minimiser le temps écoulé entre l’ablation de tumeur et le début de l’extraction est crucial pour la capture des métabolites instables qui se dégradent après que la circulation sanguine soit coupée du tissu étudié. - Effectuez l’échantillonnage à température ambiante. Alternativement, placez l’échantillon sur la glace lorsque l’extraction est effectuée. Dans les deux cas, maintenir les mêmes conditions pour l’ensemble des échantillons.
- Sortez la sonde du flacon.
- Laver les fibres avec de l’eau de qualité chromatographie-masse liquide (LC/MS) pendant 5 s en les immergeant dans de l’eau de qualité LC/MS. Ne laissez pas sécher le sorbent avant l’insertion de fibres pour assurer une bonne reproductibilité des données.
- Insérez les fibres dans le tissu tumoral cérébral aussi loin que possible, en veillant à ce que toute la phase d’extraction est située à l’intérieur de la tumeur.
REMARQUE : Il est recommandé que les extractions soient effectuées en réplique afin de déterminer la nature hétérogène de la tumeur (Figure 2). Trois répliques par échantillon sont recommandées. - Laissez la sonde pendant 30 min dans le tissu (mesurée à l’aide d’une minuterie).
- Utilisez des contrôles vierges pour éliminer les sources d’erreur liées à la présence d’artefacts provenant de sources autres que la tumeur échantillonnée. Pour obtenir des contrôles vierges, soumettez les fibres au même flux de travail analytique, tel que décrit ci-dessus, mais sans l’étape d’échantillonnage (insertion dans le tissu ou tout autre échantillon/matrice). Dans l’étape de traitement des données, compiler les analytes extraits de ces fibres en une « liste d’exclusion » pour exclure les signaux dérivés de contaminants provenant de solvants ou de fabrication de fibres. Il est recommandé d’utiliser au moins 3 répliques de blanc.
REMARQUE : Pour vérifier le risque de contamination, il est nécessaire d’effectuer des prélèvements à partir de gants, de tables, d’appareils ou de toute autre surface qui pourrait présenter un risque de contamination. Dans de tels cas, la préparation des fibres, le temps d’extraction et les protocoles de désorption sont les mêmes que pour les échantillons. - Pendant l’extraction, étiquetez les flacons à utiliser pour le stockage des sondes après extraction.
- Après 30 min, retirer la fibre (s) de la tumeur au cerveau.
- Laver les fibres avec de l’eau pendant 3 s en les immergeant dans de l’eau de qualité LC/MS pour éliminer les résidus de sang ou de débris cellulaires de la sonde de sorte que l’extrait final ne contient que de petites molécules. Une étape de lavage plus longue n’est pas recommandée car elle peut entraîner la perte de composés polaires.
- Immobiliser les fibres dans le septa pré-fente de la haute performance chromatographie liquide (HPLC) bouchon de flacon en perçant la septa du fond avec l’extrémité non enduite de la fibre.
- Placez les fibres immobilisées dans le bouchon dans des flacons HPLC séparés et placez-les dans le conteneur de transport sélectionné.
- Effectuez les étapes 2.11-2.13 pour les fibres dédiées aux commandes vierges.
3. Transport et stockage
REMARQUE : Plusieurs options sont disponibles pour le transport des échantillons au laboratoire. Il est recommandé d’utiliser une boîte liquide d’azote Dewar ou de polystyrène remplie de glace sèche pour le transport; alternativement, les banquises peuvent être utilisées pour un transport immédiat et rapide.
- Placez les flacons avec des fibres dans le récipient de transport.
- À l’arrivée du laboratoire, placez immédiatement les flacons avec des fibres SPME dans un congélateur de -80 °C ou de -30 °C. Ne stockez pas les fibres plus longtemps que 3 ans à -30 °C ou 5 ans à -80 °C.
4. Préparation de l’échantillon pour l’analyse métabolomique
REMARQUE : Cette étape ne doit être effectuée qu’une fois que tous les échantillons d’une expérience ont été prélevés.
- Avant l’analyse instrumentale, préparer le mélange de solvants de désorption : acetonitrile : eau 80:20 v/v.
- Sortez les flacons contenant les fibres à mode mixte du congélateur. Utilisez-les pour l’analyse métabolomique.
- Flacons d’étiquette à utiliser pour la désorption.
- Pipette 300 μL de la solution de désorption (préparée à l’étape 4.1) dans des inserts en verre placés dans des flacons de 2 mL.
- Effectuer la désorption de chaque fibre placée dans un insert séparé en immergeant complètement le revêtement dans le solvant de désorption, puis l’agiter pendant 120 min à 1200 rpm à l’aide de vortex.
- Après 120 min (une fois la désorption terminée) enlever les bouchons avec des sondes.
- Préparer l’échantillon qc en mélangeant 10 aliquots μL de chaque échantillon de l’ensemble de l’échantillon. La taille de l’ensemble de l’échantillon dépend de la conception expérimentale. Il est important d’analyser tous les échantillons en un seul lot.
- Fermez les flacons avec de nouvelles casquettes.
- Placez les flacons dans l’autosampler (4 °C) du spectromètre de masse haute résolution de chromatographie liquide (LC-HRMS) et passez à l’étape 5.
REMARQUE: Randomiser l’ordre des injections des échantillons, y compris les blancs de contrôle. Injectez un échantillon de QC après chaque échantillon de 8 à 10 échantillons pour surveiller la stabilité de l’instrument.
5. Analyse métabolomique à l’aide de la chromatographie liquide de phase inversée et du spectromètre de masse haute résolution (analyse RPLC-HRMS)
- Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation positive.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode positif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 80-1000; résolution 70 000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 1.5 kV ; Niveau RF s-lens: 55%; Tension de l’objectif S : 25 V; tension d’écumoire : 15 V ; température capillaire: 300 °C; gaz de gaine : 40 a.u.; au gaz: 15 a.u.; température du chauffe-gaz : 300 °C. Cette méthode chromatographique a été adaptée de Vuckovic et coll.7. Volume d’injection : 10 μL. - Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation négative.
REMARQUE : Paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode négatif : plage de balayage : m/z 80-1000; résolution 70 000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 2.5 kV ; Niveau RF s-lens: 55%; Tension de l’objectif S : -25 V; tension d’écumoire : -15 V ; température capillaire: 256 °C gaz gaine: 48 a.u; au gaz: 11 a.u.; température du chauffe-gaz: 413 °C. Cette méthode chromatographique a été adoptée à partir de Vuckovic et coll.7. Volume d’injection : 10 μL. - Calibrer l’instrument tel que recommandé par le fabricant.
REMARQUE : Dans l’étude actuelle, l’instrument a été calibré à l’aide d’étalonnage externe toutes les 48 h, ce qui a donné lieu à une précision de masse et à 2 ppm. - Commencez l’analyse en cliquant sur le bouton Démarrer dans le logiciel qui exploite l’instrument.
- Lorsque l’analyse est terminée, remplacez la colonne RPLC par la colonne HILIC, modifiez les phases mobiles et passez à l’étape 6.
6. Analyse métabolomique à l’aide de chromatographie liquide d’interaction hydrophilique et spectromètre de masse haute résolution (analyse HILIC-HRMS)
- Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation positive.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode positif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 80-1000; résolution 70 000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 1.5 kV ; Niveau RF s-lens: 55%; Tension de l’objectif S : 25 V; tension d’écumoire : 15 V ; gaz de gaine : 60 a.u.; au gaz: 40 a.u.; température du chauffe-gaz : 425 °C; température capillaire: 325 °C. La méthode chromagraphique a été adaptée de Vuckovic et coll.7. Volume d’injection : 10 μL. - Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation négative.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode négatif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 80-1000; résolution 70 000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 1.3 kV ; Niveau RF s-lens: 55%.; Tension de l’objectif S : -25 V; tension d’écumoire : -15 V ; température capillaire: 263 °C; gaz de gaine : 60 a.u.; au gaz: 30 a.u.; température du chauffe-gaz : 425 °C. La méthode chromagraphique a été adaptée de Vuckovic et coll.7. Volume d’injection : 10 μL. - Calibrer l’instrument tel que recommandé par le fabricant.
REMARQUE : Dans l’étude actuelle, l’instrument a été calibré à l’aide d’étalonnage externe toutes les 48 h, ce qui a donné lieu à une précision de masse et à 2 ppm. - Commencez l’analyse en cliquant sur le bouton Démarrer dans le logiciel qui exploite l’instrument.
7. Préparation de l’échantillon pour l’analyse lipidomique
REMARQUE : Cette étape ne doit être effectuée qu’une fois que tous les échantillons de l’expérience ont été prélevés.
- Avant de commencer l’analyse, préparer le mélange de solvants de désorption: isopropanol:méthanol 50:50 v/v.
- Sortez les flacons contenant les fibres C18 dédiées à l’analyse lipidomique du congélateur.
- Flacons d’étiquette à utiliser pour la désorption.
- Pipette 200 μL de la solution de désorption (préparée à l’étape 7.1) aux inserts en verre silanisés placés dans des flacons de 2 mL.
REMARQUE : Des inserts non silanisés peuvent également être utilisés, mais leur utilisation peut entraîner une mauvaise reproductibilité des composés à forte teneur en grumes, car ces composés peuvent ne pas s’attacher spécifiquement aux parois de verre. - Effectuer la désorption de chaque fibre dans un insert séparé en immergeant complètement le revêtement dans le solvant de désorption, puis l’agiter pendant 60 min à 1200 rpm à l’aide de vortex.
- Après 60 min lorsque la désorption est terminée enlever les bouchons avec des sondes.
- Préparer l’échantillon qc en mélangeant 10 aliquots μL de chaque échantillon de l’ensemble de l’échantillon. La taille de l’ensemble de l’échantillon dépend de la conception expérimentale. Il est important d’analyser tous les échantillons en un seul lot.
- Fermez les flacons avec de nouvelles casquettes.
- Placez les flacons dans l’autosampler (4 °C) du spectromètre de masse haute résolution de chromatographie liquide (LC-HRMS) et passez à l’étape 8.
8. Analyse lipidomique utilisant la chromatographie liquide de phase inversée et la spectrométrie de masse à haute résolution (analyse RPLC-HRMS)
- Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation positive.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode ion positif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 100-1000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 3.5 kV, niveau RF de S-objectif : 55%; Tension de l’objectif S : 25 V; tension d’écumoire : 15 V ; température capillaire 275 °C; gaz de gaine : 30 a.u.; au gaz: 10 a.u.; gaz de rechange : 2 a.u.; température du réchauffeur de sonde 300 °C. Les paramètres LC utilisés étaient : phase A : méthanol : eau, 40:60 avec acétate d’ammonium de 10 mM et acide acétique de 1 mM ; phase B : isopropanol : méthanol, 90:10 avec acétate d’ammonium de 10mM et acide acétique de 1 mM.; le gradient: 0 min - 20% B; 1,0 min - 20% B; 1,5 min – 50 % B; 7,5 min – 70 % B; 13,0 min - 95% B; 17,0 min - 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23,0 min – STOP; Colonne C18, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; débit: 0,2 mL/min; température du four: 55 °C; volume d’injection : 10 μL. - Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation négative.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle étaient les suivants : paramètres HRMS pour le mode ier négatif : plage de balayage : m/z 100-1000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); injecter du temps à C-trap: auto; tension de pulvérisation : 3.5 kV, niveau RF de S-objectif : 55%; Tension de l’objectif S : -25 V; tension d’écumoire : -15 V ; température capillaire 275 °C; gaz de gaine : 30 a.u ; au gaz: 10 a.u.; gaz de rechange : 2 a.u; température du réchauffeur de sonde 300 °C. Méthode chromagraphique : identique à 8,1. - Calibrer l’instrument tel que recommandé par le fabricant.
REMARQUE : Dans l’étude actuelle, l’instrument a été calibré à l’aide d’étalonnage externe toutes les 48 h, ce qui a donné lieu à une précision de masse et à 2 ppm. - Commencez l’analyse en cliquant sur le bouton Démarrer dans le logiciel qui exploite votre instrument.
- Lorsque l’analyse est terminée, remplacez la colonne RPLC par la colonne HILIC, modifiez les phases mobiles et passez à l’étape 9.
9. Analyse lipidomique à l’aide de chromatographie liquide d’interaction hydrophilique et spectromètre de masse haute résolution (analyse HILIC-HRMS)
- Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation positive.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode ion positif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 100-1000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); tension de pulvérisation : 1.5 kV ; Niveau RF s-lens: 55%; Tension de l’objectif S : 25 V; tension d’écumoire : 15 V ; température capillaire 325 °C; gaz de gaine : 60 a.u.; au gaz: 30 a.u.; gaz de rechange : 2 a.u.; la température du réchauffeur de sonde 320 °C. Paramètres LC utilisés étaient les : phase A : acétate d’ammonium de 5 mM dans l’eau; phase B : acétyonitrile; le gradient: 0 - 2min - 4% B; 15,0 à 20 % B; 15,1 - 4% B, 21,0 min – STOP; 3 μm 100 mm x colonne de 2,1 mm; débit: 0,4 mL/min; température du four: 40 °C; volume d’injection : 10 μL. - Configurer les paramètres de l’analyse LC-HRMS et du mode d’ionisation négative.
REMARQUE : Les paramètres utilisés dans l’étude actuelle en mode ii négatif étaient les suivants : plage de balayage : m/z 80-1000; acquisition réalisée à l’aide d’AGC (1 000 000 ions); tension de pulvérisation : 1.5 kV, niveau RF de S-objectif : 55%; Tension de l’objectif S : -25 V; tension d’écumoire : -15 V ; température capillaire 320 °C; gaz de gaine : 50 a.u.; au gaz: 21 a.u.; gaz de rechange : 3 a.u.; température du réchauffeur de sonde 320 °C. La méthode chromatographique était la même que décrite dans 9.1. - Calibrer l’instrument tel que recommandé par le fabricant.
REMARQUE : Dans l’étude actuelle, l’instrument a été calibré à l’aide d’étalonnage externe toutes les 48 h, ce qui a donné lieu à une précision de masse et à 2 ppm. - Commencez l’analyse en cliquant sur le bouton Démarrer dans le logiciel qui exploite l’instrument.
10. Traitement des données et analyse statistique
- Traiter les données à l’aide d’un logiciel compatible avec le format des fichiers de données brutes.
- Effectuez une analyse statistique à l’aide des données traitées.
REMARQUE : Le type de test dépend de l’hypothèse scientifique et de la conception de l’étude. Dans l’étude actuelle, l’analyse des composantes principales, l’analyse partielle-moins carrée-discriminante et l’ANOVA uni sensé ont été utilisées.
Representative Results
L’exploitation de la microextraction de phase solide comme méthode de préparation d’échantillons en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution et à un logiciel avancé de traitement des données nous a permis de caractériser avec succès le métabolome et le lipidome des tumeurs cérébrales humaines. La sonde, dont la taille était équivalente à une aiguille d’acupuncture, a causé un minimum de dommages au tissu étudié et aucune consommation de tissu, permettant donc l’utilisation supplémentaire d’échantillons pour des études histologiques ou génétiques. La séparation satisfaisante des groupes sélectionnés a été obtenue pour la phase inversée et les colonnes HILIC, et pour les deux modes d’ionisation dans les analyses métabolomiques et lipidomiques. L’utilisation des deux méthodes de séparation non seulement dans la métabolomique, mais aussi dans l’analyse lipidomique a fourni des données complémentaires précieuses. La colonne de phase inversée sépare les lipides en ce qui concerne leur longueur des chaînes de carbone et la présence de liaisons insaturées, tandis que la colonne HILIC est utile pour profiler les groupes lipidiques, en particulier les phospholipides8.
La reproductibilité de l’analyse instrumentale s’est trouvée très bonne basée sur le regroupement serré des échantillons de QC sur la parcelle principale d’analyse de composant(figure 3A,les trois échantillons de QC injectés tous les huit échantillons de patients le long du chevauchement de séquence). De plus, on a constaté que les blancs d’extraction utilisés pour l’analyse de contrôle négatif se séparent bien des échantillons réels. Le large éventail d’analytes extraits par les sondes a facilité la découverte d’espèces représentatives, permettant ainsi avec succès la différenciation entre les tumeurs cérébrales humaines en fonction de leur origine histologique, de leur malignité et d’autres facteurs (p. ex., génétiques). La figure 3B montre des données lipidomiques pour des échantillons prélevés auprès de patients atteints de gliomes et de méningiomes. La différenciation habilitante entre ces tumeurs, qui ont été caractérisées par l’origine histologique différente et la malignité, était un but important de l’étude, car les méningiomes sont généralement considérés comme tumeurs bénignes, alors que les gliomes sont l’un des plus malins. De plus, dans la figure 4 présentant des données métabolomiques, les gliomes ont été divisés en fonction de leur degré de malignité en données élevées et faibles. Ces sous-groupes ont été comparés au phénotype moléculaire des méningiomes. Dans les deux cas, une séparation importante des grappes a été observée. Aujourd’hui, le diagnostic du gliome repose principalement sur la détermination de mutations génétiques spécifiques dans des échantillons de tumeurs. Par conséquent, les résultats obtenus ont été comparés aux données de génotypage. La figure 5A présente la séparation des échantillons avec la co-suppression détectée 1p19q et des échantillons où la mutation n’a pas été observée.
L’analyse statistique permet également la sélection des composés dans les groupes étudiés. Ces composés peuvent être considérés comme des biomarqueurs potentiels dans les cas où une cohorte suffisamment importante est échantillonnée. Toutefois, une analyse plus approfondie, y compris la confirmation concluante des composés détectés par fragmentation et la comparaison des espèces détectées avec des normes analytiques, est nécessaire pour tirer des conclusions définitives de nature biologique. Des exemples de ces métabolites discriminants sont présentés à la figure 3C et à la figure 5B. L’identité de ces composés, c’est-à-dire sphingomielyn: SM d36:1 et proline ont été confirmées en comparant les modèles de fragmentation des métabolites de l’échantillon et les normes authentiques.
Figure 1 : Fibres SPME préparées pour le processus d’extraction. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Extraction du méningiome à l’aide de sondes SPME. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Parcelles de PCA et de boîtes pour le gliome et le méningiome. Parcelle principale d’analyse des composants contenant (A) tous les échantillons analysés, y compris les blancs, extraction QC, blancs, méningiomes, gliomes; (B) ne contenant que des groupes étudiés (après exclusion des blancs et des QC); (C) parcelle de moustache boîte pour sphingomielyn: SM d36:1 patient différeciant avec le gliome et le méningiome. Données lipidomiques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : PCA pour HGG, LGG et méningiome. Parcelle principale d’analyse des composants montrant la différenciation entre (A) gliomes de haute qualité (HGG) et méningiomes (MEN)9 et (B) gliomes de qualité inférieure (LGG) et méningiomes. Données métabolomiques réimprimées à partir de Via Medica ref9 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Parcelles de PCA et de boîtes pour le gliome avec et sans suppression. (A) L’intrigue principale d’analyse de composant a montré des différences dans les patients avec et sans co-suppression 1p19q ; (B) parcelles de moustache boîte pour les patients différenciés proline avec et sans co-suppression 1p19q; n-sans suppression, y-avec suppression. Données métabolomiques Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
La métabolomique et la lipidomique non ciblées sont couramment utilisées dans des études axées sur l’identification des biomarqueurs tumorals. Cependant, dans la plupart des cas, les chercheurs recherchent des composés qui peuvent être utilisés pour le dépistage de la maladie. Par conséquent, les échantillons biologiques préférés sont le sang ou l’urine en raison de leur accès relativement facile. L’analyse du tissu tumoral est principalement effectuée pour comprendre les mécanismes derrière la maladie, caractériser différents types de tumeurs, etc. L’analyse sur place des biomarqueurs de tumeur est rarement exécutée, car de telles applications exigent la préparation étendue d’échantillon. Alternativement, les stratégies basées sur l’analyse en temps réel des profils tissulaires sans présélection de biomarqueurs spécifiques gagnent l’attention de la communautémédicale 3,4. La solution présentée ci-après offre une autre perspective sur le traitement des tissus sur place en dévoilant le type d’information qui peut être obtenue par de telles méthodes.
La combinaison de l’échantillonnage, de la préparation de l’échantillon et de l’extraction fait du SPME un outil très utile pour l’analyse sur place. De plus, le manque de consommation de tissus pendant l’échantillonnage permet d’utiliser davantage les mêmes échantillons pour l’analyse des biomarqueurs et les tests de routine (génotypage, analyse histologique), ce qui ajoute de nouvelles informations aux résultats des tests standard. Le dispositif d’échantillonnage a une conception très simple, son fonctionnement est très facile, et aucune formation spéciale n’est nécessaire pour effectuer l’extraction elle-même. Toutefois, pour obtenir des résultats fiables, il faut bien plus qu’une bonne manipulation des appareils. Pour bien exécuter l’expérience, il faut comprendre le processus d’extraction, la nature de l’échantillon et être conscient des erreurs potentielles qui peuvent influencer les données.
Il est important de tenir compte de l’hétérogénéité des tissus cancéreux10; les tumeurs échantillonnées peuvent contenir des parties subissant la nécrose, la calcification, et l’hypoxie, et chacun de ces processus sera reflété dans le métabolome et le lipidome atteints, influençant ainsi des résultats. Par conséquent, il est recommandé que l’échantillonnage de résolution spatiale soit effectué par insertion de plusieurs fibres dans différentes parties du tissu cancéreux, ou alternativement, qu’un revêtement plus long soit employé pour pénétrer l’ensemble de la tumeur de manière à obtenir l’information moyenne sur la tumeur. Si la méthode d’échantillonnage de résolution spatiale est effectuée, les fibres peuvent toutes être désorbées en un seul solvant de désorption; ceci permettrait non seulement l’accomplissement de l’information globale sur la tumeur, mais augmenterait également la sensibilité de l’analyse. Alternativement, la désorption des fibres individuelles dans les flacons séparés permettrait aux investigations de comprendre la diversité interne de la tumeur de cerveau, qui se compose du noyau construit des cellules cancéreuses, et de la zone extérieure, qui est la frontière du tissu sain. Des parties plus profondes de la tumeur sont habituellement plus endommagées par les processus liés au cancer11. Toutefois, les chercheurs doivent garder à l’esprit que cette option compromet la sensibilité de la méthode et le nombre global de composés détectables. Dans les travaux actuels, un revêtement de 7 mm a été utilisé; cette longueur a été considérée optimale pour diverses tailles des tumeurs incluses dans l’étude. Les revêtements ont pénétré les tumeurs, et ont ainsi fourni la résolution non-spéciale, mais les données moyennes dans l’échantillon. Quel que soit le protocole choisi, il est important que le même protocole soit suivi pendant toute l’étude, y compris le nombre de fibres utilisées pour l’échantillonnage individuel, la longueur du revêtement, le temps d’extraction et tous les autres facteurs délimités dans ce travail.
Il est important de contrôler la qualité de l’analyse. Le QC mis en commun (voir les étapes 4.7 et 7.7 du protocole) doit être préparé et utilisé pour surveiller la stabilité des instruments pendant l’utilisation de l’ensemble du lot de l’échantillon. Les commandes vierges (voir l’étape 2.8) peuvent ensuite être utilisées pour préparer une « liste d’exclusion » afin d’éliminer les signaux de contaminants provenant de solvants ou de fibres. Lors d’occasions spéciales, comme un risque de contamination, il est nécessaire d’effectuer des prélèvements à partir de gants, de tables, d’appareils ou de toute autre surface qui pourrait poser un risque de contamination. Dans de tels cas, la préparation des fibres, le temps d’extraction et les protocoles de désorption sont les mêmes que pour les échantillons.
Les analyses métabolomiques et lipidomiques sont entièrement axées sur de petites molécules (moins de 1 500 Da) apparaissant dans un organisme ou des composants spécifiques de l’organisme, tels que des organes spécifiques, des tissus, des fluides, des cellules, etc. Métabolomique et lipidomique offrent un instantané des changements biochimiques se produisant dans le corps, et dans le cas du cancer, ils intègrent l’information liée au génome, l’histologie, et la malignité de la tumeur. Ces sciences de l’omique créent un lien entre la physiologie et le phénotype, car les métabolites sont plus élevés dans l’échelle biochimique que les protéines ou lesgènes 12. En comprenant le métabolome et le lipidome des tumeurs cancéreuses, nous nous rapprochons de la découverte du phénotype parmi toutes les sciences -omics que ces branches d’étude offrent une connaissance plus approfondie des changements dynamiques des molécules comme une réponse des organismes vivants à divers stimuli. Telles que présentées dans ce travail, les données obtenues dans un échantillonnage correspondent à l’histologie du cancer, à son degré de malignité et aux changements qui se produisent au niveau du génome. Dans les gliomes, comme le type de cancer d’intérêt dans cette étude, l’information cachée dans le génome est particulièrement important, comme un traitement personnalisé est développé sur la base des résultats des tests génétiques. Les mutations particulières sont des marqueurs pronostiques des résultats de la chimio- ou de la radiothérapie. Comme nous l’avons démontré ici, la sélection de biomarqueurs reflétant une mutation donnée est possible avec la stratégie proposée. Les marqueurs de mutation, aussi bien que les types additionnels de descripteurs tels que ceux qui indiquent le degré de malignité de la tumeur peuvent également être utilisés pour soutenir des méthodes diagnostiques courantes.
Biopsie chimique ex vivo avec l’utilisation de fibres de microextraction de phase solide est la première étape dans l’application de la méthode aux diagnostics peropératoires. La méthode peut être facilement adoptée pour l’échantillonnage in vivo en attendant l’autorisation des conseils d’éthique appropriés. Dans de tels cas, la stérilisation des dispositifs SPME doit être effectuée selon les procédures de stérilisation acceptées de l’hôpital où l’échantillonnage doit être effectué, c’est-à-dire l’autoclaving ou la stérilisation par oxyde d’éthylène. Les fibres précon conditionnées et stérilisées doivent être conservées dans des emballages scellés étiquetés avec une date d’expiration de stérilisation. Il est important de noter que les fibres ne doivent pas être nettoyées à l’aide de surfactants. Une telle procédure peut provoquer des changements non spécifiques dans la composition sorbente, ce qui a un impact sur l’extraction des analytes. Dans les études décrites ci-après, une période d’extraction de 30 minutes a été utilisée, mais d’autres rapports valident que des temps plus courts peuvent donner des résultats satisfaisants dans les études in vivo 13. Huq et coll. ont montré que le temps d’équilibre analyte est atteint plus rapidement dans les tissus, comme matrice complexe, que dans les matricessimples 14. Cependant, la reproductibilité des résultats obtenus peut être compromise dans des périodes d’extraction plus courtes car plus d’analytes seront extraits dans des conditions de pré-équilibre; par conséquent, un contrôle précis du temps doit être mis en œuvre.
Les deux sciences de l’omique exploitées dans le cadre de ces travaux ont un excellent potentiel en tant qu’outils de découverte de biomarqueurs. Une fois que les biomarqueurs sont sélectionnés ou qu’un modèle chimiométrique est établi, des diagnostics médicaux fondés sur la détermination des métabolites cibles au moyen de méthodes applicables aux enquêtes sur place, comme l’approche SPME décrite dans ce travail, peuvent être élaborés et mis en œuvre dans le cadre de diagnostics de routine.
Le protocole proposé dans le présent manuscrit décrit comment effectuer des analyses métabolomiques et lipidomiques non recibrées du tissu cancéreux à l’aide de microextraction en phase solide pour le dépistage des biomarqueurs potentiels. Il est conçu pour permettre l’extraction de composés représentatifs, la différenciation des tumeurs et l’identification de composés discriminatoires caractérisant un cancer donné, c’est-à-dire des biomarqueurs potentiels. Les analyses non ciblées avec SPME décrites dans cet article représentent un point de départ dans le développement de diagnostics peropératoires rapides, où un panel sélectionné de composés peut être déterminé sans la nécessité de criblage de tous les composés présents dans l’échantillon. Dans l’intérêt de résultats diagnostiques rapides, les sondes SPME utilisées pour l’extraction sur place pourraient être directement couplées à l’instrumentation analytique située dans l’établissement hospitalier. Des extractions simples effectuées avec une préparation minimale de l’échantillon suivie d’une analyse sans chromatographie raccourciraient considérablement le temps global d’heures à quelques minutes, comme déjà décrit pour la surveillancedes médicaments 15.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été soutenue par la subvention Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 du Centre national des sciences. Les auteurs aimeraient remercier MilliporeSigma, une entreprise de Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne, d’avoir fourni les dispositifs SPME utilisés dans ce travail. L’entreprise de sciences de la vie de Merck fonctionne sous le nom de MilliporeSigma aux États-Unis et au Canada. En outre, les auteurs tiens à remercier Thermo Fisher Scientific pour l’accès au spectromètre de masse orbitrap Q-Exactive Focus.
Contributions des auteurs : JB : optimisation de la préparation des échantillons et des paramètres LC-MS, performance des expériences SPME-LC-MS, analyse des données, analyse statistique et interprétation des données et préparation manuscrite liée à la partie lipidomique; PZG : coordination et performance de la majorité des échantillonnages à l’hôpital, optimisation des paramètres d’échantillonnage et de préparation des échantillons, performance des expériences SPME-LC-MS, analyse des données, analyse statistique et interprétation des données, préparation manuscrite liée à la partie métabolomique; MG – aide à l’optimisation de la préparation de l’échantillon, de la méthode LC-MS et de l’analyse des données liées à la partie lipidomique; KG : co-exécution des échantillonnages spme et optimisation de l’échantillonnage et de la préparation des échantillons, analyse SPME-LC-MS liée à la partie métabolomique; KC : rendement de plusieurs échantillonnages de SPME à l’hôpital, aide à l’optimisation de l’échantillonnage, préparation d’échantillons et analyse de données liées à la partie métabolomique; KJ : exécution de plusieurs échantillonnages de SPME à l’hôpital, assistance dans l’analyse de lipidomics ; DP : exécution des procédures chirurgicales, recrutement des patients ; JF : exécution des procédures chirurgicales, recrutement des patients ; MH : exécution des procédures chirurgicales, coordination de la partie clinique de la recherche ; BB : concept, supervision de coordination du projet et préparation des manuscrits, exécution de plusieurs échantillonnages
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
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