Summary
Manuskriptet presenterer prøvetaking av menneskelige hjernesvulster med solid fase mikroektraksjon etterfulgt av deres biokjemiske profilering mot oppdagelsen av biomarkører.
Abstract
Til tross for ulike verktøy som er tilgjengelige for kreftdiagnose og klassifisering, er metoder som muliggjør rask og enkel karakterisering av svulster fortsatt i nød. I de senere årene har massespektrometri blitt en metode for valg for ikke-målrettet profilering av diskriminerende sammensatt som potensielle biomarkører av en sykdom. Biofluider anses generelt som å foretrekke matriser gitt deres tilgjengelighet og enklere prøvebehandling, mens direkte vevprofilering gir mer selektiv informasjon om en gitt kreft. Fremstilling av vev for analysen via tradisjonelle metoder er mye mer komplisert og tidkrevende, og derfor ikke egnet for rask analyse på stedet. Det nåværende arbeidet presenterer en protokoll som kombinerer prøveforberedelse og ekstraksjon av små molekyler på stedet, umiddelbart etter tumorreseksjon. Prøvetakingsenheten, som er av størrelsen på en akupunkturnål, kan settes direkte inn i vevet og deretter transporteres til det nærliggende laboratoriet for instrumental analyse. Resultatene av metabolomics og lipidomics analyser viser evnen til tilnærmingen for etablering av fenotyper av svulster knyttet til den histologiske opprinnelsen til svulsten, malignitet, og genetiske mutasjoner, samt for valg av diskriminerende forbindelser eller potensielle biomarkører. Den ikke-destruktive karakteren av teknikken tillater etterfølgende ytelse av rutinemessig brukte tester, for eksempel histologiske tester, på de samme prøvene som brukes til SPME-analyse, og dermed muliggjør oppnåelse av mer omfattende informasjon for å støtte personlig diagnostikk.
Introduction
Magnetic Resonance Imaging (MR) og Computertomography (CT) er de viktigste metodene som brukes til sanntidsanalyse av hjernelesjoner. Hjernesvulst differensiering er generelt basert på histopatologi med ekstra farging og avanserte immunohistokjemiske teknikker. Ifølge oppdatert veiledning om sentralnerve hjernesvulster utstedt av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2016, genetiske tester er avgjørende for differensiering og klassifisering av disse svulstene1. Differensiering og klassifisering av svulster tillater leger å velge den mest effektive behandlingen for en gitt type svulst og dermed utvide pasientens forventede levetid. Dessverre, til tross for tilgjengeligheten av slike avanserte metoder for å hjelpe leger i å velge en optimal terapi for sine pasienter, er forventet levetid for pasienter diagnostisert med glioblastom (IV-klasse gliom) bare ca 15-16 måneder2. Selv med raffinement og økt nøyaktighet av nevnte avbildning og histologiske metoder som diagnostiske verktøy, er det fortsatt et stort behov for nye teknikker som er i stand til å tilby komplementær informasjon for å hjelpe leger i beslutninger om behandlingsforløpet. I løpet av de siste årene har flere nye tilnærminger basert på massespektrometri blitt foreslått for intraoperativ analyse av kreft3,4. Potensialet for solid fase mikroektraksjon (SPME), metoden som presenteres heri, som et raskt analyseverktøy på stedet, er allerede vist i en rekke studier5. Det nåværende manuskriptet viser en av metodens kliniske anvendelser, umålrettede metabolomikk og lipidomikk av menneskelige hjernesvulster. Umålrettede undersøkelser presenterer et viktig utgangspunkt i oppdagelsen av potensielle biomarkører. Når etablert, slike biomarkører kan deretter brukes som diagnostiske referanser for å skille mellom svulster ved hjelp av samme teknologi koblet til på stedet instrumentering.
SPME er en likevektsbasert prøveforberedelsesteknikk som trekker ut små molekyler fra prøvematriser ved bruk av små mengder ekstraksjonsfase. I SPME mest tradisjonelle konfigurasjon av enheten (sonde), er en fiber belagt med en passende ekstraksjonsfase og immobilisert på en solid støtte, det vil vil at enmetalltråd 5,6. Biokompatible belegg og enheter (prober) muliggjør ekstraksjon direkte fra komplekse biologiske matriser uten prøvebehandling, for eksempel homogenisering og filtrering. Gjennom ekstraksjonsprosessen partisjoneres analyser mellom ekstraksjonsfasen og prøvematrisen i forhold til deres opprinnelige konsentrasjoner. Hvis utvinning utføres lenge nok, oppnås likevekt. Mens ekstraksjon ved likevekt gir høyest mulig følsomhet og reproduserbarhet, er pre-likevektsutvinning også mulig og til og med å foretrekke i noen tilfeller, det vil si in vivo-prøvetaking, hvor tidsbegrensninger knyttet til prøvetakingen på stedet (f.eks. drifts- eller beredskapsrom) nødvendiggjør raske ekstraksjoner. Ekstraksjonstidsprofilen til en gitt analytt påvirkes vanligvis av de fysikalske egenskapene til analytten, matrisen som samples, typen sorbent som brukes, og flere andre ekstraksjonsforhold. Mengden av faktorer som styrer deres ekstraksjon kinetikk gjør det praktisk talt umulig å sikre likevekt utvinning av alle forbindelser når untargeted analyser som metabolomics eller lipidomics utføres. Av ovennevnte grunner ble utvinningstiden til den nåværende protokollen satt vilkårlig for å sikre tilfredsstillende følsomhet og dekning av metabolitter på den ene siden, og praktisk for bruk på stedet på den andre.
Det bør understrekes at den svært lille størrelsen på sonder som brukes til ekstraksjon av prøve fra vev, bare forårsaker minimal vevsskade mens prøvetakingsprosedyren i seg selv ikke bruker noe vev, men svært små mengder små molekyler fra det samplede området; Derfor kan den samme prøven brukes videre til rutinemessige tester, det vil si histologisk eller genetisk, slik at oppnåelse av essensiell og komplementær informasjon fra samme prøve. Slike komplementære, omfattende data ville muliggjøre en bedre forståelse av tumorbiologi, forhåpentligvis tilrettelegge oppdagelsen av nye behandlingsmål. Utnyttelse av denne metoden øker ytterligere muligheten for intraoperativ diagnostikk på stedet ved fastsettelse av målbiomarkører.
Nedenfor presenterer vi protokoller for prøvetaking av hjernesvulster på stedet for metabolomikk og lipidomikkanalyser og databehandling.
Protocol
Studien som presenteres her ble godkjent av Bioethics Committee of Collegium Medicum i Bydgoszcz ved Nicolaus Copernicus University i Toruń (KB 628/2015). Husk å alltid ha på deg en laboratoriefrakk og annet nødvendig personlig sikkerhetsutstyr, for eksempel (men ikke begrenset til) vernehansker og briller. Ikke berør avsugsfasen til SPME-probene (solid fasemikrokstraksjon).
1. Utarbeidelse av SPME-enhetene
- Bruk prober (fibre) med blandet modus og C18 belegg for metabolomikk og lipidomikk, henholdsvis. Samle to sett med prøver, en for metabolomics og en for lipidomics.
- Juster belegget på sonden til en optimal lengde ved å trimme SPME-sonden. I den nåværende studien var den valgte belegglengden 7 mm. Velg lengden på fiberen i henhold til størrelsen på svulsten som studeres, slik at hele sorbenten kan nedsenkes i svulsten (figur 1).
- Tilstand belegget av sondene ved å bløtlegge dem i metanol: vann 50:50 v / v blanding for en minimumsperiode på 1 time før ekstraksjonsprosedyren. Transportfibre til prøvetakingsstedet (f.eks. sykehus) i et hetteglass som inneholder kondisjoneringsløsningen.
2. Prosedyre for prøveinnsamling
- Ikke vask eller forbehandle svulsten på noen måte før SPME ekstraksjon.
- Start prøvetakingen så snart som mulig etter tumorfjerning (2 min i den presenterte studien).
MERK: Juster tiden avhengig av oppsettet på stedet for et gitt anlegg (avstand fra forskerens arbeidssted fra driftsbordet) og hold det konstant for hele studien. Minimere den forløpte tiden mellom tumorfjerning og starten av utvinningen er avgjørende for fangst av ustabile metabolitter som brytes ned etter at blodsirkulasjonen er avskåret fra det studerte vevet. - Utfør prøvetaking ved romtemperatur. Alternativt kan du plassere prøven på is når utvinningen utføres. I begge tilfeller må du opprettholde de samme betingelsene for hele settet med prøver.
- Ta sonden ut av hetteglasset.
- Vask fibre med flytende kromatografi-massespektrometri (LC/MS) grade vann i 5 s ved å senke dem ned i LC / MS klasse vann. Ikke la sorbent tørke før fiberinnsettingen for å sikre god reproduserbarhet av data.
- Sett fibrene inn i hjernesvulstvevet så langt fra hverandre som mulig, slik at hele ekstraksjonsfasen ligger inne i svulsten.
MERK: Det anbefales at ekstraksjoner utføres i replikering for å bestemme svulstens heterogene natur (figur 2). Tre replikere per prøve anbefales. - La sonden stå i 30 min i vevet (målt med en timer).
- Bruk tomme kontroller for å eliminere feilkilder knyttet til tilstedeværelsen av gjenstander som stammer fra andre kilder enn den samplede svulsten. For å få tomme kontroller, emnefibre til samme analytiske arbeidsflyt, som beskrevet ovenfor, men uten prøvetakingstrinnet (innsetting i vevet eller noen annen prøve / matrise). I databehandlingstrinnet kompilerer du analyttene som er hentet fra disse fibrene, til en "ekskluderingsliste" for å utelukke signaler avledet fra forurensninger som stammer fra løsemidler eller fiberproduksjon. Det anbefales at minst 3 replikeringer av blank brukes.
MERK: For å se etter risikoen for kontaminering er det nødvendig å utføre prøvetaking fra hansker, bord, apparater eller andre overflater som kan utgjøre en forurensningsrisiko. I slike tilfeller er fiberforberedelse, utvinningstid og desorpsjonsprotokoller de samme som for prøvene. - Mens ekstraksjon utføres, merk hetteglassene som skal brukes til lagring av sondene etter ekstraksjon.
- Etter 30 min, fjern fiber(er) fra hjernesvulsten.
- Vask fibrene med vann i 3 s ved å senke dem ned i LC/MS-graders vann for å fjerne rester av blod eller celleavfall fra sonden, slik at det endelige ekstraktet bare inneholder små molekyler. Et lengre vasketrinn anbefales ikke, da det kan føre til tap av polare forbindelser.
- Immobiliser fibrene i pre-slit septa av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) hetteglass cap ved piercing septa fra bunnen med den ikke-belagte enden av fiberen.
- Sett fibrene immobilisert i hetten i separate HPLC hetteglass og plasser dem i den valgte transportbeholderen.
- Utfør trinn 2.11-2.13 for fibre dedikert til tomme kontroller.
3. Transport og lagring
MERK: Flere alternativer er tilgjengelige for transport av prøver til laboratoriet. Det anbefales at en flytende nitrogen Dewar eller polystyren boks fylt med tørris brukes til transport; Alternativt kan ispakker brukes til umiddelbar og rask transport.
- Plasser hetteglassene med fibre i transportbeholderen.
- Ved laboratorieankomst plasserer du umiddelbart hetteglass med SPME-fibre i en -80 °C eller -30 °C fryser. Ikke oppbevar fibre lenger enn 3 år ved -30 °C eller 5 år ved -80 °C.
4. Prøveforberedelse for metabolomikkanalyse
MERK: Dette trinnet skal bare utføres når alle prøvene for et eksperiment er samlet inn.
- Før instrumentell analyse, forberede avsorpsjon løsemiddel blanding: acetonitril:vann 80:20 v/v.
- Ta ut hetteglassene som inneholder fibrene i blandet modus fra fryseren. Bruk disse for metabolomikkanalyse.
- Etikett hetteglass som skal brukes til desorpsjon.
- Pipette 300 μL av avsorpsjonsoppløsningen (tilberedt i trinn 4.1) i glassinnsatser plassert i 2 ml hetteglass.
- Utfør avsorpsjon fra hver fiber plassert i en egen innsats ved å fullstendig senke belegget i desorpsjonsløsemiddelet, og deretter røre det i 120 min ved 1200 o/min ved hjelp av virvel.
- Etter 120 min (når desorpsjonen er fullført) fjern caps med prober.
- Klargjør QC-prøven ved å blande 10 μL-aliquots av hver prøve fra prøvesettet. Størrelsen på prøvesett avhenger av eksperimentell design. Det er viktig å analysere alle prøver som en batch.
- Lukk hetteglassene med nye hetter.
- Plasser hetteglassene i autosampleren (4 °C) på flytende kromatografi med høy oppløsning massespektrometer (LC-HRMS) og gå til trinn 5.
MERK: Randomiser injeksjonsrekkefølgen til prøvene, inkludert kontrollemed. Injiser QC-prøven etter hver 8-10 prøve for å overvåke instrumentets stabilitet.
5. Metabolomikk analyse ved hjelp av reversert fase flytende kromatografi og høyoppløselig massespektrometer (RPLC-HRMS analyse)
- Definer parameterne for LC-HRMS-analysen og positiv ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som brukes i den nåværende studien i positiv modus var som følger: skanneområde: m / z 80-1000; oppløsning 70 000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprøytespenning: 1,5 kV; RF-nivå med S-objektiv: 55%; S-linsespenning: 25 V; skimmer spenning: 15 V; kapillær temperatur: 300 °C; kappe gass: 40 a.u.; aux gass: 15 a.u.; aux gassvarmertemperatur: 300 °C. Denne kromatografiske metoden ble tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injeksjonsvolum: 10 μL. - Definer parameterne for LC-HRMS-analyse og negativ ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som brukes i den nåværende studien i negativ modus: skanneområde: m/z 80-1000; oppløsning 70 000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprøytespenning: 2,5 kV; RF-nivå med S-objektiv: 55%; S-linsespenning: -25 V; skimmer spenning: -15 V; kapillærtemperatur: 256 °C kappegass: 48 a.u; aux gass: 11 a.u.; aux gassvarmer temperatur: 413 °C. Denne kromatografiske metoden ble vedtatt fra Vuckovic et al.7. Injeksjonsvolum: 10 μL. - Kalibrer instrumentet som anbefalt av produsenten.
MERK: I den gjeldende studien ble instrumentet kalibrert ved hjelp av ekstern kalibrering hver 48. - Start analysen ved å klikke startknappen i programvaren som bruker instrumentet.
- Når analysen er fullført, erstatter du RPLC-kolonnen med HILIC-kolonnen, endrer mobilfasene og går til trinn 6.
6. Metabolomics analyse ved hjelp av hydrofil interaksjon flytende kromatografi og høyoppløselig massespektrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Definer parameterne for LC-HRMS-analysen og positiv ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som brukes i den nåværende studien i positiv modus var som følger: skanneområde: m / z 80-1000; oppløsning 70 000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprøytespenning: 1,5 kV; RF-nivå med S-objektiv: 55%; S-linsespenning: 25 V; skimmer spenning: 15 V; kappe gass: 60 a.u.; aux gass: 40 a.u.; aux gassvarmer temperatur: 425 °C; kapillærtemperatur: 325 °C. Kromatografisk metode ble tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injeksjonsvolum: 10 μL. - Definer parameterne for LC-HRMS-analyse og negativ ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som brukes i den nåværende studien i negativ modus var som følger: skanneområde: m / z 80-1000; oppløsning 70 000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprøytespenning: 1,3 kV; RF-nivå med S-objektiv: 55 %.; S-linsespenning: -25 V; skimmer spenning: -15 V; kapillær temperatur: 263 °C; kappe gass: 60 a.u.; aux gass: 30 a.u.; aux gassvarmertemperatur: 425 °C. Kromatografisk metode ble tilpasset fra Vuckovic et al.7. Injeksjonsvolum: 10 μL. - Kalibrer instrumentet som anbefalt av produsenten.
MERK: I den gjeldende studien ble instrumentet kalibrert ved hjelp av ekstern kalibrering hver 48. - Start analysen ved å klikke startknappen i programvaren som bruker instrumentet.
7. Prøveforberedelse for lipidomikkanalyse
MERK: Dette trinnet skal bare utføres når alle prøvene for eksperimentet er samlet inn.
- Før du starter analysen, klargjør desorpsjonsoppløsemiddelblanding: isopropanol:metanol 50:50 v/v.
- Ta ut hetteglassene som inneholder C18-fibrene dedikert til lipidomikkanalyse fra fryseren.
- Etikett hetteglass som skal brukes til desorpsjon.
- Pipette 200 μL av avsorpsjonsløsningen (tilberedt i trinn 7.1) for å forenklede glassinnsatser plassert i 2 ml hetteglass.
MERK: Ikke-silaniserte innsatser kan også brukes, men bruken kan føre til dårlig reproduserbarhet av forbindelser med høy logP, da slike forbindelser ikke spesifikt kan festes til glassvegger. - Utfør avsorpsjon fra hver fiber i en separat innsats ved å fullstendig senke belegget i desorpsjonsløsemiddelet, og deretter røre det i 60 min ved 1200 o/min ved hjelp av virvel.
- Etter 60 min når desorpsjon er fullført fjerne caps med sonder.
- Klargjør QC-prøven ved å blande 10 μL-aliquots av hver prøve fra prøvesettet. Størrelsen på prøvesett avhenger av eksperimentell design. Det er viktig å analysere alle prøver som en batch.
- Lukk hetteglassene med nye hetter.
- Plasser hetteglassene i autosampleren (4 °C) på flytende kromatografi med høy oppløsning massespektrometer (LC-HRMS) og gå til trinn 8.
8. Lipidomics analyse ved hjelp av reversert fase flytende kromatografi og høyoppløselig massespektrometri (RPLC-HRMS analyse)
- Definer parameterne for LC-HRMS-analysen og positiv ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som ble brukt i den nåværende studien i positiv ion-modus var som følger: skanneområde: m/z 100-1000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprayspenning: 3,5 kV, S-lens RF-nivå: 55%; S-linsespenning: 25 V; skimmer spenning: 15 V; kapillær temperatur 275 °C; kappe gass: 30 a.u.; aux gass: 10 a.u.; reservegass: 2 a.u.; probe varmeapparat temperatur 300 °C. LC parametere som brukes var: fase A: metanol: vann, 40:60 med 10 mM ammoniumacetat og 1 mM eddiksyre; fase B: isopropanol:metanol, 90:10 med 10mM ammoniumacetat og 1 mM eddiksyre.; gradienten: 0 min – 20% B; 1,0 min – 20% B; 1,5 min – 50% B; 7,5 min – 70% B; 13,0 min – 95% B; 17,0 min – 95% B; 17,1 min – 95,5 % B; 23.0 min – STOPP; C18 Kolonne, 3,5 μm, 2,1 mm x 75 mm; strømning: 0,2 ml/min; ovn temperatur: 55 °C; injeksjonsvolum: 10 μL. - Definer parameterne for LC-HRMS-analyse og negativ ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som ble brukt i den gjeldende studien var som følger: HRMS-parametere for negativ ionmodus: skanneområde: m/z 100-1000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); injisere tid til C-felle: auto; sprayspenning: 3,5 kV, S-lens RF-nivå: 55%; S-linsespenning: -25 V; skimmer spenning: -15 V; kapillær temperatur 275 °C; kappe gass: 30 a.u; aux gass: 10 a.u.; reservegass: 2 a.u; probe varmeapparat temperatur 300 °C. Kromatografisk metode: samme som i 8.1. - Kalibrer instrumentet som anbefalt av produsenten.
MERK: I den gjeldende studien ble instrumentet kalibrert ved hjelp av ekstern kalibrering hver 48. - Start analysen ved å klikke Start-knappen i programvaren som bruker instrumentet.
- Når analysen er fullført, erstatter du RPLC-kolonnen med HILIC-kolonnen, endrer mobilfasene og går til trinn 9.
9. Lipidomics analyse ved hjelp av hydrofil interaksjon flytende kromatografi og høyoppløselig massespektrometer (HILIC-HRMS analyse)
- Definer parameterne for LC-HRMS-analysen og positiv ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som ble brukt i den nåværende studien i positiv ion-modus var som følger: skanneområde: m/z 100-1000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); sprøytespenning: 1,5 kV; RF-nivå med S-objektiv: 55%; S-linsespenning: 25 V; skimmer spenning: 15 V; kapillær temperatur 325 °C; kappe gass: 60 a.u.; aux gass: 30 a.u.; reservegass: 2 a.u.; probe varmeapparat temperatur 320 °C. LC parametere som brukes var: fase A: 5 mM ammoniumacetat i vann; fase B: acetonitril; gradienten: 0 – 2min – 4% B; 15,0 – 20% B; 15,1 – 4% B, 21,0 min – STOPP; 3 μm 100 mm x 2,1 mm kolonne; strømning: 0,4 ml/min; ovn temperatur: 40 °C; injeksjonsvolum: 10 μL. - Definer parameterne for LC-HRMS-analyse og negativ ioniseringsmodus.
MERK: Parametrene som ble brukt i den nåværende studien i negativ ionmodus var som følger: skanneområde: m/z 80-1000; oppkjøpet utført ved hjelp av AGC (1,000,000 ioner); sprayspenning: 1,5 kV, S-lens RF-nivå: 55%; S-linsespenning: -25 V; skimmer spenning: -15 V; kapillær temperatur 320 °C; kappe gass: 50 a.u.; aux gass: 21 a.u.; reservegass: 3 a.u.; probe varmeapparat temperatur 320 °C. Den kromatografiske metoden var den samme som beskrevet i 9.1. - Kalibrer instrumentet som anbefalt av produsenten.
MERK: I den gjeldende studien ble instrumentet kalibrert ved hjelp av ekstern kalibrering hver 48. - Start analysen ved å klikke startknappen i programvaren som bruker instrumentet.
10. Databehandling og statistisk analyse
- Behandle data ved hjelp av programvare som er kompatibel med formatet på rådatafilene.
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av de behandlede dataene.
MERK: Testtypen avhenger av studiens vitenskapelige hypotese og design. I den nåværende studien ble hovedkomponentanalyse, delvis-minst kvadratdiskriminantanalyse og enveis ANOVA brukt.
Representative Results
Utnytte solid fase mikroektraksjon som en prøve forberedelse metode i kombinasjon med flytende kromatografi kombinert med høyoppløselig massespektrometri og en avansert databehandling programvare tillot oss å lykkes karakterisere metabolom og lipidome av menneskelige hjernesvulster. Sonden, hvis størrelse var ekvivalent med en akupunktur nål, forårsaket minimal skade på det studerte vevet og ingen vevforbruk, derfor muliggjør videre bruk av prøver for histologiske eller genetiske studier. Tilfredsstillende separasjon av de valgte gruppene ble oppnådd for både reversert fase og HILIC kolonner, og for både ionisering moduser i metabolomikk og lipidomics analyser. Bruken av begge separasjonsmetodene ikke bare i metabolomikk, men også i lipidomikkanalyse ga verdifulle komplementære data. Den reverserte fasekolonnen skiller lipider med hensyn til deres karbonkjedelengde og tilstedeværelsen av umettede bindinger, mens HILIC-kolonnen er nyttig for profilering av lipidgrupper, spesielt fosfolipider8.
Reproduserbarheten av instrumentalanalysen ble funnet å være svært god basert på den stramme klyngen av QC-prøver på hovedkomponentanalyseplottet (Figur 3A, de tre QC-prøvene injiserte hver åttende pasientprøve langs sekvensoverlappingen). Videre ble ekstraksjonsemed som brukes til negativ kontrollanalyse funnet å skille godt fra reelle prøver. Det brede spekteret av analytter ekstrahert av sondene lette oppdagelsen av representative arter, og dermed med hell åpner for differensiering mellom menneskelige hjernesvulster basert på deres histologiske opprinnelse, malignitet og andre faktorer (f.eks. genetisk). Figur 3B viser lipidomikkdata for prøver samlet inn fra pasienter med gliomer og meningiomer. Muliggjør differensiering mellom disse svulstene, som var preget av forskjellig histologisk opprinnelse og malignitet, var et viktig mål for studien, da meningiomer generelt betraktes som godartede svulster, mens gliomer er en av de mest ondartede. I figur 4 som presenterte metadata om metabolomikk, ble gliomer delt basert på deres grad av malignitet til høy og lav. Disse undergruppene ble sammenlignet med molekylær fenotype av meningiomer. I begge tilfeller ble det observert fremtredende separasjon av klynger. I dag er diagnostikk av gliom primært avhengig av å bestemme spesifikke genetiske mutasjoner i tumorprøver. Resultatene som ble oppnådd ble derfor sammenlignet med genotypingsdata. Figur 5A presenterer separasjon av prøvene med påvist samtidig sletting 1p19q og prøver der mutasjonen ikke ble observert.
Statistisk analyse tillater også valg av forbindelser i de studerte gruppene. Disse forbindelsene kan betraktes som potensielle biomarkører i tilfeller der en passende stor kohort er samplet. Imidlertid er mer grundig analyse, inkludert avgjørende bekreftelse av oppdagede forbindelser ved fragmentering og sammenligning av oppdagede arter med analytiske standarder, nødvendig for å trekke definitive konklusjoner av biologisk natur. Eksempler på slike diskriminantmetabolitter er presentert i figur 3C og figur 5B. Identiteten til disse forbindelsene, det vil si sphingomielyn: SM d36:1 og proline ble bekreftet ved å sammenligne fragmenteringsmønstrene til metabolittene fra prøven og autentiske standarder.
Figur 1: SPME-fibre forberedt for ekstraksjonsprosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekstraksjon av meningiom ved hjelp av SPME-prober. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PCA og boksplott for gliom og meningiom. Hovedkomponent analyse plott som inneholder (A) alle analyserte prøver inkludert blanks, ekstraksjon QC, blanks, meningiomer, gliomer; (B) som bare inneholder studerte grupper (etter utelukkelse av emner og QCer); (C) boks whisker plot for sphingomielyn: SM d36:1 differensiere pasient med gliom og meningioma. Lipidomikkdata. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: PCA for HGG, LGG og meningiom. Hovedkomponentanalyseplott som viser differensiering mellom (A) høygradig gliomer (HGG) og meningiomer (MEN)9 og(B) lavgradig gliomer (LGG) og meningiomer. Metabolomics data gjengitt fra Via Medica ref9 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: PCA og boksplott for gliom med og uten sletting. (A) Hovedkomponentanalyseplottet viste forskjeller hos pasienter med og uten samtidig sletting 1p19q; (B) boks whisker tomter for proline differensierte pasienter med og uten co-sletting 1p19q; n-uten sletting, y-med sletting. Metabolomics data Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Untargeted metabolomics og lipidomics er ofte brukt i studier fokusert på å identifisere tumor biomarkører. Men i de fleste tilfeller ser forskerne etter forbindelser som kan brukes til screening av sykdommen. Følgelig er de foretrukne biologiske prøvene blod eller urin på grunn av deres relativt enkel tilgang. Analyse av tumorvev utføres hovedsakelig for å forstå mekanismene bak sykdommen, karakterisere ulike tumortyper, etc. Analyse på stedet av tumorbiomarkører utføres sjelden, da slike applikasjoner krever omfattende prøveforberedelse. Alternativt tjener strategier basert på sanntidsanalyse av vevsprofiler uten forhåndsvalg av spesifikke biomarkører oppmerksomheten til det medisinske samfunnet3,4. Løsningen som presenteres her gir et annet perspektiv på vevsbehandling på stedet ved å avsløre hvilken type informasjon som kan oppnås via slike metoder.
Kombinasjonen av prøvetaking, prøveklargjøring og ekstraksjon gjør SPME et svært nyttig verktøy for analyse på stedet. Videre, mangel på vevforbruk under prøvetaking muliggjør videre bruk av de samme prøvene for biomarkør analyse og rutinemessige tester (genotyping, histologisk analyse), derfor legge til ny informasjon til resultatene av standard testing. Prøvetakingsenheten har en veldig enkel design, driften er veldig enkel, og ingen spesiell opplæring er nødvendig for å utføre selve utvinningen. Men å oppnå pålitelige resultater krever mye mer enn bare riktig håndtering av enheter. For å utføre eksperimentet riktig, må man forstå ekstraksjonsprosessen, arten av prøven, og være klar over potensielle feil som kan påvirke dataene.
Det er viktig å vurdere heterogeniteten av kreftvev10; samplede svulster kan inneholde deler som gjennomgår nekrose, forkalkning og hypoksi, og hver av disse prosessene vil bli reflektert i metabolom og lipidome oppnådd, og dermed påvirke resultatene. Derfor anbefales det at romlig oppløsning prøvetaking utføres ved innsetting av flere fibre i forskjellige deler av kreftvevet, eller alternativt at et lengre belegg brukes til å trenge inn i hele svulsten for å få gjennomsnittlig informasjon om svulsten. Hvis den romlige oppløsningsprøvetakingsmetoden utføres, kan fibrene alle desorberes til ett desorpsjonsløsningsmiddel; Dette ville ikke bare tillate oppnåelse av generell informasjon om svulsten, men også øke følsomheten til analysen. Alternativt vil desorpsjon av individuelle fibre i separate hetteglass gjøre det mulig for undersøkelser å finne ut det indre mangfoldet av hjernesvulsten, som består av kjernen bygget av kreftceller, og den ytre sonen, som er grensen til sunt vev. Dypere deler av svulsten er vanligvis mer skadet av prosessene knyttet til kreft11. Men, etterforskere må huske på at dette alternativet kompromisser metoden følsomhet og det totale antall påvisbare forbindelser. I det nåværende arbeidet ble det brukt et 7 mm belegg; denne lengden ble ansett som optimal for ulike størrelser av svulster inkludert i studien. Belegget trengte inn i svulstene, og ga dermed ikke-spesiell oppløsning, men gjennomsnittlig data på tvers av prøven. Uavhengig av protokollen som er valgt, er det viktig at den samme protokollen følges under hele studien, inkludert antall fibre som brukes til individuell prøvetaking, lengden på belegget, ekstraksjonstiden og alle andre faktorer som er avgrenset i dette arbeidet.
Det er viktig å kontrollere kvaliteten på analysen. Den samlede QC (se trinn 4.7 og 7.7 i protokollen) bør være forberedt og brukes til overvåking instrumentstabilitet under kjøring av hele prøvegruppen. De tomme kontrollene (se trinn 2.8) kan senere brukes til å utarbeide en "ekskluderingsliste" for å eliminere signaler om forurensninger som stammer fra løsemidler eller fiberproduksjon. Ved spesielle anledninger, for eksempel fare for forurensning, er det nødvendig å utføre prøvetaking fra hansker, bord, apparater eller andre overflater som kan utgjøre en forurensningsrisiko. I slike tilfeller er fiberforberedelse, utvinningstid og desorpsjonsprotokoller de samme som for prøvene.
Metabolomiske og lipidomiske analyser er fokusert utelukkende på små molekyler (mindre enn 1500 Da) som vises i en organisme eller spesifikke komponenter i organismen, for eksempel spesifikke organer, vev, væsker, celler, etc. Metabolomiske og lipidomikk gir et øyeblikksbilde av biokjemiske endringer som forekommer i kroppen, og når det gjelder kreft, integrerer de informasjon relatert til genomet, histologien og maligniteten av svulsten. Disse omics vitenskaper skape en sammenheng mellom fysiologi og fenotype som metabolitter er høyere opp i biokjemisk stigen enn proteiner ellergener 12. Ved å forstå metabolom og lipidome av kreftsvulster, kommer vi nærmere å oppdage fenotypen blant alle -omics vitenskaper som disse grenene av studien tilbyr mer inngående kunnskap om dynamiske endringer av molekyler som et svar på levende organismer til ulike stimuli. Som presentert i dette arbeidet, tilsvarer dataene som er oppnådd i ett utvalg, kreftens histologi, dens grad av malignitet, og det gjenspeiler endringer som skjer på genomnivå. I gliomer, som den type kreft av interesse i denne studien, er informasjonen skjult i genomet spesielt viktig, da en personlig behandling utvikles basert på resultatene av genetiske tester. Spesielle mutasjoner er prognostiske markører for utfallet av kjemo- eller strålebehandling. Som demonstrert her, er valg av biomarkører som gjenspeiler en gitt mutasjon mulig med den foreslåtte strategien. Mutasjonsmarkører, samt flere beskrivelsestyper som de som indikerer graden av malignitet av svulsten, kan også brukes til å støtte rutinemessige diagnostiske metoder.
Ex vivo kjemisk biopsi ved bruk av solid fase mikroektraksjonsfibre er det første trinnet i anvendelsen av metoden til intraoperativ diagnostikk. Metoden kan enkelt vedtas for in vivo prøvetaking i påvente av tillatelse fra aktuelle etiske styrene. I slike tilfeller må sterilisering av SPME-enheter utføres i henhold til de aksepterte steriliseringsprosedyrene på sykehuset der prøvetaking skal utføres, det vil si autoklavering eller etylenoksidsterilisering. De pre-conditioned og steriliserte fibrene må oppbevares i forseglede pakker merket med en sterilisering utløpsdato. Det er viktig å merke seg at fibre ikke bør rengjøres ved bruk av overflateaktive stoffer. En slik prosedyre kan forårsake uspesifiserte endringer i sorbent sammensetning, og dermed påvirke utvinning av analytter. I studiene som er beskrevet her, ble det brukt en 30 min ekstraksjonsperiode, men andre rapporter bekrefter at kortere tider kan gi tilfredsstillende resultater i in vivo-studier 13. Huq et al. viste at analytisk likevektstid oppnås raskere i vev, som en kompleks matrise, enn i enkle matriser14. Reproduserbarheten av de oppnådde resultatene kan imidlertid kompromitteres under kortere ekstraksjonsperioder etter hvert som flere analytter vil bli ekstrahert under pre-likevektsforhold; Derfor må nøyaktig tidskontroll implementeres.
Begge omics vitenskaper utnyttet som en del av dette arbeidet har utmerket potensial som biomarkør oppdagelse verktøy. Når biomarkører er valgt eller en kjemometrisk modell er etablert, kan medisinsk diagnostikk basert på bestemmelse av målmetabolitter via metoder som gjelder for undersøkelser på stedet, for eksempel SPME-tilnærmingen som er beskrevet i dette arbeidet, utvikles og implementeres som en del av rutinemessig diagnostikk.
Protokollen som foreslås i det nåværende manuskriptet beskriver hvordan man utfører ikke-målrettede metabolomiske og lipidomiske analyser av kreftvev ved hjelp av solid fasemikrokstraksjon for screening av potensielle biomarkører. Den er utformet for å muliggjøre utvinning av representative forbindelser, differensiering av svulster, og identifisering av diskriminerende forbindelser som karakteriserer en gitt kreft det vil si potensielle biomarkører. De ikke-målrettede analysene med SPME beskrevet i denne artikkelen representerer et utgangspunkt i utviklingen av rask intraoperativ diagnostikk, hvor et valgt panel av forbindelser kan bestemmes uten nødvendighet for screening av alle forbindelser som finnes i prøven. Av hensyn til raske diagnostiske resultater kan SPME-sonder som brukes til ekstraksjon på stedet, kobles direkte til analytisk instrumentering i sykehusanlegget. Enkle ekstraksjoner utført med minimum prøveforberedelse etterfulgt av kromatografifri analyse vil betydelig forkorte total tid fra timer til noen få minutter, som allerede beskrevet for narkotikaovervåking15.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av grant Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 fra National Science Centre. Forfatterne ønsker å anerkjenne MilliporeSigma, en bedrift av Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland, for å gi SPME-enhetene som brukes i dette arbeidet. Life Science-virksomheten til Merck opererer som MilliporeSigma i USA og Canada. Også forfatterne ønsker å takke Thermo Fisher Scientific for tilgang til Q-Exactive Focus orbitrap massespektrometer.
Forfatternes bidrag: JB: optimalisering av prøveforberedelse og LC-MS-parametere, ytelse av SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datatolkning og manuskriptforberedelse relatert til lipidomikkdel; PZG: koordinering og ytelse av de fleste prøvetakinger på sykehus, optimalisering av prøvetakings- og prøveforberedelsesparametere, utførelse av SPME-LC-MS-eksperimenter, dataanalyse, statistisk analyse og datatolkning, manuskriptforberedelse relatert til metabolomikkdel; MG – hjelp til optimalisering av prøveforberedelse, LC-MS-metode og dataanalyse relatert til lipidomikk del; KG: co-ytelse av SPME prøvetakinger og optimalisering av prøvetaking og prøve forberedelse, SPME-LC-MS analyse knyttet til metabolomics del; KC: ytelse av flere SPME-prøvetakinger på sykehus, assistanse i optimalisering av prøvetaking, prøveklargjøring og dataanalyse relatert til metabolomikkdel; KJ: ytelse av flere SPME prøvetakinger på sykehus, hjelp i lipidomics analyse; DP: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, rekruttering av pasientene; JF: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, rekruttering av pasientene; MH: utførelsen av kirurgiske prosedyrer, koordinering av klinisk del av forskningen; BB: konsept, koordinering tilsyn av prosjektet og manuskript forberedelse, utførelse av flere prøvetakinger
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
| ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
| caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
| Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
| formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
| glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
| glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
| glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
| glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
| glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
| isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
| LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
| Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
| methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
| Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
| SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
| SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
| SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
| water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9x5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Bi, W. L., Beroukhim, R. Beating the odds: extreme long-term survival with glioblastoma. Neuro Oncology. 16 (9), 1159-1160 (2014).
- Ifa, D. R., Eberlin, L. S. Ambient Ionization Mass Spectrometry for Cancer Diagnosis and Surgical Margin Evaluation. Clinical Chemistry. 62, 111-123 (2016).
- Alexander, J., et al. A novel methodology for in vivo endoscopic phenotyping of colorectal cancer based on real-time analysis of the mucosal lipidome: a prospective observational study of the iKnife. Surgical Endoscopy. 31 (3), 1361-1370 (2017).
- Reyes-Garcés, N., et al. Advances in Solid Phase Microextraction and Perspective on Future Directions. Analytical Chemistry. 90, 302-360 (2018).
- Pawliszyn, J. Handbook of Solid Phase Microextraction. , Chemical Industry Press. Beijing. (2009).
- Vuckovic, D., Pawliszyn, J. Systematic Evaluation of Solid-Phase Microextraction Coatings for Untargeted Metabolomic Profiling of Biological Fluids by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 83, 1944-1954 (2011).
- Cajka, T., Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 61, 192-206 (2014).
- Goryńska, P. Z., et al. A new strategy for brain tumour metabolomic analysis. Medical Research Journal. 3 (1), 15-22 (2018).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Fernandes, M., Rosel, D., Brábek, J. Translation in solid cancer: are size-based response criteria an anachronism. Clinical Translational Oncology. 17 (1), 1-10 (2015).
- Lämmerhofer, M., Weckwerth, W. Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data. , Wiley-VCH. (2013).
- Lendor, S., et al. Solid Phase Microextraction- Based Miniaturized Probe and Protocol for Extraction of Neurotransmitters from Brains in Vivo. Analytical Chemistry. 91 (7), 4896-4905 (2019).
- Huq, M., Tascon, M., Nazdrajic, E., Roszkowska, A., Pawliszyn, J. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Analytical Chemistry. 91 (12), 7719-7728 (2019).
- Looby, N., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
